Мышиные эхокардиография плода

Summary

Плода и перинатальной смертности является общей особенностью при изучении генетических изменений, влияющих сердечной развития. Высокочастотный ультразвуковой визуализации улучшились 2-D разрешение и может обеспечить отличную информацию о раннем развитии сердечной и является идеальным методом для определения воздействия на структуры и функции сердца до смерти.

Abstract

Трансгенные мыши, отображение отклонения в сердечной развития и функционирования представляет собой мощный инструмент для понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе обоих нормальные функции сердечно-сосудистой и патофизиологические основы человеческого сердечно-сосудистых заболеваний. Плода и перинатальной смертности является общей особенностью при изучении генетических изменений, влияющих развития сердца ^1-3. С целью изучения роли генетических и фармакологических изменений в раннем развитии сердечной функции, ультразвуковое исследование живой плод стал важным инструментом для раннего распознавания аномалий и продольные наблюдения. Неинвазивной визуализации ультразвуковых является идеальным методом для обнаружения и изучения врожденных пороков развития и влияния на функцию сердца до смерти ^4. Это позволяет раннее выявление аномалий у плода жизни и прогрессирования болезни может сопровождаться внутриутробно продольные исследования ^5,6.До недавнего времени, визуализации сердца плода мыши часто вовлечены инвазивных методов. Плод был быть принесен в жертву для выполнения магнитного резонанса микроскопии и электронной микроскопии или хирургическим путем доставлены для просвечивания микроскопии. Применение высокочастотных датчиков с обычным 2-D и импульсно-волнового допплера было показано, обеспечивает измерение сердечных сокращений и частоты сердечных сокращений во время эмбрионального развития с базами данных нормального развития изменений теперь доступна ^6-10. M-режиме также предусматривает важные функциональные данные, хотя, собственно самолетов изображений часто трудно получить. Высокочастотный ультразвуковой визуализации плода улучшилась 2-D разрешение и может обеспечить отличную информацию о ранних стадиях развития сердечных структур ^11.

Protocol

1. Подготовка мыши для работы с изображениями

1. До изображений исследования, анестезию плотины (2-3% изофлурана) в индукционной камере. Снимите животных от индукции камеру и сразу же поместить мордой в носовой конус подключен к системе анестезии. Удалить мех с середины уровне груди, чтобы нижние конечности (см. рисунок 1) с машинки для стрижки волос. Удалите оставшиеся волос на теле с кремом для удаления волос. Крем для удаления волос также может быть использована без машинки для стрижки волос, и должна быть тщательно смывают кожи после использования, чтобы предотвратить раздражение.
2. Положите под наркозом мыши в положении лежа на грелку со встроенным ЭКГ для того, чтобы поддерживать температуру тела (рис. 1). Нанесите гель для электродов четырех лапах и лентой, чтобы они ЭКГ электродов.
3. Получить стационарного уровня седации в течение всей процедуры (1,0% до 1,5% изофлурана смешивают со 100% O _2). Уровень анестезии может быть настроен на мAINTAIN частоты пульса от 450 ± 50 ударов в минуту (BPM). Особое внимание должно быть уделено минимизации дозу изофлурана и продолжительность седации до менее чем одного часа.
4. Аккуратно вставьте ректального датчика (после смазочных) для контроля температуры тела с помощью грелки. Это важно для поддержания температуры тела в пределах узкого диапазона (37,0 ° C ± 0,5 ° C). Контролируемая анестезии и постоянной температуры тела имеет важное значение для стабильности гемодинамики матери и плода.

Технические соображения

Приобретение плода эхокардиографии может быть сложной задачей. Данные, полученные в результате этих исследований можно смешивать в связи с реакцией на стресс и от плотины и плода. В идеале, животное температура должна поддерживаться использованием подогревом платформы изображений, циркулирующих потепление площадку, нагревательные лампы или Авторегулируемый одеяла отопления. Кроме того, регулярное использование нагретого гель акустических рекомендуется. Alхотя преобладает озабоченность по поводу контроля температуры тела, чтобы избежать переохлаждения, развитие гипертермии должны быть одинаковой проблемой. Неконтролируемого нагревательных приборов, таких как простые грелку или наличия непосредственной близости от галогенных освещения может привести к быстрой и опасной высоте температуры тела. Поскольку существенные колебания температуры тела в любом направлении ставит животное риску, каждая попытка должна быть сделана для поддержания нормальной температуры тела.

УЗИ приобретения изображений необходимо избегать размещения чрезмерное давление на полость датчика, так как вес датчик сам по себе может привести к изменению сердечной функции. Срок получения изображения также должно быть сведено к минимуму (в идеале менее одного часа), чтобы уменьшить физиологические и изменения гемодинамики в результате длительного седативного эффекта. Кроме того, продолжительность и воздействие изофлурана для каждого исследования должны быть сведены к minimuм из-за возможного тератогенного действия изофлуран ^12.

2. Определение эмбрионов

1. Изображениями запускается с помощью мочевого пузыря матери в качестве ориентира, с плодов на левой и правой рога матки обозначен как L1, 2,3 и так далее (слева) и R1, 2,3, и так далее (правая сторона) (см. Рисунок 1С). Обозначения плода удобно при поиске образцов после визуализации.
2. Образцы расположен слишком глубоко в брюшной полости проверяются документировать их присутствие, но исключены из анализа данных из-за низкого разрешения. Возможность сканирования соседних эмбрионов может помочь в отслеживании плодов (рис. 2A).
3. Сканирование самолеты были изменены путем изменения ориентации мыши по отношению к плоскости сканирования. Изображения получены в 2 ортогональных плоскостях для каждого плода (рис. 2). Усилия, чтобы получить просмотров приближения поперечной, фронтальной или сагиттальной плоскостях, но ст. Иногда ограничивается косой плоскостях положение матки в брюшной полости. Поворот сканирующей головки позволит также изменение ориентации без перемещения плотины.

Технические соображения

В то время как ручной работы зонда возможно у взрослых мышей эхокардиографию, а также ручной работы в плода изображений в не рекомендуется. Идентификация плодов усложняется изменчивой природы матки месте, извилистости и движения. Чтобы свести к минимуму трудности с локализацией плода, стационарного использования преобразователя (рис. 1) с минимальным движением за пределы горизонтальной плоскости плотины является существенным.

3. Оценка структуры и функции

1. Сканирование в В-режиме изображения используются для идентификации основных сердечных структур, таких как предсердия, межжелудочковой перегородки, желудочковой камеры, а также левый и правый путей оттока (рис. 2).
2. М-режим изображенияы получаются из короткая ось и используются для измерения толщины стенки желудочка и размеры камеры (рис. 3). Если правильного выравнивания не может быть получена за счет плода ложь, измерений B-режиме изображения могут быть использованы для количественного% фракции укорочения (FS). Временные изменения между LV конечный систолический размер (LVESD) и LV конечно-диастолического размера (LVEDD) на протяжении сердечного цикла используются для расчета сокращения доли (FS), следующим образом:
   % FS = [(LVEDD - LVESD) / LVEDD] х 100
3. Левого и правого желудочков определяются путем сканирования от головы до хвоста. Левая и правая стороны должны быть аннотированный. Видимый потоки поток, порожденный эхогенный крови плода способствует точное размещение объем образца доплеровского в митрального отверстия. Левый приток скорости желудочка получается из митрального клапана в апикальной четыре камеры и LV долго просмотров оси (рис. 4, C). Измерения аорты отток может быть использован для измерения SystoТИК время выброса (рис. 4, D). Частота сердечных сокращений может быть рассчитана по измерению одного потока цикла к следующему циклу потока (рис. 4, C и D). Следует проявлять осторожность, чтобы выровнять приток крови и доплеровского пучка, чтобы минимизировать угол Доплера. Значения находятся за пределами углом 60 градусов являются неточными и его следует избегать.
4. Сканирование в В-режиме изображения используются для определения общих структурных врожденные аномалии, такие как дефектов межжелудочковой перегородки (рис. 5). Доплеровского объем образца в желудочки могут быть использованы для идентификации потока через межжелудочковой перегородки. Дополнительные параметры, которые легко контролируются включают размер плода, частоту сердечных сокращений, скорости потока, перикардиальный выпот, и водянки плода. Окончательный диагноз конкретные пороки сердца требует дополнительной оценки вскрытии и гистопатологии.

Технические соображения

Определение левой и правой камерБерс может быть трудным в эмбриональной визуализации сердца в связи с аналогичными размерами желудочковой камеры в процессе разработки. Одна стратегия заключается в создании правой и левой ориентации плода в режиме реального времени путем перемещения изображений платформы в горизонтальной плоскости. Определение морду, зачатки конечностей и позвоночника помогут выявить пусть / правую ориентацию плода. Если это возможно, отслеживания оттока пути к арке или визуализацию основных бифуркации легочной артерии позволит для идентификации левого желудочка или выходного тракта правого соответственно. Для каждого плода изучено, важно отметить решительные лево-правой ориентации на сохраненные изображения.

После визуализации мониторинга животных и уход

После завершения визуализации, плотины возвращается к соответствующим жильем и мониторингу в соответствии со стандартом институциональных после процедуры протокола.Обезболивание после этого образа в принципе не требуется. Полное возобновление нормальной деятельности можно ожидать в течение пяти минут.

4. Представитель Результаты фетальной эхокардиографии

Развитие высокотехнологичных датчиков частоты (выше 8 МГц), позволили коммерческим эхокардиографического оборудования, чтобы иметь осевое разрешение около 0,2 мм с пространственным разрешением 0,3 мм, когда изображение будет увеличено и приобретенных на глубину 1 см. Большинство из недавно разработанных преобразователей линейных которые имеют то преимущество, избегая ближнего поля артефактов. Высокие частоты (30-50 МГц) механические датчики были недавно разработаны, которые являются адекватными для мышиной груди и частота сердечных сокращений, что позволяет осевое разрешение около 50 мкм на глубину 5-12 мм. Совсем недавно эти высокочастотные механические датчики добавил цветного допплеровского возможностей позволяет полной оценки желудочка и клапанной функции и идентификации сОхота поражения сердца плода. Методы, описанные здесь выполняются на системе VisualSonics Vevo 770 и может быть применен практически ко всем эквивалентных систем. Данной коммерчески доступных ультра-высокой частоты ультразвуковая система может работать на частоте 40 Гц с максимальной глубиной изображения от 7 до 14 мм, до 60 мм, боковые и от 50 до 100 мм осевое разрешение (Vevo770, VisualSonics, Inc.) Это сопоставимо с 60 Гц и 20 мм глубиной изображения, с 50 до 100 осевого мм и 200 мм до 500 мм боковые резолюцию с клиническими ультразвуковая система Acuson Sequoia.

Учитывая небольшие размеры сердца плода мыши, эхокардиография плода исследованиях на мышах технически сложной задачей. В отличие от эхокардиографии у взрослых мышей, УЗИ необходимо использовать нетрадиционные ультразвуковое плоскостей, тело плода оси. Извилистость матки также влияет на ориентацию плода и должны быть приняты во внимание. Кроме того, присущей ограничение глубины проникновения Ultrвысокие частоты ультразвука может сделать это трудно изображения всех образцов при беременности с большим количеством плодов.

Стратегия ультразвукового изображения позволяет для высокопроизводительного скрининга врожденных сердечно-сосудистых и экстракардиальных дефекты ^7. Помимо изучения генетических изменений, этот метод может быть использован для выявления дефектов в фармакологических и токсикологических исследований. Эта методика также может быть использована в качестве руководства инструмент для интервенционных процедур, таких как инъекции или измерение давления желудочка ^13.

Неинвазивного характера ультразвуковое исследование плода выгодно не только потому, что позволяет сердечно-сосудистой системы должна оцениваться в физиологических условиях, но также и потому, что это дает критическую фенотипической информации в режиме реального времени. Продольные экспертизы эмбрионального сердца, хотя технически возможно, по-прежнему сложно по нескольким причинам. Серийный рассмотрение одного и того же плода и язьntification одного и того же плода на каждый экзамен является сложной задачей, при отсутствии очевидной структурных дефектов. Движение матка и плод может полностью изменить ориентацию образца и таким образом сделать продольные отслеживания и последующих измерений трудно ^14.

Хотя эхокардиография является мощным средством для идентификации нарушения сердечной деятельности, специфической диагностики структурных дефектов сердца требует дальнейшего детального фенотипирование от вскрытия и гистопатологии ^15. Корреляции генотипа и конкретные плода требует сбора плодов на гистеротомии, желательно сразу после эхо исследования и в то время как плотина еще под наркозом, чтобы минимизировать изменения в ориентации и эмбрионов месте.

Нормальные значения для размеры камеры и функции были зарегистрированы для эмбриональных мышах и пользователей этой техники рекомендуется рассмотреть цитируемые для этих значений ^6-10. Оценкаклапанной морфологии ограничен разрешением изображения, однако кольцевая измерения измерение и измерение скорости через крупные сосуды возможно даже в начале ED 9.5. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы получить адекватное соответствие с потоком крови и преобразователей ^{10, 16.}

Следует подчеркнуть, что сердечные размеры варьируются в зависимости от штамма мышей, пол и возраст, и быстро менять в разных эмбриональных моменты времени и частоты сердечных сокращений. Важно, чтобы убедиться, что группы мышей подбираются для этих параметров. Плод изображения варьируется в зависимости от штамма мышей, а также. Например, беременные CD-1 плотину обычно содержит больше эмбрионов по сравнению с C57/BL6 деформации и, следовательно, может быть более трудно визуализировать все образцы. По этим причинам, использование возраста и процедить контрольной группы для каждого эксперимента следует использовать вместо эталонных значений. Кроме того, измерения отдельных параметров, таких как левого желудочка, конечный диастолический размер и задняяТолщина стенки может варьироваться в нормальных мышей до 25% ^8.

Рисунок 1. Обзор настройки использования VisualSonics Vevo 770 системы. (A) VisualSonics интегрированной железнодорожной системы с физиологической блок мониторинга. (B) мышь позиционируется и должным образом ограничение на отопление борту. Четырех конечностей выявляются в ЭКГ-электродов. (C) Схема беременной мыши и расположение эмбрионов. Количество эмбрионов в каждый рог матки может значительно меняться в дополнение к ориентации плода. (D) расположена плотина на платформе изображений со стрелками, отметив, самолеты манипуляции (X-ось и Y-ось) для перемещения Плотина для работы с изображениями. Z-оси относится к движению преобразователя вверх и вниз (как показано стрелкой на панели B). B, мочевого пузыря, L, левый, R, пнравом.

Рисунок 2. Представитель B-режим изображения. Эта цифра содержится представитель B-режиме изображение эмбриональных день 14,5 плода. (A) Визуализация двух соседних плодов. Коробки указывают на расположение сердца плода. (B) анатомические ориентиры у плода вести ориентации. Эмбриональные день 14,5 сердце в четырех камер зрения (C), по короткой оси зрения левого и правого желудочков (D), выходного тракта правого желудочка и легочной артерии (ПА) (E), и левый контакт оттока желудочка (LVOT) и аорты (F).

Рисунок 3. Представитель оценки функции левого желудочка. Эта цифра содержится представительизображения 2D-эхокардиографии в перспективе оси сердца в эмбриональном день 14,5 (A), и четырех камер вида (B). (C) М-режим трассировки линии, обозначающие левого и правого желудочков внутренним диаметром в диастолу (R / LVIDd) и систолы (R / LVIDs) от четырех плоскости изображения камеры. Межжелудочковой перегородки (IVS) также визуализировать.

Рисунок 4. Представитель доплеровской оценки. Эта цифра содержится представитель изображений 2D-ЭхоКГ эмбриональных день 14,5 сердце в апикальной четыре камеры обзора (A). Левое предсердие и полость левого желудочка были изложены. (B) представитель размещения пульсовой волны доплеровского объем образца для записи митрального притока. (C) митрального притока доплеровского моделей, из которых раннего диастолического velocitу (обозначается "E") и сокращения предсердий (обозначается "A") скорости могут быть измерены. (D) представитель аорты доплеровского сигнала. Аортальный доплеровского струя может быть использован для измерения времени выброса (ET). Частота сердечных сокращений (HR) может быть рассчитана по измерению одного потока цикла к следующему циклу потока. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 5. Представитель обнаружения дефекта межжелудочковой перегородки. Эта цифра содержится представитель B-режиме изображение эмбриональных день 14,5 сердце в апикальной четыре камеры (A) с правого и левого желудочков полости, изложенные в (B). Обратите внимание на наличие межжелудочковой перегородки. (C) Поперечный разрез распечатанных сердце окрашивали гематоксилином и эозином.(D) B-режиме изображение эмбриональных день 14,5 сердце с дефектами желудочковой чашелистик (VSD), указанном стрелкой. (E) правой и левой полости желудочков изложены с наложенными размещения пульсовой волны объема образца доплеровского для записи потока через межжелудочковой перегородки. (F) Поперечный срез окрашивали гематоксилином и эозином распечатанных сердце после извлечения образца. (G), которые накладываются размещения пульсовой волны объема образца доплеровского для записи потока через межжелудочковой перегородки. (H) представитель доплеровского трассировки из (G) демонстрирует поток слева правого желудочка. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Discussion

Способность выполнять последовательные измерения и обнаружения мутанта плодов с пороком сердца подчеркивает полезность эхокардиографии для исследования нормального и аномального развития сердечно-сосудистых. Анализ структуры и функции сердца в естественных условиях стало неотъемлемой частью в описании генетические и не-генетические модификации нормального развития плода. Наличие 2D-управляемых доплеровских позволяет контролировать частоту сердечных сокращений и моделей кровотока при получении изображений в реальном времени. Пороки развития сердца, таких как дефектов межжелудочковой перегородки могут присутствовать и обнаруживаемым. Несмотря на высокое разрешение возможности современных платформ изображений, приобретение пик скорости оттока по-прежнему трудно, так как отсутствие цвета поток допплера на большинстве систем, сделать это трудно, чтобы выровнять громкость доплеровского образца с высоким разрешением 2D-изображения. Кроме того, положение плода в рог матки может препятствоватьВсе измерения или получения оптимального изображения. Основным ограничением ультразвуковой визуализации глубину сканирования, что ограничивает возможность визуализировать все эмбрионы из одной плотины. То же эмбрион будет смещаться в позицию внутри живота матери, что затрудняет отслеживание продольного одного и того же плода. Несмотря на эти ограничения, это неинвазивный метод может иметь неоценимое значение для наблюдения за физиологическим состоянием эмбриона в подстилке и для выявления и мониторинга тех эмбрионов, где пороки сердца можно ожидать.

Новые технологии

VisualSonics Vevo 2100 система, новейшая ультразвуковая система, прекратила преобразователи линейных массивов оборудованных для цветных изображений потока, что позволяет обеспечить цветного допплеровского возможностей даже у эмбрионов на E10.5-11.5. Эта система также спекл параметры отслеживания, которые могут предоставить подробную региональную функцию миокарда развития плода миокарда ^17. Спекл слежениявизуализации основана на ткани деформации и обеспечивает другую меру миокарда и региональной функции миокарда. Основной принцип спекл отслеживания, что ультразвук отражения создает нерегулярные спекл-структуры, что является уникальным для каждого сегмента миокарда. Эти сегменты могут быть отслеживаться на протяжении всего сердечного цикла и быть использованы для расчета смещения тканей, региональных скорости, напряжения и скорости деформации вдоль радиальной, продольной и окружной самолетов сердца. Помимо УЗИ, возникающих условий, таких как оптической когерентной томографии (ОКТ), микро-CT, и микро-МРТ, которые применяются для визуализации плода и, вероятно, предложить современные изображения с высоким разрешением бесплатно в высоком разрешении эхокардиография ^17.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo 770 Imaging System (Toronto, Canada)	VisualSonics
MHz transducer		RMV707B15-45
Isoflurane Vaporizer	Tec 3
Isoflurane			2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane