Murine Fetal Ekkokardiografi

Summary

Foster og perinatal død er en vanlig funksjon når en skal studere genetiske forandringer som påvirker hjerte utvikling. Høyfrekvente ultralyd har forbedret 2-D oppløsning og kan gi god informasjon om tidlig hjerte utvikling og er en ideell metode for å oppdage innvirkning på hjerte-struktur og funksjon før dødsfallet.

Abstract

Transgene mus viser avvik i hjertets utvikling og funksjon representerer et kraftig verktøy for å forstå de molekylære mekanismene bak både normal hjertefunksjon og patofysiologiske grunnlaget for menneskets hjerte-og karsykdommer. Foster og perinatal død er en vanlig funksjon når en skal studere genetiske forandringer som påvirker hjerte utvikling ^1-3. For å studere rollen til genetiske eller farmakologisk endringer i den tidlige utviklingen av hjertefunksjon, har ultralyd avbildning av levende foster blitt et viktig verktøy for tidlig anerkjennelse av misdannelser og langsgående oppfølging. Noninvasive ultralyd er en ideell metode for å oppdage og studere medfødte misdannelser og innvirkning på hjertefunksjonen før dødsfallet ^4. Den lar tidlig anerkjennelse av celleforandringer i levende foster og progresjon av sykdommen kan følges i utero med longitudinelle studier ^5,6.Inntil nylig avbildning av fosterets mus hjerter ofte involvert invasive metoder. Fosteret måtte ofres for å utføre magnetisk resonans mikroskopi og elektronmikroskopi eller kirurgisk levert til transillumination mikroskopi. En anvendelse av høyfrekvente prober med konvensjonelle 2-D og pulserende-bølge Doppler har vist seg å gi målinger av hjerte sammentrekning og hjerte priser under embryonal utvikling med databaser over normale utviklingsmessige endringer nå tilgjengelig ^6-10. M-mode avbildning gir ytterligere viktige funksjonelle data, selv om de riktige bildebehandling flyene er ofte vanskelig å skaffe. Høyfrekvente ultralyd av fosteret har forbedret 2-D oppløsning og kan gi god informasjon om den tidlige utviklingen av hjerte strukturer ^11.

Protocol

1. Forbereder Mus for bildebehandling

1. Forut for avbildning studie, anesthetize demningen (2-3% isofluran) i induksjon kammeret. Fjern dyret fra induksjon kammeret og umiddelbart plassere snuten innenfor nesen membran koblet til anestesi systemet. Fjern pels fra midten brystet nivå til underekstremitetene (se figur 1) med hårklippere. Fjern de resterende kroppshår med Hårfjerningskrem. Hårfjerningskrem kan også brukes uten hårklippere, og bør være grundig skylles av huden etter bruk for å unngå irritasjon.
2. Plasser bedøvet musen i ryggleie på en varmepute med innebygd EKG leder for å opprettholde kroppstemperatur (figur 1). Påfør elektrodegel på fire poter og tape dem til EKG-elektroder.
3. Få tak i en steady-state sedasjon nivå gjennom hele prosedyren (1,0% til 1,5% isofluran blandet med 100% O _2). Nivået av anestesi kan justeres til maintain et mål hjertefrekvens på 450 ± 50 slag pr min (bpm). Nøye oppmerksomhet bør rettes for å minimere dosering av isofluran og varighet av sedasjon til mindre enn én time.
4. Forsiktig inn en rektal probe (etter smøring) for å overvåke kroppstemperaturen via varmeputen. Det er viktig å opprettholde kroppens temperatur innenfor et smalt område (37,0 ° C ± 0,5 ° C). Kontrollert bedøvende og konstant kroppstemperatur er viktig for hemodynamiske stabilitet av mor og fostre.

Tekniske hensyn

Oppkjøpet av fosterets echocardiograms kan være utfordrende. Data fra disse studiene kan forvirret på grunn av responsen på stress fra både dammen og fosteret. Ideelt sett bør dyret temperaturen opprettholdes ved hjelp av et oppvarmet bildebehandling plattform, sirkulerende oppvarming pad, varmelamper eller autoregulated oppvarming tepper. I tillegg, er rutinemessig bruk av en oppvarmet akustisk gel anbefales. Alskjønt den dominerende bekymring kroppstemperatur kontroll er å unngå nedkjøling bør utviklingen av hypertermi være av lik bekymring. En uovervåket varmeapparater for eksempel en enkel varmeputen eller tilstedeværelse av nærhet til halogen belysning kan resultere i rask og farlig heving av kroppstemperatur. Da vesentlige kroppstemperatur svingninger i begge retninger plasserer dyret i fare, bør alle forsøk gjøres for å opprettholde normal kroppstemperatur.

Den sonographer anskaffe bildene må unngå å plassere stort trykk på hulrommet med transduseren, siden vekten av svingeren alene kan resultere i endrede hjertefunksjon. Varigheten av bildeopptak må også holdes på et minimum (ideelt mindre enn en time), for å redusere de fysiologisk og hemodynamiske endringer som følge av forlenget sedasjon. I tillegg må lengden av tid og eksponering for isofluran for hver studie holdes på et minimumm på grunn av potensielle teratogene effekter av isofluran ^12.

2. Identifisering av embryo

1. Imaging startes med morens blæren som et landemerke, med fostre på venstre og høyre livmor horn merket som L1, 2,3, et cetera (venstre side) og R1, 2,3, et cetera (høyre side) (se Figur 1C). Notasjon av fosteret plassering er nyttig for henting av prøver etter bildebehandling.
2. Prøver som ligger for dypt i magen er skannet for å dokumentere sin tilstedeværelse, men er ekskludert fra dataanalysen på grunn av dårlig oppløsning. Muligheten til å skanne tilstøtende embryoer kan hjelpe i sporing fostre (figur 2A).
3. Scan flyene modifiseres ved endring av orienteringen av musen med hensyn til skanneplan. Bilder blir oppnådd i to ortogonale plan til hver fosteret (figur 2). En innsats er gjort for å innhente synspunkter tilnærmet de tverrgående, frontal, eller sagittal plan, men sometimes er begrenset til skrå plan ved posisjonen av livmoren i buken. Rotasjon av skanning hodet vil også gi rom for endring av orientering uten å flytte demningen.

Tekniske hensyn

Mens håndholdt betjening av sonden er gjennomførbart i voksen mus ekkokardiografi, håndholdte drift i fosterets bildebehandling i anbefales ikke. Identifisering av fostre er komplisert av det variable natur livmor beliggenhet, tortuosity, og bevegelse. Å minimalisere problemer med fosteret lokalisering, er stasjonært transduser bruk (figur 1) med minimal bevegelse utover horisontalplan demningen avgjørende.

3. Evaluering av struktur og funksjon

1. Skanning B-mode bildene brukes til å identifisere grunnleggende kardiale strukturer som atriene, interventricular septum, ventrikulære kamre, og venstre og høyre utstrømnings urinveier (figur 2).
2. M-mode bildes er oppnådd fra den korte aksen visningen og brukes til å måle ventrikulær veggtykkelse og kammer dimensjoner (Figur 3). Hvis riktig justering ikke kan fremskaffes på grunn fosterets løgn, kan målinger fra b-mode bilder brukes til å kvantifisere% fractional forkorte (FS). Tidsmessige endringer mellom LV ende-systolisk dimensjon (LVESD) og LV ende-diastolisk dimensjon (LVEDD) gjennom hjertets syklus brukes for beregning av forkortingsfraksjon (FS), som følger:
   % FS = [(LVEDD - LVESD) / LVEDD] x 100
3. Venstre og høyre ventrikkel identifiseres ved å skanne fra hode til hale. Venstre og høyre side bør noteres. Synlige flyt strømmer generert av echogenic fosterets blod forenkler nøyaktig plassering av Doppler prøvevolum i mitral åpningen. Venstre ventrikkel tilsig hastighet er hentet fra mitral ventiler i apikale fire-kammer og LV lange aksen visninger (figur 4, C). Aorta utløpspunkter målinger kan brukes til å måle systolic utstøting tid (figur 4, D). Hjertefrekvens kan beregnes ut fra måling av en strømning syklus til følgende flyt syklus (Figur 4, C og D). Forsiktighet bør tas for å justere blodstrømmen og Doppler strålen for å minimere Doppler vinkel. Verdier som tas utenfor en vinkel på 60 grader er unøyaktig og bør unngås.
4. Skanning b-mode bilder brukes til å identifisere felles strukturelle medfødte misdannelser som ventrikkelseptumdefekter (figur 5). Doppler prøvevolum innenfor ventriklene kan brukes til å identifisere Vannstrømmen over ventrikulær septum. Flere parametere som er lett overvåket inkluderer fosterets størrelse, hjerte priser, strømningshastigheter, perikardiale effusjoner, og føtal hydrops. Den definitive diagnosen spesifikke kardiale defekter krever ekstra evaluering av obduksjon og histopatologi.

Tekniske hensyn

Identifikasjon av venstre og høyre chammedlemmer kan være vanskelig i fosterets hjerte bildebehandling grunn av lignende dimensjoner ventrikulære kamre under utvikling. En strategi er å etablere høyre og venstre føtal orientering i sanntid ved å flytte tenkelig plattformen i horisontalplanet. Identifisering av snute, lem knopper, og ryggraden vil hjelpe med å identifisere let / høyre orientering av fosteret. Hvis mulig, vil sporing av utløpskanalen sporet til buen eller visualisering av den viktigste bifurkasjon av lungearterien tillate identifisering av venstre ventrikkels utløp eller høyre utstrømning tarmkanalen henholdsvis. For hver fosteret studert, er det viktig å merke seg den bestemte venstre-høyre orientering på lagrede bilder.

Post-imaging Animal Overvåking og omsorgsdepartementet

Etter gjennomføringen av bildebehandling er demningen returnert til hensiktsmessig husvære og overvåkes i henhold til standard institusjonelle etter prosedyren protokollen.Analgesi følger denne imaging prosedyre er ikke nødvendig. Full gjenopptakelse av normal aktivitet kan forventes i løpet av fem minutter.

4. Representative Resultater av Fetal Ekkokardiografi

Utviklingen av høyfrekvente prober (over 8 MHz), har tillatt kommersielt ekkokardiografisk utstyr å ha en aksial oppløsning på omtrent 0,2 mm med en lateral oppløsning på 0,3 mm når bildet zoomet og ervervet på en dybde av 1 cm. De fleste av de nylig utviklede svingere er lineær som har fordelen av å unngå nær feltet artefakter. Høy frekvens (30-50 MHz) mekaniske prober har nylig blitt utviklet som er tilstrekkelig for murine brystet og hjertefrekvens, slik at en aksial oppløsning på ca 50 mikrometer på en dybde av 5-12 mm. Nå nylig har disse høyfrekvente mekaniske prober lagt farge Doppler evner slik at en fullstendig evaluering av ventrikulære og valvulær funksjon og identifisering av sJakten lesjoner i fosterets hjerte. Metodene beskrevet her er utført på en VisualSonics Vevo 770-systemet og kan brukes til nesten alle tilsvarende systemer. Gjeldende kommersielt tilgjengelig ultra-høy frekvens ultralyd systemet kan operere på 40 Hz med maksimal avbildning dybde på 7 til 14 mm, med opp til 60 mm lateral og 50 til 100 mm aksial oppløsning (Vevo770, VisualSonics, Inc.). Dette kan sammenlignes med 60 Hz og 20 mm bildebehandling dybde, med 50 til 100 mm aksial og 200 til 500 mm lateral oppløsning med den kliniske Acuson Sequoia ultralydsystemet.

Gitt den lille størrelsen av fosterets mus hjerte, er føtale ekkokardiografi hos mus teknisk utfordrende. I motsetning til ekkokardiografi hos voksne mus, må sonographer bruke ikke-konvensjonelle ultralyd flyene definert av fosterets kropp akser. Tortuosity av livmoren påvirker også retningen på fosteret og må tas hensyn til. Tillegg, den iboende begrensning i inntrengningsdybde av ultren høy frekvens ultralyd kan gjøre det vanskelig å image alle prøvene i svangerskap med et stort antall fostre.

En ultralyd strategi gir høy gjennomstrømning screening for medfødte kardiovaskulære og ekstrakardiale defekter ^7. Utover studiet av genetiske forandringer, kan denne teknikken brukes til å screene for defekter i farmakologiske og toksikologiske studier. Denne metodikken kan også brukes som et styringsverktøy for intervensjonsprosedyrer som injeksjoner eller måling av ventrikulære presset ^13.

Noninvasive natur fosterets ultralyd er fordelaktig, ikke bare fordi den muliggjør kardiovaskulær funksjon skal vurderes under fysiologiske betingelser, men også fordi denne gir viktig fenotypisk informasjon i sann tid. Langsgående undersøkelse av embryonale hjerter, men det er teknisk mulig, gjenstår utfordrende for flere grunner. Serial undersøkelse av samme fosteret og identification av samme fosteret ved hver undersøkelse er utfordrende i fravær av en tydelig strukturell defekt. Bevegelse av livmoren og fosteret kan helt endre retningen på prøven og dermed gjøre langsgående sporing og oppfølging målinger vanskelige ^14.

Selv ekkokardiografi er en kraftfull teknikk for identifisering av hjertefeil, krever spesifikk diagnose av strukturelle hjertefeil ytterligere detaljert fenotyping av obduksjon og histopatologi ^15. Korrelasjon av genotype og en bestemt foster krever høsting fostre med hysterotomy, fortrinnsvis umiddelbart etter et ekko studie og mens demningen er fortsatt bedøvet å minimere endringer i orientering og embryo plassering.

Normale verdier for kammer dimensjoner og funksjon har vært rapportert for embryonale mus og brukere av denne teknikken rådes til å gjennomgå referanser sitert for disse verdiene ^6-10. Assessmentav valvulær morfologi er begrenset av bildeoppløsning, men er ringformede dimensjons målinger og hastighet målinger gjennom de store fartøyene mulig selv så tidlig som ED 9,5. Care må tas for å oppnå tilstrekkelig innretting med blodstrømmen og svingeren ^{10, 16.}

Det bør understrekes at hjerte dimensjoner varierer med mus stammer, kjønn og alder, og raskt endre på ulike embryonale tidspunkter og hjerte priser. Det er viktig å kontrollere at grupper av mus er matchet for disse parametrene. Fosterets bildebehandling varierer etter mus belastning i tillegg. For eksempel inneholder den gravide CD-en dam rutinemessig flere embryoer sammenlignet med C57/BL6 belastning og dermed kan være mer vanskelig å visualisere alle prøver. Av disse grunner, bruk av alder og siles matchet kontroller for hvert eksperiment bør brukes istedenfor referanseverdier. I tillegg, målinger av individuelle parametre som venstre ventrikkel endediastolisk dimensjon og posteriorveggtykkelse kan variere i normale mus opp til 25% ^8.

Figur 1. Oversikt over oppsett med VisualSonics Vevo 770-systemet. (A) VisualSonics integrert rail system med fysiologisk overvåkningsenhet. (B) Musen er plassert og riktig tilbakeholdenhet på oppvarming bord. De fire lemmer er teipet inn EKG-elektrodene. (C) Skjematisk av gravide mus og layout av embryoer. Antallet embryoer innenfor hvert horn av livmoren kan variere betydelig, i tillegg til retningen på fosteret. (D) En posisjonert dam på avbildning plattformen med piler opplyse flyene av manipulering (X-aksen og Y-aksen) for å flytte demningen for bildebehandling. Z-aksen viser til bevegelsen av transduseren oppover og nedover (som vist med pilen i panel B). B, blære, L, venstre, R, right.

Figur 2. Representative b-mode bilder. Dette tallet inneholder representative b-mode bilder av embryonale dag 14,5 fosteret. (A) Visualisering av to nabokommunene fostre. Boksene indikerer plasseringen av fosterets hjerte. (B) Anatomiske landemerker i et foster å veilede orientering. Embryonic dag 14,5 hjerte i en fire-kammer visning (C), kort-aksen visning av venstre og høyre ventrikkel (D), høyre ventrikkel utløp og lungearterien (PA) (E), og venstre ventrikkel utstrømning takt (LVOT) og aorta (F).

Figur 3. Representant vurdering av ventrikkelfunksjon. Denne figuren inneholder representantbilder av 2D ekkokardiografi av den lange aksen visningen av hjertet ved embryonale dag 14,5 (A), og en fire-kammer visning (B). (C) M-modus tracing med linjer som angir venstre og høyre ventrikkel innerdiameter ved diastole (R / LVIDd) og systole (R / LVIDs) fra fire kammer bildeplan. Septum (IVS) er også visualisert.

Figur 4. Representant Doppler vurdering. Denne figuren inneholder representative bilder av 2D ekkokardiografi av embryonale dag 14,5 hjerte i en apikal fire kammer visning (A). Venstre atrium og venstre ventrikkel hulrom er skissert. (B) representant plassering av Pulse bølge Doppler prøvevolum for opptak av mitral tilsiget. (C) Mitral tilsig Doppler mønstre som tidlig diastolisk velocity (betegnet "E") og atriekontraksjonen (betegnet "A") hastigheter kan måles. (D) representant aorta Doppler bølgeform. Aorta Doppler jet kan brukes til å måle utstøting tid (ET). Hjertefrekvensen (HR) kan beregnes ut fra måling av en strømning syklus til følgende flyt syklus. Klikk her for å vise større figur .

Figur 5. Representative påvisning av Ventrikkelseptumdefekt. Denne figuren inneholder representative b-mode bilder av embryonale dag 14,5 hjerte i en apikal fire kammer visning (A) med høyre og venstre ventrikkel hulrom skissert i (B). Merke til tilstedeværelsen av interventricular septum. (C) tverrsnitt for bildebehandlet hjerte farget med hematoxylin og eosin.(D) B-mode bilde av embryonale dag 14,5 hjerte med en ventrikulær sepal defekt (VSD) pilen viser. (E) Høyre og venstre ventrikulære hulrom er skissert med overlagret plassering av Pulse bølge Doppler prøvevolum for opptak av flyt på tvers av interventricular septum. (F) tverrsnitt farget med hematoxylin og eosin for bildebehandlet hjerte etter at prøven henting. (G) overlagret plassering av Pulse bølge Doppler prøvevolum for opptak av flyt over interventricular septum. (H) Representant Doppler tracing fra (G) demonstrere flyt fra venstre til høyre ventrikkel. Klikk her for å se større figur .

Discussion

Evnen til å utføre serielle målinger og å oppdage mutant fostre med kardiale defekter fremhever nytten av ekkokardiografi for å undersøke normale og unormale hjerte utvikling. Analyse av hjertefunksjonen struktur og funksjon in vivo har blitt en integrert del i beskrivelsen av genetiske og ikke-genetiske modifikasjoner normal fosterutvikling. Tilgjengeligheten av 2D-guided Doppler gjør det mulig å overvåke puls og blodstrøm mønstre mens skaffe real-time bilder. Utviklingsmessige hjertefeil som ventrikkelseptumdefekter kan være til stede og synlig. Til tross for høy oppløsning egenskapene dagens bildebehandling plattformer, fortsetter oppkjøpet av peak utstrømnings hastigheter å være vanskelig, som mangel på farge flyt Doppler på de fleste systemer som gjør det vanskelig å justere Doppler prøvevolum med høy oppløsning 2D-bilder. I tillegg kan fosterstilling innenfor uterine horn hinderalle målinger eller produserer suboptimal bildebehandling. Den store begrensning av ultralydavbildning skanner dybde som begrenser muligheten for å visualisere alle embryoer fra en enkelt dam. Samme embryoet vil skifte i posisjon innenfor mors mage, og dermed komplisere langsgående sporing av samme fosteret. Til tross for disse begrensningene, kan dette ikke-invasiv teknikk være uvurderlig for å overvåke fysiologisk tilstand av befruktede egg innen et kull og å oppdage og overvåke disse embryoer der hjertefeil kan forventes.

Nye teknologier

Den VisualSonics Vevo 2100 system, den nyeste ultralyd systemet, har faset lineær array transdusere utstyrt for farge flow imaging, og dermed gjør det mulig å gi farge Doppler evner selv i embryoer på E10.5-11.5. Dette systemet har også speckle tracking alternativer som kan gi detaljert regional myokardial funksjon for å utvikle fosterets myokard ^17. Speckle sporingavbildning basert på vevet deformasjon og gir en annen grad av hjertets kontraktilitet og regional myokardial funksjon. Det grunnleggende prinsippet om speckle sporing er at ultralyd refleksjoner skaper en uregelmessig speckle mønster som er unikt for hver hjerteinfarkt segment. Disse segmentene kan deretter spores gjennom hjertets syklus og brukes til å beregne vev fortrengning, regional hastighet, belastning, og tøyning langs radiale, langsgående og omkrets fly av hjertet. Utover ultralyd, er nye modaliteter som optisk koherens tomografi (OCT), mikro-CT, og mikro-MR, blir brukt til fosterets bildebehandling og vil trolig tilby avanserte høy oppløsning gratis til høy oppløsning ekkokardiografi ^17.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo 770 Imaging System (Toronto, Canada)	VisualSonics
MHz transducer		RMV707B15-45
Isoflurane Vaporizer	Tec 3
Isoflurane			2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane