Summary
La muerte fetal y perinatal es una característica común en el estudio de las alteraciones genéticas que afectan el desarrollo cardíaco. Alta frecuencia de imágenes por ultrasonido ha mejorado en 2-D y resolución pueden proporcionar información relevante sobre el desarrollo cardíaco temprano y es un método ideal para detectar el impacto en la estructura y función cardíaca antes de la muerte.
Abstract
Los ratones transgénicos que muestran anormalidades en el desarrollo y la función cardíaca representan una herramienta poderosa para la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la función cardiovascular normal y la base fisiopatológica de la enfermedad cardiovascular humano. La muerte fetal y perinatal es una característica común en el estudio de las alteraciones genéticas que afectan el desarrollo cardíaco 1-3. Con el fin de estudiar el papel de las alteraciones genéticas o farmacológicas en el desarrollo inicial de la función cardiaca, la ecografía del feto vivo se ha convertido en una herramienta importante para la detección temprana de anomalías y longitudinal de seguimiento. Imágenes por ultrasonido no invasiva es un método ideal para la detección y el estudio de las malformaciones congénitas y el impacto en la función cardiaca antes de la muerte 4. Se permite el reconocimiento precoz de anormalidades en el feto de vida y de la progresión de la enfermedad puede ser seguida en el útero con estudios longitudinales 5,6.Hasta hace poco, la imagen del corazón de ratón fetal frecuentemente involucrados métodos invasivos. El feto tenía que ser sacrificado para realizar microscopía de resonancia magnética y microscopía electrónica o quirúrgicamente entregado por microscopía transiluminación. Una aplicación de sondas de alta frecuencia convencional con 2-D y pulsos de onda Doppler se ha demostrado para proporcionar mediciones de la contracción cardíaca y la frecuencia cardiaca durante el desarrollo embrionario con bases de datos de los cambios normales de desarrollo disponibles actualmente 6-10. Modo M proporciona además importantes datos funcionales, aunque, los planos de imagen adecuados son a menudo difíciles de obtener. Alta frecuencia de imágenes por ultrasonido del feto ha mejorado la resolución 2-D y puede proporcionar información relevante sobre el desarrollo temprano de las estructuras cardiacas 11.
Protocol
1. Preparación Ratones de Imagen
- Antes del estudio de formación de imágenes, anestesiar la presa (2-3% de isoflurano) en la cámara de inducción. Eliminar el animal de la cámara de inducción e inmediatamente colocar el hocico dentro de un cono de morro conectado con el sistema de anestesia. Retire la piel de la altura del pecho a mediados de los miembros inferiores (Ver Figura 1) con máquinas de cortar el pelo. Quitar el pelo del cuerpo restante con crema depilatoria. Crema depilatoria también se pueden utilizar sin cortar el pelo, y debe lavarse a fondo fuera de la piel después de su uso para evitar la irritación.
- Coloque el ratón anestesiado en una posición supina sobre una almohadilla de calefacción con Embedded derivaciones de ECG con el fin de mantener la temperatura corporal (Figura 1). Aplicar gel de electrodo para las cuatro patas y la cinta a los electrodos de ECG.
- Obtener un nivel de sedación en estado estacionario durante todo el procedimiento (1,0% a 1,5% de isoflurano mezclado con 100% de O 2). El nivel de anestesia se puede ajustar para mantener una meta de ritmo cardíaco de 450 ± 50 latidos por minuto (bpm). Debe prestarse cuidadosa atención a minimizar la dosis de isoflurano y duración de la sedación a menos de una hora.
- Suavemente inserte una sonda rectal (después de lubricante) para controlar la temperatura del cuerpo a través de la almohadilla térmica. Es importante mantener la temperatura del cuerpo dentro de un rango estrecho (37,0 ° C ± 0,5 ° C). Controlled anestésico y la temperatura corporal constante es esencial para la estabilidad hemodinámica de la madre y el feto.
Consideraciones técnicas
La adquisición de ecocardiogramas fetales puede ser un reto. Los datos obtenidos de estos estudios pueden confundirse debido a la respuesta al estrés tanto de la madre y el feto. Idealmente, la temperatura del animal debe ser mantenida usando una plataforma de imágenes calentada, circulando almohadilla de calentamiento, el calentamiento lámparas, o mantas autorregulado de calefacción. Además, el uso rutinario de un gel acústico calentada se recomienda. Alaunque la principal preocupación en materia de control de la temperatura corporal es evitar la hipotermia, la hipertermia desarrollo debe ser igualmente preocupante. Un aparato de calentamiento sin control tal como una almohadilla de calentamiento simple o la presencia de cerca de iluminación de halógeno puede resultar en elevación rápido y peligroso de la temperatura corporal. Desde considerables fluctuaciones de la temperatura del cuerpo en cualquier dirección pone al animal en peligro todos los esfuerzos deben hacerse para mantener la temperatura normal del cuerpo.
El ecografista adquisición de las imágenes tiene que evitar una presión excesiva en la cavidad con el transductor, ya que el peso del transductor por sí solo puede resultar en la función cardiaca alterada. La duración de la adquisición de la imagen también debe mantenerse a un mínimo (idealmente menos de una hora) con el fin de reducir los cambios fisiológicos y hemodinámicos resultantes de sedación prolongada. Además, la longitud de tiempo y la exposición al isoflurano para cada estudio debe mantenerse a un minimudebido a los posibles efectos teratogénicos de isoflurano 12 m.
2. Identificación de embriones
- Formación de imágenes se inicia mediante la vejiga de la madre como un punto de referencia, con fetos en los cuernos uterinos izquierdo y derecho marcados como L1, 2,3, etcétera (lado izquierdo) y R1, 2,3, etcétera (lado derecho) (véase la figura 1C). Notación de la ubicación feto es útil para la recuperación de muestras después de la formación de imágenes.
- Las muestras situadas demasiado profunda en el abdomen se analizan para documentar su presencia, pero se excluyen del análisis de datos debido a una pobre resolución. La capacidad de escanear embriones adyacentes pueden ayudar en el seguimiento de los fetos (Figura 2A).
- Planos de exploración se modifica por el cambio de la orientación del ratón con respecto al plano de exploración. Las imágenes se obtuvieron en 2 planos ortogonales para cada feto (Figura 2). Se hace un esfuerzo para obtener puntos de vista se aproximan los planos transversal, frontal, sagital o pero sometimes se limita a planos oblicuos por la posición del útero en el abdomen. La rotación de la cabeza de exploración también permitirá la modificación de la orientación sin mover la presa.
Consideraciones técnicas
Mientras que la operación del dispositivo de la sonda es factible en ecocardiografía ratón adulto, no operación manual en formación de imágenes fetal en recomendado. Identificación de los fetos se complica por la naturaleza variable de la ubicación uterino, tortuosidad, y el movimiento. Para minimizar las dificultades con localización feto, el uso del transductor estacionario (Figura 1) con un movimiento mínimo más allá del plano horizontal de la presa es esencial.
3. Evaluación de la Estructura y Función
- El modo de exploración b-imágenes se utilizan para identificar las estructuras cardiacas básicas, tales como las aurículas, tabique interventricular, las cámaras ventriculares y tractos de salida izquierda y derecha (Figura 2).
- M-modo de imagens se obtienen a partir de la vista de eje corto y se utilizan para medir el grosor de la pared ventricular y dimensiones de la cámara (Figura 3). Si la alineación correcta no se puede obtener debido a la mentira fetal, las mediciones de imágenes en modo B se puede usar para cuantificar acortamiento% fraccional (FS). Los cambios temporales entre LV dimensión sistólica final (LVESD) y LV diastólico final dimensión (LVEDD) durante todo el ciclo cardiaco se utilizan para el cálculo de la fracción de acortamiento (FS), como sigue:
% FS = [(LVEDD - LVESD) / LVEDD] x 100 - Los ventrículos izquierdo y derecho se identifican por exploración de la cabeza a la cola. Los lados izquierdo y derecho deben ser anotados. Corrientes visibles de flujo generados por la sangre fetal ecogénico facilita la colocación precisa del volumen de muestra Doppler en el orificio mitral. Velocidad de flujo de entrada del ventrículo izquierdo se obtiene de las válvulas mitrales en apical de cuatro cámaras y vistas LV eje largo (figura 4, C). Mediciones de flujo de salida aórtica se puede utilizar para medir systotiempo de eyección pública (Figura 4, D). La frecuencia cardíaca puede ser calculada a partir de la medición del ciclo de flujo de una a la siguiente ciclo de flujo (figura 4, C y D). Se debe tener cuidado para alinear el flujo de sangre y el haz Doppler para minimizar el ángulo Doppler. Los valores tomados más allá de un ángulo de 60 grados son inexactas y debe ser evitado.
- El modo de exploración b-imágenes se utilizan para identificar anomalías estructurales congénitas comunes tales como defectos del tabique ventricular (Figura 5). Doppler volumen de muestra dentro de los ventrículos se puede utilizar para identificar el flujo a través del tabique ventricular. Otros parámetros que son fácilmente controlados incluyen el tamaño fetal, la frecuencia cardíaca, las velocidades de flujo, derrame pericárdico y la hidropesía fetal. El diagnóstico definitivo de defectos cardíacos específicos requiere una evaluación adicional por necropsia e histopatología.
Consideraciones técnicas
Identificación de los cham izquierda y derechabros puede ser difícil la formación de imágenes cardiaca fetal debido a las dimensiones similares de cámaras ventriculares durante el desarrollo. Una estrategia consiste en establecer la orientación fetal derecha e izquierda en tiempo real moviendo la plataforma de formación de imágenes en el plano horizontal. Identificación del hocico, yemas de las extremidades y la columna vertebral le ayudará a identificar la orientación let / derecha del feto. Si es posible, el seguimiento de la pista de salida para el arco o la visualización de la bifurcación principal de la arteria pulmonar permitirá la identificación del tracto de salida ventricular izquierdo o tracto de salida derecho respectivamente. Para cada feto estudiado, es importante tener en cuenta la decidida orientación de izquierda a derecha en las imágenes guardadas.
Mensaje de imágenes de Animal Control y Cuidado
Después de la terminación de formación de imágenes, la presa se devuelve a la caja apropiada y controlada de acuerdo con la norma institucional post-procedimiento de protocolo.Analgesia siguiendo este procedimiento de imagen no es necesario. La plena reanudación de la actividad normal se puede prever un plazo de cinco minutos.
4. Resultados representativos de Ecocardiografía Fetal
El desarrollo de sondas de alta frecuencia (por encima de 8 MHz), han permitido que los equipos ecocardiográficos comercial para tener una resolución axial de aproximadamente 0,2 mm con una resolución lateral de 0,3 mm cuando la imagen se amplia y adquirida a una profundidad de 1 cm. La mayoría de los transductores desarrollados recientemente son lineales que tienen la ventaja de evitar artefactos cerca de campo. Alta frecuencia (30-50 MHz) sondas mecánicas se han desarrollado recientemente que son adecuados para el pecho murino y la frecuencia cardíaca, lo que permite una resolución axial de aproximadamente 50 micras, con una profundidad de 5-12 mm. Más recientemente, estas sondas de alta frecuencia mecánicos han añadido capacidades de Doppler del color que permite una evaluación completa de la función ventricular y valvular y la identificación de scaza lesiones en el corazón fetal. Los métodos descritos aquí se realizan en un sistema VisualSonics Vevo 770 y se puede aplicar a casi todos los sistemas equivalentes. Disponible en el mercado actual de ultra-alta frecuencia de ultrasonido sistema puede operar a 40 Hz con profundidad de imagen máxima de 7 a 14 mm, con un máximo de 60 mm lateral y de 50 a 100 mm resolución axial (Vevo770, VisualSonics, Inc.). Esto se compara con 60 Hz y 20 mm de profundidad de imagen, con axial de 50 mm a 100 y 200 a 500 mm de resolución lateral con el sistema de ultrasonido Acuson Sequoia clínica.
Dado el pequeño tamaño del corazón fetal de ratón, estudios ecocardiográficos fetales en ratones están técnicamente difícil. A diferencia de la ecocardiografía en ratones adultos, el ecografista debe utilizar aviones no convencionales de formación de imágenes por ultrasonido definidos por los ejes del cuerpo del feto. Tortuosidad del útero también afecta a la orientación del feto y debe ser tomado en consideración. Además, la limitación inherente en la profundidad de penetración de ultrun ultrasonido de alta-frecuencia puede hacer que sea difícil de imagen en todas las muestras de embarazos con un gran número de fetos.
Una estrategia de formación de imágenes por ultrasonido permite la detección de alto rendimiento para los defectos cardiovasculares congénitos y extracardíacas 7. Más allá del estudio de las alteraciones genéticas, esta técnica se puede utilizar para detectar defectos en farmacológica y estudios de toxicología. Esta metodología también se puede utilizar como una herramienta de orientación para los procedimientos de intervención, tales como inyecciones o en la medición de las presiones ventriculares 13.
La naturaleza no invasiva de la ecografía fetal es ventajoso, no sólo debido a que permite la función cardiovascular se evaluaron en condiciones fisiológicas, sino también porque este proporciona información crítica fenotípica en tiempo real. Examen longitudinal de corazones embrionarios, aunque técnicamente es posible, sigue siendo un reto por varias razones. Examen de serie del mismo feto y identification del feto mismo en cada examen es un reto en la ausencia de un defecto estructural evidente. Movimiento del útero y el feto puede cambiar completamente la orientación de la muestra y por lo tanto hacer el seguimiento longitudinal y mediciones de seguimiento difíciles 14.
Aunque la ecocardiografía es una técnica de gran alcance para la identificación de anomalías cardíacas, el diagnóstico específico de los defectos cardíacos estructurales requiere fenotipo más detallado por necropsia e histopatología 15. Correlación genotipo y de un feto específica requiere fetos cosecha por histerotomía, preferiblemente inmediatamente después de un estudio de eco y mientras la presa sigue siendo anestesiado para minimizar los cambios de orientación y ubicación del embrión.
Los valores normales de dimensiones de la cámara y la función se ha informado de embriones de ratones y de los usuarios de esta técnica se recomienda revisar las referencias citadas para estos valores 6-10. Valoraciónde la morfología valvular está limitado por resolución de la imagen, sin embargo, las mediciones de las dimensiones anulares y las mediciones de velocidad a través de los grandes vasos es factible incluso tan pronto como ED 9,5. Se debe tener cuidado para obtener una alineación adecuada con el flujo sanguíneo y el transductor 10, 16.
Cabe destacar que las dimensiones cardíacas variar de acuerdo con ratones cepas, género y edad, y cambiar rápidamente en diferentes puntos de tiempo embrionarias y ritmos cardíacos. Es importante verificar que los grupos de ratones se emparejan para estos parámetros. Imágenes fetal varía según la cepa de ratón también. Por ejemplo, el CD-1 embarazada presa rutinariamente contiene más embriones en comparación con la cepa C57/BL6 y por lo tanto puede ser más difícil de visualizar todos los especímenes. Por estas razones, el uso de edad y controles de la misma cepa para cada experimento se debe utilizar en lugar de los valores de referencia. Además, las mediciones de parámetros individuales tales como ventricular izquierda diastólica final dimensión y posteriorespesor de pared puede variar en ratones normales de hasta 25% 8.
Figura 1. Descripción general de configuración utilizando VisualSonics Vevo sistema 770. (A) VisualSonics sistema ferroviario integrado con unidad de monitorización fisiológica. (B) El ratón se posiciona correctamente y moderación en el tablero de la calefacción. Los cuatro miembros son grabadas en los electrodos de ECG. (C) Esquema de ratón embarazadas y el diseño de embriones. El número de embriones dentro de cada cuerno del útero puede variar significativamente, además de la orientación del feto. (D) Una presa posicionado en la plataforma de formación de imágenes con flechas señalando los planos de manipulación (eje X y eje Y-) para mover la presa para la imagen. El eje Z se refiere al movimiento del transductor hacia arriba y hacia abajo (como se indica por la flecha en el panel B). B, vejiga, L, izquierda, R, right.
Figura 2. Representante modo b-imágenes. Esta cifra contiene representativas modo b-imágenes del día embrionario 14,5 feto. (A) Visualización de dos fetos vecinos. Las cajas indican la ubicación del corazón fetal. (B) referencias anatómicas en el feto para guiar la orientación. Día embrionario 14,5 corazón en una vista de cuatro cámaras (C), de eje corto de los ventrículos izquierdo y derecho (D), el tracto de salida del ventrículo derecho y la arteria pulmonar (AP) (E), y el tacto de salida del ventrículo izquierdo (TSVI) y la aorta (F).
Figura 3. Representante evaluación de la función ventricular. Esta figura contiene representanteimágenes de ecocardiografía 2D de la vista de eje largo del corazón en el día embrionario 14,5 (A), y una vista de cuatro cámaras (B). (C) M-modo de rastreo con líneas que indican el diámetro del ventrículo izquierdo y derecho interno en diástole (R / DDVI) y sístole (R / LVIDs) desde el plano de cuatro cámaras de imagen. Septum interventricular (IVS) también se visualiza.
Figura 4. Representante evaluación Doppler. Esta figura contiene imágenes representativas de la ecocardiografía 2D del día embrionario 14,5 corazón en una apical de cuatro cámaras (A). La aurícula izquierda y la cavidad ventricular izquierda se han esbozado. (B) Colocación Representante de Pulso volumen de muestra Doppler para la grabación de flujo mitral. (C) de flujo de entrada mitral patrones Doppler de la que VelocIT diastólica precozy (denotado "E") y la contracción auricular (denotado "A") se puede medir velocidades. (D) Representante aórtica Doppler de onda. Aórtica Doppler chorro se puede utilizar para medir el tiempo de eyección (ET). La frecuencia cardiaca (HR) se puede calcular a partir de la medición de flujo de un ciclo al siguiente ciclo de flujo. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 5. Representante detección del defecto ventricular septal. Esta figura contiene representativas modo b-imágenes del día embrionario 14,5 corazón en una apical de cuatro cámaras (A) con las cavidades ventriculares derecha e izquierda descritos en (B). Obsérvese la presencia del tabique interventricular. (C) Sección transversal de corazón formado la imagen se tiñeron con hematoxilina y eosina.(D) B-modo de imagen de día embrionario 14,5 corazón con un defecto ventricular sépalo (VSD) indicada por la flecha. (E) cavidades ventriculares derecha e izquierda se indican con la colocación superpuesta de volumen de muestra de pulso Doppler de onda para la grabación de flujo a través de la septum interventricular. (F) Sección transversal tiñeron con hematoxilina y eosina de corazón formado la imagen después de recuperación de muestras. (G) Superpuesta colocación de pulso volumen de muestra Doppler de onda para la grabación de flujo a través del tabique interventricular. (H) Representante Doppler rastreo a partir de (G) demostrando el flujo desde la izquierda al ventrículo derecho. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
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Discussion
La capacidad de realizar mediciones en serie y para detectar los fetos mutantes con defectos cardíacos pone de manifiesto la utilidad de la ecocardiografía para investigar el desarrollo cardiovascular normal y anormal. Análisis de la estructura y la función cardíaca in vivo se ha convertido en una parte integral en la descripción de las modificaciones genéticas y no genéticas para el desarrollo normal del feto. La disponibilidad de 2D guiada por Doppler hace que sea posible controlar la frecuencia cardiaca y patrones de flujo sanguíneo, mientras que la obtención de imágenes en tiempo real. Defectos en el desarrollo del corazón tales como defectos septales ventriculares puede estar presente y detectable. A pesar de las capacidades de alta resolución de imagen de las plataformas actuales, la adquisición de las velocidades de flujo de salida de pico sigue siendo difícil, ya que la falta de color flujo Doppler en la mayoría de los sistemas hacen que sea difícil para alinear el volumen de la muestra Doppler con las imágenes de alta resolución en 2D. Además, la posición del feto dentro del cuerno uterino puede impedirtodas las mediciones o producen imágenes subóptima. La principal limitación de la ecografía es la exploración de profundidad, que limita la capacidad de visualizar todos los embriones de una sola presa. El mismo embrión se desplazará en posición dentro del abdomen de la madre, lo que complica el seguimiento longitudinal del feto mismo. A pesar de estas limitaciones, esta técnica no invasiva puede ser muy valiosa para controlar el estado fisiológico de los embriones dentro de una camada y para detectar y vigilar los embriones en los defectos del corazón se pueden esperar.
Las tecnologías emergentes
El VisualSonics Vevo 2100 del sistema, el sistema más nuevo de ultrasonido, ha eliminado transductores lineales de matriz equipados para la formación de imágenes flujo de color, por lo que es posible proporcionar capacidades de color Doppler incluso en los embriones en E10.5-11.5. Este sistema también ha speckle opciones de seguimiento que pueden proporcionar detallada la función miocárdica regional de desarrollo fetal miocardio 17. Speckle trackingformación de imágenes se basa en la deformación del tejido y proporciona otra medida de la contractilidad miocárdica y la función miocárdica regional. El principio básico de speckle tracking es que las reflexiones de ultrasonido crear un patrón de speckle irregular que es única para cada segmento de miocardio. Estos segmentos pueden entonces ser seguido durante el ciclo cardíaco y se utilizará para calcular el desplazamiento de tejido, velocidad regional, cepa, y la velocidad de deformación a lo largo de planos radiales, longitudinal y circunferencial del corazón. Más allá de ultrasonido, las modalidades emergentes, como la tomografía de coherencia óptica (OCT), micro-CT, MRI y micro, se aplican a las imágenes del feto y es probable que ofrecen imágenes de alta resolución avanzado gratuito de alta resolución ecocardiografía 17.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
GHK es apoyado por el NIH / NHLBI K08-HL098565 y el Instituto de Investigación Cardiovascular de la Universidad de Chicago. Todos los métodos experimentales descritos son aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión de la Universidad de Chicago.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo 770 Imaging System (Toronto, Canada) | VisualSonics | ||
| MHz transducer | RMV707B15-45 | ||
| Isoflurane Vaporizer | Tec 3 | ||
| Isoflurane | 2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane |
References
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