Summary
Dit protocol beschrijft het gebruik van peptide: MHC tetrameren en magnetische microbolletjes voor laagfrequente populaties van epitoop-specifieke T-cellen isoleren en analyseren door flowcytometrie. Deze methode maakt de directe bestudering van endogene T-celpopulaties plaats van
Abstract
Een basisvereiste voor onderzoekers die met adaptieve immuniteit in vivo experimentele modellen is het vermogen om T-cellen op basis van hun T-cel antigen receptor (TCR) specificiteit identificeren. Veel indirecte methoden beschikbaar waarin een bulk populatie van T-cellen wordt gestimuleerd in vitro met een specifiek antigeen en epitoop-specifieke T-cellen worden geïdentificeerd door het meten van een functionele reactie zoals proliferatie, cytokine productie of expressie van merkers van activering 1. Echter, deze methoden alleen identificeren epitoopspecifieke T-cellen vertonen een van de vele functies en zijn niet gevoelig genoeg om epitoop-specifieke T-cellen te detecteren op naïeve precursor frequenties. Een populair alternatief is de TCR transgene adoptieve transfer model, waarbij monoklonale T-cellen van een TCR transgene muizen worden geënt in histocompatibel hosts een groot precursor populatie van epitoop-specifieke T-cellen die kunnen worden EASI creërenly gevolgd met behulp van een antilichaam congenische marker 2,3. Terwijl krachtige Deze werkwijze heeft experimentele artefacten die met de niet-fysiologische frequentie van T-cellen met specificiteit voor een epitoop 4,5. Bovendien kan dit systeem niet worden gebruikt om de functionele heterogeniteit van epitoop-specifieke T cel klonen te onderzoeken binnen een polyklonale populatie.
De ideale manier om adaptieve immuniteit bestuderen dienen onder directe detectie van epitoopspecifieke T-cellen van het endogene T-cel repertoire volgens een methode die TCR specificiteit onderscheidt uitsluitend door haar binding aan verwant peptide: MHC (pMHC) complexen. Het gebruik van pMHC tetrameren en flowcytometrie volbrengt deze 6, maar is beperkt tot het opsporen van hoogfrequente populaties van epitoopspecifieke T-cellen aangetroffen volgende antigen geïnduceerde klonale expansie. In dit protocol beschrijven we een werkwijze die het gebruik van pMHC tetrameren coördineert en magnesiumtic cel verrijkingscocktail technologie voor de detectie van extreem lage frequentie epitoopspecifieke T-cellen van muizen lymfoïde weefsels 3,7 toestaat. Met deze techniek kan men volledig volgen gehele epitoopspecifieke populaties van endogene T-cellen in muizen in alle stadia van de immuunrespons.
Protocol
1. Cell Isolatie van lymfeweefsel
- Voeg 1 ml ijskoud cEHAA (EHAA + 10% FBS, pen / strep, gentamycine, 2 mM L-glutamine, 55 mM 2-mercaptoethanol) of andere gelijkwaardige T-cel medium, een 60 mm kweekplaat die een klein stukje 100 um nylon gaas en plaats op ijs.
- Euthanaseren muis.
- Verwijder de milt en zoveel gemakkelijk toegankelijke lymfeknopen mogelijk. Deze omvatten ten minste de lies, oksel, brachiale, cervicale en mesenterische lymfklieren. Plaats ze bovenop de nylon mesh in de kweekschaal.
- Met behulp van de platte bovenkant van een gesloten 1,5 ml microfugebuisje, het lymfoïde weefsel voorzichtig mash over de nylon mesh om lymfocyten te bevrijden. Voeg een 1 ml cEHAA en pipet op en neer om cellen werken in een suspensie. Breng de cellen door een ander stuk nylon mesh geplaatst over de top van een 15 ml polypropyleen centrifugebuis. Spoel de schaal en gaas met een 1 ml ijskoude cEHAA, pooling de volumes in dezelfde buis. Herhalen om een uiteindelijke celsuspensie volume van 4 ml te bereiken.
- Voeg koud sorter buffer (PBS + 2% FBS, 0,05% azide) tot een eindvolume van 15 ml en centrifugeer de buis gedurende 5 min bij 300 xg, 4 ° C.
- Zuig de supernatant voorzichtig, zodat er geen druppeltjes vloeistof achterblijven op de zijkanten van de buis. Resuspendeer de celpellet in Fc block (sorter buffer + 2.4G2 antilichaam) tot een volume gelijk aan ongeveer twee keer die van de pellet zelf. Bijvoorbeeld, de milt en lymfeknopen van een naïeve muis produceert gewoonlijk een cel pellet ongeveer 100 pl. In dit geval wordt 100 pl Fc blok om het volume op 200 pl brengen. Als er een grote mate van cel klonteren heeft plaatsgevonden, verwijder voorzichtig de cel klonteren op dit punt met een pipet tip.
2. Tetrameer Staining
- Voeg PE-of APC-gemerkte pMHC tetrameer tot een eindconcentratie van 10 nM (of empirisch geoptimaliseerd concentratie).
- Mix en incute 1 uur bij kamertemperatuur (of empirisch geoptimaliseerd tijd en temperatuur).
- Voeg koud sorter buffer tot een volume van 15 ml en centrifugeer de buis gedurende 5 min bij 300 xg, 4 ° C. Bewaar monsters op ijs of bij 4 ° C vanaf nu.
- Zuig de supernatant voorzichtig, zodat er geen druppeltjes vloeistof achterblijven op de zijkanten van de buis. Resuspendeer de celpellet in sorter buffer tot een eindvolume van 200 ul. Voor dubbele tetrameer verrijking, resuspendeer tot een eindvolume van 150 ul.
3. Magnetische Verrijking
- Voeg 50 ul van Miltenyi anti-PE of anti-APC microbolletjes. Voor dubbele tetrameer verrijking, voeg 50 ul van beide.
- En incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C.
- Voeg koud sorter buffer tot een volume van 15 ml en centrifugeer de buis gedurende 5 min bij 300 xg, 4 ° C.
- Tijdens het wachten, het opzetten van een Miltenyi LS magnetische zuil op een MidiMACS of QuadroMACS magneet. Plaats een open 15 ml polypropyleen centrifugebuis eenrack direct onder de kolom.
- 3 ml buffer sorter naar de top van de kolom, waardoor het afwateren in de 15 ml buis.
- Plaats een nylon mesh 100 urn vierkante bovenop de kolom.
- Wanneer cellen klaar spinnen zorgvuldig aspireren het supernatant en resuspendeer de pellet in 3 ml buffer sorter.
- Breng de celsuspensie door de nylon mesh op de top van de kolom.
- Wanneer de celsuspensie geheel is afgevoerd in de kolom, spoel de oorspronkelijke buis met een 3 ml buffer sorteerder en breng het buffer door de nylon mesh in de kolom, spoelen het gaas in het proces. Gooi de nylon mesh.
- Wanneer de buffer volledig is afgevoerd naar de kolom toe nog 3 ml buffer sorter de kolom.
- Herhaal stap 10 voor een totaal van 3 x 3 ml wasbeurten.
- Verwijder de kolom uit de magneet en plaats over een nieuwe 15 ml polypropyleen centrifugebuis.
- Voeg 5 ml sorteerder buffer aan tHij kolom.
- Plaats onmiddellijk de zuiger in de top van de kolom en in een vloeiende beweging, duw de zuiger helemaal naar beneden, waardoor de buffer van de kolom in de buis.
- Centrifugeer de buizen die het geëlueerde gebonden fractie en de doorstroom ongebonden fractie gedurende 5 min bij 300 xg, 4 ° C.
- Zuig voorzichtig het supernatans van de gebonden fractie, waarbij er geen druppeltjes vloeistof achterblijven op de zijkanten van de buis. Resuspendeer de celpellet in sorter buffer tot een eindvolume van 95 pi precies. Zuigen en resuspendeer de ongebonden fractie tot een eindvolume van 2 ml.
4. Flow Cytometry
- Voor elke fractie, verwijderen 5 pl en aan 200 pl tellen kralen (ingesteld op een concentratie van 200.000 / ml in buffer sorter) in een 5 ml FACS buis. Terzijde bij 4 ° C voor analyse later. Om tijd te besparen, kan kralen vooraf worden verdeeld in fracties om gelabelde buizen voor de start van het experiment.
- Bereid amaster mix van antilichamen tegen oppervlaktemerkers op de cellen (tabel 1) kleuring. Om tijd te besparen, kan deze worden verricht vóór de start van het experiment.
- De gebonden fractie direct voeg een dosis van antilichaam cocktail de ~ 90 pi cellen in de buis. Als een analyse van de ongebonden fractie gewenst breng 90 pl van cellen aan een 5 ml FACS buis en voeg een dosis van antilichaam cocktail.
- Het opzetten van een panel van een kleur vergoeding controles voor de flowcytometer. Voor elke fluorochroom te gebruiken mix 50 pi overgebleven ongebonden fractie cellen in een 5 ml FACS buis met 1 pi anti-CD4 antilichaam geconjugeerd aan de overeenkomstige fluorochroom. Vergeet niet om het opzetten van een ongekleurde controle ook.
- Vortex en incubeer alle monsters gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
- Voeg 5 ml buffer sorter aan elke buis en centrifugeer 5 min bij 300 xg, 4 ° C.
- De gebonden fractie, zorgvuldig aspireren supernatant en resuspendeer de cellen in 200 ul sorter buffer. Breng de cellen in een 1,2 ml FACS microbuisjes. Spoel de buis met een andere 200 ul sorteerder buffer en het zwembad in dezelfde microbuisjes. Als celklonten zijn duidelijk zichtbaar, langs de cellen door een 50 pm filter.
- Voor de ongebonden fractie en compensatie controles, schenk of aspireren het supernatans en resuspendeer in 2 ml sorter buffer.
- Stel de flowcytometer met behulp van de single-kleurcompensatie controles. Selecteer zijwaartse verstrooiing-breedte (SSC-W) als extra parameter op te nemen.
- Analyseer de gekleurde monsters met een reeks opeenvolgende integratie poorten CD4 + identificeren of CD8 + T-cellen zoals weergegeven in figuren 1 en 2. Voor gebonden fracties, verzamel zo veel cellen als mogelijk tot een maximum van 2.000.000 in totaal gebeurtenissen. Voor ongebonden fracties, het verzamelen van 1.000.000 totaal evenementen. Houd de overname tarief op of onder 3.000 gebeurtenissen per seconde.
- Met dezelfde machine-instellingen, het analyseren van de tellen kraal monsters. Verzamel 10.000 in totaal gebeurtenissen. </ Li>
- Sla alle gegevens FCS-bestanden.
5. Data-analyse
- Analyseer FCS gegevensbestanden voor de telling kraal monsters met behulp van FlowJo software. Plot voorwaartse verstrooiing door FITC en zet een hek aroung het tellen kralen (zie figuren 1 en 2). Bepaal het aantal tellen beads in elk monster. Aftrekken van het totale aantal verzamelde gebeurtenissen het aantal verzamelde cel gebeurtenissen.
- Bereken het totale aantal cellen in elk monster met behulp van de vergelijkingen beschreven in box 1.
- Analyseer FCS gegevensbestanden voor de gebrandschilderde gebonden en ongebonden fractie monsters. Stel een reeks opeenvolgende integratie poorten lymfoïde +, side scatter-breedte lo stortplaats-, CD3 +, CD4 + of CD8 +, tetrameer + T-cellen in elk monster zoals weergegeven in figuren 1 en 2. Identificeren
- Vermenigvuldig het totale aantal cellen in het monster door de frequenties van elk van de opname poorten gebruikt om CD4 + definiëren tetrameer+ Of CD8 + cellen tetrameer + het totale aantal epitoop-specifieke T-cellen (Box 1) berekenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 geeft representatieve flowcytometrie stukken pMHCII tetrameer verrijkte milt en lymfeklieren monsters van naïeve muizen, terwijl Figuur 2 toont representatieve gegevens voor muizen geïmmuniseerd met de relevante peptide + CFA. Serial gating verwijdert autofluorescerende en andere ongewenste gebeurtenissen uit de analyse van CD4 + T-celpopulaties. De CD8 + T-celpopulatie dient als nuttige interne negatieve controle voor pMHCII tetrameer kleuring van CD4 + T-cellen. Merk op dat gebonden fracties uit het verrijkingsproces meestal een significant groter deel van autofluorescente cellen dan de ongebonden fracties bevatten, waardoor gating meer uitdagend.
Absolute aantallen epitoop-specifieke T-cellen in een monster worden berekend door het totale aantal cellen in de gebonden fractie van de verrijkte monster, bepaald vanuit de kraal telling analyse, waarbij het aantal van deze cellen die tetrameer + als determinantenned uit de cel vlekken analyse (Box 1).
Voor de naïeve muis in figuur 1, de concentratie van cellen in de gebonden fractie van het monster (4411/5589) (200.000) (0.200/0.005) = 6,31 x 10 6 / ml. Het totale aantal cellen in het monster (6,31 x 10 6 / ml) (0,095) = 6.00 x 10 5. Tenslotte het aantal epitoopspecifieke CD4 + T cellen (6.00 x 10 5) (41,5%) (96,6%) (10,2%) (62,3%) (0,64%) = 98.
Voor de geïmmuniseerde muis in figuur 2, de concentratie van cellen in de gebonden fractie van het monster (6410/3590) (200.000) (0.200/0.005) = 1,43 x 10 7 / ml. Het totale aantal cellen in het monster (1,43 x 10 7 / ml) (0,095) = 1,36 x 10 6. Tenslotte het aantal epitoopspecifieke CD4 + T cellen (1,36 x 10 6) (40,9%) (93,9%) (9,54%) (72,0%) (42,7%) = 1,53 x 10 4 </ Strong>.
De efficiëntie van verrijking af naarmate het aantal epitoop-specifieke T-cellen verhoogt 8, zodat tetrameer + cellen kan worden gezien in de ongebonden fractie van monsters met zeer hoge frequenties van epitoop-specifieke T cellen. In dergelijke gevallen is het aantal epitoopspecifieke T cellen aanwezig in de ongebonden fractie afzonderlijk worden berekend en opgeteld bij het aantal in de gebonden fractie. Derhalve in figuur 2, de concentratie van cellen in de ongebonden fractie van het monster (9031/969) (200.000) (0.200/0.005) = 7,46 x 10 7 / ml, het totale aantal cellen (7,46 x 10 7 / ml) (2,0) = 1,49 x 10 8, en het totale aantal epitoop-specifieke CD4 + T cellen (1,49 x 10 8) (62,7%) (96,4%) (44,5%) (54,7%) (0,0409 %) = 8,97 x 10 3. Het toevoegen van de nummers in de gebonden en ongebonden fracties, zijn er 1,53 x 10 4 + 8,97 x 10 3 = 2.43 x10 4 totale epitoop-specifieke CD4 + T-cellen in het gehele monster. Inderdaad, als epitoopspecifieke celexpansie voldoende robuust kan het verrijkingsproces overgeslagen.
| Fluorochroom | Antilichaam |
| Pacific Blue | dump (B220, CD11b, CD11c, F4/80) |
| Pacific Oranje | CD8 |
| FITC | CD3 |
| PE | pMHC tetrameer of fenotypische marker |
| PerCP | CD4 |
| APC | pMHC tetrameer of fenotypische marker |
| AlexaFluor 700 | CD44 |
Tabel 1. Idee antilichaamkleuring strategie
: Content-width = "6in" fo: src = "/ files/ftp_upload/4420/4420fig1highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/4420/4420fig1.jpg" />
Figuur 1. Flowcytometrische analyse van epitoop-specifieke CD4 + T-cellen in naïeve muizen na pMHCII tetrameer gebaseerde verrijking. Representatieve plots worden getoond voor de gebonden (A) en ongebonden (B) fracties. Een opeenvolging van poorten zijn ingesteld op lymfoïde-scatter selecteren +, side-scatter-widthlo, dump-, CD3 + evenementen. Hiervan CD4 + of CD8 + gebeurtenissen gated voor de analyse van epitoop-specifieke T-cellen of achtergrondkleuring. Aliquots van ongekleurde cellen van de binding (C) en ongebonden (D) fractie gemengd met fluorescerende kralen en tellen apart geanalyseerd. Klik hier om groter bedrag bekijken .
oad/4420/4420fig2.jpg "/>
Figuur 2. Flowcytometrische analyse van epitoop-specifieke CD4 + T-cellen in peptide-geïmmuniseerde muizen na pMHCII tetrameer gebaseerde verrijking. Representatieve plots worden getoond voor de gebonden (A) en ongebonden (B) fracties. Een opeenvolging van poorten zijn ingesteld op lymfoïde-scatter selecteren +, side-scatter-widthlo, dump-, CD3 + evenementen. Hiervan CD4 + of CD8 + gebeurtenissen gated voor de analyse van epitoop-specifieke T-cellen of achtergrondkleuring. Aliquots van ongekleurde cellen van de binding (C) en ongebonden (D) fractie gemengd met fluorescerende kralen en tellen apart geanalyseerd. Klik hier om groter bedrag bekijken .
Box 1. Berekening van epitoop-specifieke T-cel aantallen
Absolute aantallen epitoopspecifieke T cellen best berekend met behulp van fluorescerende kralen tellen. Een hoeveelheid van ongekleurdecellen van elk monster wordt gemengd met een gegeven volume tellen kralen ingesteld op een bekende concentratie en geanalyseerd door flowcytometrie. De concentratie van cellen in het monster kan worden afgeleid uit een vergelijking van de frequentie met de bekende concentratie van fluorescerende kralen tellen.
Het totale aantal cellen in het monster wordt vervolgens berekend door de celconcentratie met de totale monstervolume.
Het totale aantal epitoop-specifieke T-cellen in het monster is eenvoudig het totale aantal cellen in het monster vermenigvuldigd met het percentage van cellen die tetrameer-positief.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De pMHC tetrameer gebaseerde mobiele verrijking methode die door dit protocol is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van epitoop-specifieke T-cellen van endogene T-cel repertoire. Het gebruik van pMHC tetrameren maakt detectie van epitoopspecifieke T-cellen rechtstreeks gebaseerd op het vermogen van de TCR aan cognate pMHC liganden binden. De verrijking een niveau van gevoeligheid zodat uiterst zeldzame populaties van antigeen-specifieke T-cellen kunnen gedetecteerd worden uit repertoires van endogene T-cellen zonder manipulatie van de genetische of precursorfrequentie. Dientengevolge deze techniek kan de onderzoeker direct endogene antigenspecifieke T-celpopulaties volgen van in vivo experimentele systemen uit de naïeve niveaus in alle stadia van de immuunrespons.
Dit protocol is geoptimaliseerd voor het gebruik van pMHC klasse II (pMHCII) tetrameren op epitoop-specifieke CD4 + T-cellen van de secundaire lymfoïde organen verrijkens van muizen. De techniek ook voor pMHC klasse I (pMHCI) tetrameren en CD8 + T-cellen 9. Anders CD4, CD8 de coreceptor speelt een belangrijke rol bij het stabiliseren TCR MHC-interacties en dit kan praktische gevolgen hebben voor pMHCI tetrameer kleuring 10. Met name moet het gebruik van CD8 antilichamen beperkt tot klonen die geen nadelige CD8-tetrameer binding en zij worden toegevoegd aan cellen na kleuring tetrameer. Sterker nog, sommige pMHCI tetrameren ontworpen met gemuteerde MHCI-CD8 bindingsplaatsen specifieke binding aan CD8 + T cellen 11,12 beperken.
Tetrameer concentratie, incubatietijd, en incubatie temperatuur kan grote invloed hebben op de efficiëntie van de tetrameer kleuring, en voorwaarden moeten worden geoptimaliseerd om de beste combinatie van hoge tetrameer signaal, lage achtergrond signaal, lage tetrameer internalisatie, en minimale veranderingen in celfysiologie te bereiken. In het ideale geval deze voorwaarden moet be empirisch bepaald voor elke unieke reagens. In onze handen echter een eindconcentratie van 10 nM en een incubatie van 1 uur bij kamertemperatuur biedt goede algemene voorwaarden voor de meeste pMHCI of pMHCII tetrameren. In het algemeen pMHCI tetrameren lijken gemakkelijker vlek dan pMHCII tetrameren en kleuring kan vaak worden uitgevoerd bij 4 ° C gedurende slechts 30 minuten.
De omvang van deze procedure is geschikt voor de analyse van bijna alle secundaire lymfoïde organen van een muis in een enkel monster. Daarom elk monster vertegenwoordigt een vrij uitgebreide analyse van de gehele circulerende perifere T-cel repertoire van een muis. Epitoopspecifieke T-cellen kunnen worden verrijkt uit andere weefsels, zoals de thymus 13,14. Wanneer thymii 4-5 weken oude muizen geanalyseerd kunnen epitoopspecifieke enkele positieve thymocyten worden gedetecteerd nummers overeenkomen met die van perifere naïeve T-cellen. Epitoop-specifieke dubbel-positieve thymocyten,echter erg moeilijk te detecteren vanwege hun lage TCR expressie.
Dit protocol kan worden aangepast aan epitoopspecifieke humane CD4 + detecteren of CD8 + T-cellen in bloed of andere weefsels 15-17. De frequentie van epitoop-specifieke T-cellen van dezelfde orde tussen muizen en mensen 17, zodat de analyse van 50 - 100 ml bloed zou vergelijkbare aantallen epitoopspecifieke T-cellen als de gepoolde milt en lymfeklieren van een muis 18 verkregen.
Een belangrijke uitdaging in de flowcytometrische analyse van cellen na tetrameer op basis van verrijking is onderscheidend ware cel gebeurtenissen uit achtergrond. Dit is grotendeels te wijten aan het feit dat veel autofluorescerende cellen ook niet specifiek verrijkt tijdens het proces. Indien niet zorgvuldig uit gated kunnen deze autofluorescerende cellen als vals tetrameer-positieve cellen en werpen de nauwkeurigheid van de analyse, met name in het geval van zeldzame naïeve T-cel populations. Ons protocol maakt gebruik van een twee-staps gating strategie waarbij CD3 + evenementen zijn in de eerste gated uit de buurt van dump geslacht + evenementen, en dan CD4 + evenementen zijn gated uit de buurt van CD8 + evenementen. In het proces, autofluorescerende cellen, die meestal liggen in het midden van elke diagonaal FACS plot zijn gated uit de analyse in twee iteratieve stappen. De effectieve verwijdering van autofluorescente gebeurtenissen gaat ten koste van vele fluorescerende kleuren, dus we raden het gebruik van flowcytometers staat van ten minste 6 tl-parameters.
De meeste pMHC tetrameren geconjugeerd aan PE en APC vanwege de helderheid van deze fluorochromen en anti-PE en anti-APC magnetische microbolletjes gemakkelijk toegankelijk voor verrijking mogelijk mee. Echter, andere fluorochromen ook zo lang worden gebruikt als corresponderende magnetische microbolletjes zijn. Inderdaad kunnen meerdere tetrameren met verschillende fluorochroom labels worden gebruikt samen met het overeenkomstige antilichaam-geconjugeerd microbeads gelijktijdig meerdere epitoopspecifieke T-celpopulaties verrijken van hetzelfde monster. We hebben aangegeven een zeer eenvoudige antilichaam fluorochroom setup die is geoptimaliseerd voor het gebruik van PE-en APC-gemerkte tetrameren (tabel 1), maar veel andere effectieve combinaties mogelijk om de flexibiliteit bij het onderzoek van fenotypische markers.
CD8 + T-celpopulaties kunnen worden gebruikt als interne negatieve controle, omdat ze niet binden aan pMHCII liganden (en vice versa voor epitoop-specifieke CD8 + T-cel verrijking). De frequentie van tetrameer + CD8 + cellen in een monster een goede beoordeling van het achtergrondlawaai tetrameer kleuring, hoewel bona fide tetrameer-positieve CD8 + T cellen met cross-beperkte specificiteit voor epitopen pMHCII bestaan bij zeer kleine frequenties 19. Soms werd zeer sterke immuunreacties kunnen deze cellen bestaan uitgebreide frequenties. Desgewenst TCR transgene T-cellen with of zonder relevant epitoop specificiteit kan worden gebruikt als extra positieve en negatieve controles. Merk op dat om onbekende redenen, een aantal TCR transgene cellen en hybridoma niet goed kleuren met hun relevante tetrameren.
Onze protocol omvat het gebruik van fluorescerende kralen tellen om te helpen bij de berekening van het aantal cellen. Terwijl cellen kunnen ook handmatig worden bereikt met een hemacytometer vinden we dat het gebruik van tellen kralen tot veel grotere experimentele precisie, vooral als meerdere onderzoekers betrokken zijn. Vanwege de kleine aantallen en volumes van cellen die worden behandeld in dit protocol, moet het minimaliseren van de experimentele fout zijn een hoge prioriteit.
Tetrameer kleuring Geschikt cel fixatie en permeabilisatie en diverse studies met succes geanalyseerd intracellulaire cytokine en transcriptie factor expressie in cellen na tetrameer gebaseerde cel verrijkingscocktail 20,21.De extra stappen die bijdragen tot extra verliezen cel in de monsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Andre Han en Lawrence Yen voor technische bijstand, en leden van de Jenkins lab bedanken voor hulp bij de ontwikkeling van dit protocol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PE or APC conjugated pMHC tetramer (or multimer) | Made by investigator, obtained from the NIH tetramer core, or purchased from commercial sources | ||
| Anti-PE conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | |
| Anti-APC conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
| LS magnetic columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MidiMACS or QuadroMACS magnet | Miltenyi | 130-042-302 or 130-090-976 | |
| Cell counting beads | Life Technologies | PCB-100 |
References
- Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. Laboratory analysis of T-cell immunity. Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).
- Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo. Immunity. 1, 327-339 (1994).
- Moon, J. J. Tracking epitope-specific T cells. Nat Protoc. 4, 565-581 (2009).
- Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance. Science. 312, 114-116 (2006).
- Marzo, A. L. Initial T cell frequency dictates memory CD8+ T cell lineage commitment. Nat Immunol. 6, 793-799 (2005).
- Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nature reviews. Immunology. 11, 551-558 (2011).
- Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
- Seah, S. G. The linear range for accurately quantifying antigen-specific T-cell frequencies by tetramer staining during natural immune responses. European Journal of Immunology. 41, 1499-1500 (2011).
- Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection. Immunity. 28, 859-869 (2008).
- Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
- Pittet, M. J. Alpha 3 domain mutants of peptide/MHC class I multimers allow the selective isolation of high avidity tumor-reactive CD8 T cells. Journal of Immunology. 171, 1844-1849 (2003).
- Choi, E. M. High avidity antigen-specific CTL identified by CD8-independent tetramer staining. Journal of Immunology. 171, 5116-5123 (2003).
- Chu, H. H. Positive selection optimizes the number and function of MHCII-restricted CD4+ T cell clones in the naive polyclonal repertoire. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11241-11245 (2009).
- Chu, H. H., Moon, J. J., Kruse, A. C., Pepper, M., Jenkins, M. K. Negative Selection and Peptide Chemistry Determine the Size of Naive Foreign Peptide-MHC Class II-Specific CD4+ T Cell Populations. J Immunol. 185, 4705-4713 (2010).
- Legoux, F. Impact of TCR reactivity and HLA phenotype on naive CD8 T cell frequency in humans. J Immunol. 184, 6731-6738 (2010).
- Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K., Hasan, M., Albert, M. L. Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies. Blood. 115, 3718-3725 (2010).
- Kwok, W. W. Frequency of Epitope-Specific Naive CD4+ T Cells Correlates with Immunodominance in the Human Memory Repertoire. Journal of Immunology. 188, 2537-2544 (2012).
- Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands. Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).
- Matechak, E. O., Killeen, N., Hedrick, S. M., Fowlkes, B. J. MHC class II-specific T cells can develop in the CD8 lineage when CD4 is absent. Immunity. 4, 337-347 (1996).
- Burchill, M. A. Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire. Immunity. 28, 112-121 (2008).
- Pepper, M. Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells. Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).
