Summary
Detta protokoll beskriver användningen av peptid: MHC tetramerer och magnetiska mikropärlor att isolera lågfrekventa populationer av epitop-specifika T-celler och analysera dem genom flödescytometri. Denna metod möjliggör direkta studier av endogena T-cell populationer av intresse från
Abstract
En grundläggande nödvändighet för forskare som studerar adaptiv immunitet med in vivo experimentella modeller är en förmåga att identifiera T-celler baserat på deras T-cell antigenreceptor (TCR) specificitet. Många indirekta metoder är tillgängliga i vilken en bulkpopulation av T-celler stimuleras in vitro med ett specifikt antigen och epitop-specifika T-celler identifieras genom mätning av en funktionell respons, såsom proliferation, cytokinproduktion, eller uttryck av aktiveringsmarkörer 1. Dessa metoder identifierar endast epitop-specifika T-celler som uppvisar en av många möjliga funktioner, och de är inte tillräckligt känsliga för att detektera epitop-specifika T-celler vid naiva föregångare frekvenser. Ett populärt alternativ är TCR transgena adoptiv överföring modell, där monoklonala T-celler från en TCR transgen mus ympas in histokompatibla värdar för att skapa en stor föregångare population av epitop-specifika T-celler som kan EASIly spåras med användning av en markör kongena antikropp 2,3. Medan kraftfull, lider denna metod från experimentella artefakter associerade med ofysiologisk frekvensen av T-celler med specificitet för en enda epitop 4,5. Dessutom kan detta system inte användas för att undersöka den funktionella heterogeniteten hos epitop-specifika T-cellkloner i en polyklonal population.
Det bästa sättet att studera adaptiv immunitet bör omfatta direkt detektion av epitop-specifika T-celler från den endogena T-cell repertoar med en metod som skiljer TCR specificitet endast av dess bindning till besläktade peptid: MHC (pMHC) komplex. Användningen av pMHC tetramerer och flödescytometri åstadkommer detta 6, men är begränsad till detektering av högfrekventa populationer av epitop-specifika T-celler endast finns följande antigeninducerad klonal expansion. I detta protokoll beskriver vi en metod som samordnar användningen av pMHC tetramerer och magnetic cells anrikning teknik för att möjliggöra detektering av extremt lågfrekventa epitop-specifika T-celler från mus lymfvävnader 3,7. Med denna teknik kan man spåra heltäckande hela epitopspecifika populationer av endogena T-celler i möss i alla skeden av immunsvaret.
Protocol
1. Cell Isolering från lymfoidvävnad
- Tillsätt 1 ml iskall cEHAA (EHAA + 10% FBS, pen / strep, gentamycin, 2 mM L-glutamin, 55 mM 2-merkaptoetanol) eller annan motsvarande T-cell-medium, till en 60 mm odlingsskål innehållande en liten fyrkant av 100 nm nylonnät och placera på is.
- Euthanize musen.
- Ta bort mjälten och lika många lättillgängliga lymfkörtlar som möjligt. Dessa bör omfatta åtminstone inguinal, armhålan, brachialis, livmoderhalscancer och kröslymfknutor. Placera dem ovanpå nylonnät i odlingsskålen.
- Med den platta toppen av en sluten 1,5 ml mikrofugrör, den lymfoida vävnaden försiktigt mäsk över nylonnät att frigöra lymfocyter. Lägga till ytterligare 1 ml cEHAA och pipett upp och ner för att arbeta celler i en suspension. Överför celler genom en annan del av nylonnät placerat över toppen av en 15 ml polypropylen centrifugrör. Skölj skålen och mesh med ytterligare 1 ml iskall cEHAA, pooling volymerna i samma rör. Upprepa för att uppnå en slutlig volym cellsuspension av 4 ml.
- Lägg kall sorterare buffert (PBS + 2% FBS, 0,05% azid) till en slutlig volym av 15 ml och röret centrifugeras i 5 minuter vid 300 xg, 4 ° C.
- Försiktigt aspirera supernatanten, se till att inga droppar av vätska kvar på sidorna av röret. Resuspendera cellpelleten i Fc-blocket (sorterare buffert + 2.4G2-antikropp) till en slutlig volym som är lika med ungefär två gånger den hos själva pelleten. Till exempel, producerar mjälte och lymfkörtlar hos en naiv mus vanligtvis en cellpellet av ca 100 | il. I detta fall, tillsätt 100 pl Fc-block för att bringa volymen till 200 | il. Om en stor grad av cell hopklumpning har inträffat, försiktigt bort cellen klumpar vid denna punkt med en pipett spets.
2. Tetramer färgning
- Lägg PE-eller APC-märkt pMHC-tetramer till en slutlig koncentration av 10 nM (eller empiriskt optimerad koncentration).
- Blanda och inkubatorte under 1 timme vid rumstemperatur (eller empiriskt optimerad tid och temperatur).
- Lägg kall sorterare buffert till en volym av 15 ml och röret centrifugeras i 5 minuter vid 300 xg, 4 ° C. Håll prover på is eller vid 4 ° C från och med nu.
- Försiktigt aspirera supernatanten, se till att inga droppar av vätska kvar på sidorna av röret. Resuspendera cellpelleten i sorterare buffert till en slutlig volym av 200 | il. För dubbel tetramer anrikning, resuspendera till en slutlig volym av 150 | il.
3. Magnetisk Anrikning
- Lägg 50 il Miltenyi anti-PE eller anti-APC mikrokulor. För dubbel tetramer anrikning, tillsätt 50 ul av båda.
- Blanda och inkubera under 20 min vid 4 ° C.
- Lägg kall sorterare buffert till en volym av 15 ml och röret centrifugeras i 5 minuter vid 300 xg, 4 ° C.
- Medan du väntar, inrätta ett Miltenyi LS magnetisk spalt på en MidiMACS eller QuadroMACS magnet. Placera ett öppet 15 ml tub polypropylen centrifug pårack direkt under kolonnen.
- Tillsätt 3 ml sorterare buffert till toppen av kolonnen, så att den kan rinna in i 15 ml rör.
- Placera en 100 um kvadrat nylonnät på toppen av kolonnen.
- När cellerna har slutat snurra försiktigt aspirera supernatanten och suspendera pelleten i 3 ml sorterare buffert.
- Överför cellsuspensionen genom nylonnät på toppen av kolonnen.
- När cellsuspensionen fullständigt har runnit in i kolonnen, skölj det ursprungliga röret med ytterligare 3 ml sorterare buffert och överför bufferten genom nylonnät i kolonnen, sköljning nätet i processen. Kasta nylonnät.
- När bufferten är helt har runnit in i kolonnen, lägga till ytterligare 3 ml sorterare buffert till kolonnen.
- Upprepa steg 10 för sammanlagt 3 x 3 ml tvättningar.
- Avlägsna kolonnen från magneten och plats över en ny 15 ml polypropylen centrifugrör.
- Tillsätt 5 ml av buffert sorterare till than kolonn.
- Sätt omedelbart in kolven i toppen av kolonnen och i en kontinuerlig rörelse, tryck in kolven hela vägen ner, vilket tvingar bufferten ut kolumnen i röret.
- Centrifugera rören innehållande den eluerade bundna fraktionen och genomflödet obundna fraktionen under 5 min vid 300 xg, 4 ° C.
- Försiktigt aspirera supernatanten från den bundna fraktionen, se till att inga droppar av vätska kvar på sidorna av röret. Resuspendera cellpelleten i sorterare buffert till en slutlig volym av exakt 95 pl. Aspirera och återsuspendera den obundna fraktionen till en slutlig volym av 2 ml.
4. Flödescytometri
- För varje fraktion, avlägsna 5 pl och tillsätt till 200 pl räkna pärlor (justerad till en koncentration av 200.000 / ml i sorterare buffert) i en 5 ml FACS-rör. Ställ åt sidan vid 4 ° C för analys senare. För att spara tid kan pärlor förväg alikvoteras till märkta rör innan experimentet.
- Förbered amaster blandning av antikroppar för att färga ytmarkörer på cellerna (tabell 1). För att spara tid, kan detta göras före starten av experimentet.
- För den bundna fraktionen, tillsätt en dos av antikropp cocktail direkt till ~ 90 | il celler i röret. Om en analys av den obundna fraktionen önskas, överföra 90 pl celler till en 5 ml FACS rör och tillsätt en dos av antikropp cocktail.
- Inrätta en panel av enfärgade ersättning kontroller för flödescytometern. För varje fluorokrom som skall användas, blanda 50 pl överblivna celler obundna fraktionen i en 5 ml FACS-rör med 1 pl av anti-CD4-antikropp konjugerad till motsvarande fluorokromen. Kom ihåg att inrätta en ofärgade kontroll också.
- Skaka och inkubera alla prover under 30 min vid 4 ° C.
- Tillsätt 5 ml av sorterare buffert till varje rör och centrifugera under 5 min vid 300 xg, 4 ° C.
- För den bundna fraktionen, försiktigt aspirera supernatanten och resuspendera cellerna i 200 pl sorterare BUFfer. Överför cellerna i en 1,2 ml FACS mikrorör. Skölj röret med ytterligare 200 pl sorterare buffert och poolen i samma mikrorör. Om cellklumpar är uppenbara, passera cellerna genom ett 50 pm filter.
- För den obundna fraktionen och kontroll ersättning, dekantera eller aspirera supernatanten och återsuspendera i 2 ml buffert sorterare.
- Ställ in flödescytometern med hjälp av enfärgade ersättning kontroller. Välj sidospridning-bredd (SSC-W) som en extra parameter som skall registreras.
- Analysera de färgade proverna med användning av en sekvens av successiva integration grindar för att identifiera CD4 + eller CD8 + T-celler såsom visas i figurerna 1 och 2. För bundna fraktioner, samla så många celler som möjligt upp till maximalt 2.000.000 totalt händelser. För obundna fraktioner, samla 1.000.000 totalt händelser. Håll förvärvet takt eller under 3.000 händelser per sekund.
- Med hjälp av samma maskininställningarna, analysera räknar pärla prover. Samla 10.000 totalt händelser. </ Li>
- Spara alla data som FCS-filer.
5. Dataanalys
- Analysera FCS datafiler för att räkna pärla prover med FlowJo programvara. Tomt framåtspridning av FITC och ange en grind aroung räknar pärlor (se figur 1 och 2). Fastställa det totala antalet kulor räkna detekteras i varje prov. Subtrahera från det totala antalet insamlade händelser att bestämma antalet celler insamlade händelser.
- Beräkna det totala antalet av alla celler i varje prov med användning av ekvationerna beskrivs i ruta 1.
- Analysera FCS datafiler för de färgade bundna och obundna fraktionen prover. Inrätta en sekvens av successiva integration grindar för att identifiera lymfoid +, sida-scatter-bredd lo, dumpa-, CD3 +, CD4 + eller CD8 +, tetramer + T-celler i varje prov såsom visas i fig 1 och 2.
- Multiplicera det totala antalet celler i provet genom frekvenserna av varje integration grindarna som används för att definiera CD4 + tetramer+ Eller CD8 + tetramer + celler för att beräkna det totala antalet epitop-specifika T-celler (ruta 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den pMHC tetramer baserade celler anrikning metod som presenteras i detta protokoll är ett kraftfullt verktyg för att studera epitop-specifika T-celler från endogena T-cell repertoar. Användningen av pMHC tetramerer möjliggör detektion av epitop-specifika T-celler som direkt på förmågan hos sina TCR att binda besläktade pMHC ligander. Anrikningen ger en nivå av känslighet så att extremt sällsynta populationer av antigen-specifika T-celler kan detekteras från endogena repertoarer av T-celler utan någon manipulation av deras genetiska sammansättning eller prekursor frekvens. Som ett resultat, gör denna teknik utredaren att direkt spåra endogena antigen-specifika T-cell populationer från in vivo experimentella system från sina naiva nivåer genom alla skeden av immunsvaret.
Detta protokoll har optimerats för användning av pMHC klass II (pMHCII) tetramerer att berika epitopspecifika CD4 + T-celler från den sekundära lymfoida organs av möss. Emellertid är tekniken också tillämpas till pMHC klass I (pMHCI) tetramerer och CD8 + T-celler 9. Till skillnad från CD4 spelar CD8 coreceptor en viktig roll för att stabilisera TCR-MHC interaktioner, och detta kan få praktiska konsekvenser för pMHCI tetramer färgning 10. Framför allt bör användningen av CD8-antikroppar begränsas till kloner som inte försämrar CD8-tetramer bindning, och de bör läggas till celler efter tetramer färgning. I själva verket har vissa pMHCI tetramerer har konstruerats med muterade MHCI-CD8 bindningsställen för att mildra ospecifik bindning till CD8 + T-celler 11,12.
Tetramer koncentration, inkubationstid och inkubationstemperatur hög grad kan påverka effektiviteten i tetramer färgning och villkor bör optimeras för att uppnå den bästa kombinationen av hög tetramer signal, låg bakgrundssignal, låg tetramer internalisering, och minimala förändringar cellfysiologi. Helst dessa villkor bör Be bestämmas empiriskt för varje unik reagens. I våra händer, dock, tillhandahåller en slutlig koncentration av 10 nM och en inkubation av 1 h vid rumstemperatur goda allmänna villkor för de flesta pMHCI eller pMHCII tetramerer. I allmänhet, pMHCI tetramerer verkar färga lättare än pMHCII tetramerer, och färgning kan ofta utföras vid 4 ° C under så lite som 30 minuter.
Omfattningen av denna procedur är lämpad för analys av nästan alla de sekundära lymfoida organen hos en mus i ett enda prov. Därför representerar varje prov en ganska omfattande analys av hela cirkulerande perifera T-cell repertoar av en mus. Epitop-specifika T-celler kan också anrikas från andra relevanta vävnaderna, inklusive tymus 13,14. När thymii 4 till 5 veckor gamla möss analyseras, kan epitop-specifika enstaka positiva tymocyter detekteras vid siffror liknande de för perifera naiva T-celler. Epitop-specifika dubbel-positiva tymocyter,emellertid, är mycket svåra att upptäcka på grund av deras låga halter av TCR uttryckning.
Detta protokoll kan också anpassas för att detektera epitop-specifika humana CD4 + eller CD8 + T-celler i blod eller andra vävnader 15-17. Frekvensen av epitop-specifika T-celler är ungefär lika mellan möss och människor 17, så att analysen av 50 till 100 ml blod skulle ge motsvarande antal epitop-specifika T-celler som den poolade mjälte och lymfkörtlar hos en mus 18.
En stor utmaning i flödescytometrisk analys av celler efter tetramer-baserade anrikning är utmärkande sant cell händelser från bakgrunden. Detta beror till stor del på att många autofluorescerande celler är också icke-specifikt berikad under processen. Om inte noggrant gated ut, kan dessa autofluorescerande celler visas som falska tetramer-positiva celler och kasta bort noggrannheten av analysen, särskilt när det gäller sällsynta naiva T-cell populations. Vår protokoll använder en två-stegs slussning strategi där CD3 + händelser är först gated ifrån dumpa härstamning + händelser och sedan CD4 + händelser är gated ifrån CD8 +-händelser. I processen, autofluorescerande celler, som tenderar att ligga utmed centrum diagonalen hos en FACS tomt, grindas ut av analysen i två iterativa steg. Ett effektivt avlägsnande av autofluorescerande händelser kommer på bekostnad av många fluorescerande färger, så vi rekommenderar att använda flödescytometrar kan minst 6 fluorescerande parametrar.
De flesta pMHC tetramerer är konjugerade till PE och APC på grund av ljusstyrka dessa fluorokromer, och anti-PE och anti-APC magnetiska mikrokulor är lätt tillgängliga för att möjliggöra anrikning med dem. Emellertid kan andra fluorokromer också användas så länge som motsvarande magnetiska mikropärlor finns tillgängliga. I själva verket kan flera tetramerer med olika fluorokrommängder märkning användas tillsammans med motsvarande antikropp-konjugerad mikrofonrobeads att samtidigt berikar flera epitop-specifika T-cellpopulationer från samma prov. Vi har beskrivit ett mycket grundläggande antikropp-fluorokrom installation som är optimerad för användning av PE-och APC-märkta tetramerer (tabell 1), men många andra effektiva kombinationer är möjliga att öka flexibiliteten i studiet av fenotypiska markörer.
CD8 + T-cellpopulationer kan användas som en intern negativ kontroll, eftersom de inte bör binda till pMHCII ligander (och vice versa för epitop-specifika CD8 + T-cell anrikning). Frekvensen av tetramer + CD8 +-celler i ett prov ger en bra bedömning av graden av bakgrunden tetramer färgning, men ärligt uppsåt tetramer-positiva CD8 + T-celler med över begränsad specificitet för pMHCII epitoper kan finnas på mycket små frekvenser 19. Ibland under mycket starka immunsvar, kan dessa celler existerar på expanderade frekvenser. Om så önskas, TCR transgena T-celler with eller utan relevanta epitopspecificitet kan användas som ytterligare positiva och negativa kontroller. Observera att av okänd anledning, har vissa TCR transgena celler och hybridom inte fläcken bra med relevanta tetramerer.
Vår protokoll innefattar användning av fluorescerande pärlor räkna att bistå i beräkningen av cellantal. Medan celler kan också uppnås manuellt med en hemacytometer finner vi att användningen av räkna pärlor resulterar i mycket större experimentell precision, speciellt när flera utredare är inblandade. På grund av de små mängder och volymer av celler som hanteras i detta protokoll bör minimering av experimentella fel att vara en hög prioritet.
Tetramer-färgning är kompatibel med cell-fixering och permeabilisering, och flera studier har framgångsrikt analyserats intracellulär cytokin och transkriptionsfaktor expression i celler efter tetramer-baserade cell-anrikning 20,21.Emellertid, de extra inblandade steg bidrar till ytterligare cellförluster i proverna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Andre Han och Lawrence Yen för tekniskt bistånd, och medlemmar av Jenkins labbet för att få hjälp i utvecklingen av detta protokoll.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PE or APC conjugated pMHC tetramer (or multimer) | Made by investigator, obtained from the NIH tetramer core, or purchased from commercial sources | ||
| Anti-PE conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | |
| Anti-APC conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
| LS magnetic columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MidiMACS or QuadroMACS magnet | Miltenyi | 130-042-302 or 130-090-976 | |
| Cell counting beads | Life Technologies | PCB-100 |
References
- Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. Laboratory analysis of T-cell immunity. Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).
- Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo. Immunity. 1, 327-339 (1994).
- Moon, J. J. Tracking epitope-specific T cells. Nat Protoc. 4, 565-581 (2009).
- Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance. Science. 312, 114-116 (2006).
- Marzo, A. L. Initial T cell frequency dictates memory CD8+ T cell lineage commitment. Nat Immunol. 6, 793-799 (2005).
- Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nature reviews. Immunology. 11, 551-558 (2011).
- Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
- Seah, S. G. The linear range for accurately quantifying antigen-specific T-cell frequencies by tetramer staining during natural immune responses. European Journal of Immunology. 41, 1499-1500 (2011).
- Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection. Immunity. 28, 859-869 (2008).
- Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
- Pittet, M. J. Alpha 3 domain mutants of peptide/MHC class I multimers allow the selective isolation of high avidity tumor-reactive CD8 T cells. Journal of Immunology. 171, 1844-1849 (2003).
- Choi, E. M. High avidity antigen-specific CTL identified by CD8-independent tetramer staining. Journal of Immunology. 171, 5116-5123 (2003).
- Chu, H. H. Positive selection optimizes the number and function of MHCII-restricted CD4+ T cell clones in the naive polyclonal repertoire. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11241-11245 (2009).
- Chu, H. H., Moon, J. J., Kruse, A. C., Pepper, M., Jenkins, M. K. Negative Selection and Peptide Chemistry Determine the Size of Naive Foreign Peptide-MHC Class II-Specific CD4+ T Cell Populations. J Immunol. 185, 4705-4713 (2010).
- Legoux, F. Impact of TCR reactivity and HLA phenotype on naive CD8 T cell frequency in humans. J Immunol. 184, 6731-6738 (2010).
- Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K., Hasan, M., Albert, M. L. Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies. Blood. 115, 3718-3725 (2010).
- Kwok, W. W. Frequency of Epitope-Specific Naive CD4+ T Cells Correlates with Immunodominance in the Human Memory Repertoire. Journal of Immunology. 188, 2537-2544 (2012).
- Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands. Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).
- Matechak, E. O., Killeen, N., Hedrick, S. M., Fowlkes, B. J. MHC class II-specific T cells can develop in the CD8 lineage when CD4 is absent. Immunity. 4, 337-347 (1996).
- Burchill, M. A. Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire. Immunity. 28, 112-121 (2008).
- Pepper, M. Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells. Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).
