Summary
Este protocolo descreve o uso de péptido: MHC tetrâmeros e microesferas magnéticas para isolar populações de baixa frequência de células T específicas para epitopo e analisá-las por citometria de fluxo. Este método permite o estudo direto de endógenos populações de células T de interesse de
Abstract
Uma necessidade básica para os investigadores que estudam a imunidade adaptativa com modelos experimentais in vivo é a capacidade de identificar as células T com base no seu receptor de células T de antigénio (TCR) especificidade. Muitos métodos indirectos estão disponíveis em que uma população a granel de células T é estimulada in vitro com um antigénio específico e células T específicas do epítopo são identificadas através da medição de uma resposta funcional, como a proliferação, a produção de citocinas, ou a expressão de marcadores de activação 1. No entanto, estes métodos apenas identificar as células T específicas para epitopo que exibem uma de muitas possíveis funções, e eles não são suficientemente sensíveis para detectar epítopos específicos de células T naive em frequências precursoras. Uma alternativa popular é o TCR transgénico modelo de transferência adoptiva, em que as células T monoclonais a partir de um ratinho transgénico TCR são semeadas em hospedeiros histocompatibilidade para criar um precursor população grande de células T específicas para epitopos que podem ser easily rastreados com o uso de um anticorpo marcador Congênicos 2,3. Embora poderoso, este método sofre de artefactos experimentais associados não fisiológicas da frequência de células T com especificidade para um único epítopo 4,5. Além disso, este sistema não pode ser utilizado para investigar a heterogeneidade funcional do epítopo específicos clones de células T dentro de uma população policlonal.
A forma ideal para o estudo da imunidade adaptativa deve envolver a detecção directa do epítopo de células T específicas a partir do repertório de células T endógeno, utilizando um método que diferencie a especificidade TCR unicamente pela sua ligação ao péptido cognato: (pMHC) do MHC complexos. O uso de tetrâmeros pMHC e citometria de fluxo realiza esta 6, mas está limitado à detecção de populações de alta frequência de células T específicas para epitopo apenas encontrados a expansão induzida pelo antigénio seguinte clonal. Neste protocolo, descrevemos um método que coordena o uso de tetrâmeros pMHC e magnetic tecnologia de enriquecimento de células para permitir a detecção de frequências extremamente baixas células epítopo T específicas de tecidos de camundongos linfóides 3,7. Com esta técnica, pode-se rastrear exaustivamente inteiras epitopo-populações específicas de células T endógenas em ratinhos em todas as fases da resposta imune.
Protocol
1. Isolamento de células a partir de tecido linfóide
- Adicionar 1 ml de gelo frio cEHAA (EHAA + 10% FBS, pen / strep, gentamicina, 2 mM de L-glutamina, 55 mM 2-mercaptoetanol), ou outro meio equivalente de células T, para uma placa de cultura de 60 milímetros, contendo um pequeno quadrado de 100 malha de nylon fim e colocar no gelo.
- Euthanize mouse.
- Remover o baço e os linfonodos como muitos facilmente acessível quanto possível. Estes devem incluir pelo menos os inguinais, axilares, braquiais, linfonodos cervicais, e mesentérica. Colocá-las em cima da rede de nylon na placa de cultura.
- Utilizando o plano superior de um sistema fechado de tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, suavemente esmagar o tecido linfóide sobre a malha de nylon para libertar os linfócitos. Adicionar 1 ml de uma outra cEHAA e pipeta cima e para baixo para o trabalho de células numa suspensão. Transferir as células através de um outro pedaço de malha de nylon colocada sobre a parte superior de um tubo de centrífuga de 15 ml de polipropileno. Lave o prato e malha com outro 1 ml de gelo frio cEHAA, pooling os volumes no mesmo tubo. Repetir para atingir um volume de suspensão final de células de 4 ml.
- Adicionar tampão classificador frio (PBS + Azida de 2% de FBS, 0,05%) a um volume final de 15 ml e centrifugar o tubo durante 5 minutos a 300 xg, 4 ° C.
- Aspirar o sobrenadante cuidadosamente, certificando-se gotículas de líquido não são deixados sobre os lados do tubo. Ressuspender o sedimento de células em Fc bloco (classificador de tampão + 2.4G2 anticorpo) a um volume final igual a cerca de duas vezes maior que o pellet em si. Por exemplo, os gânglios linfáticos e do baço de um ratinho ingénuo geralmente produz um pelete de células de cerca de 100 uL. Nesse caso, adicionar 100 ul de bloco de Fc para levar o volume para 200 ul. Se um grande grau de aglomeração de células ocorreu, remova cuidadosamente o aglomerado de células neste momento com uma pipeta.
2. Coloração tetrâmero
- Adicionar PE-ou APC-rotulado pMHC tetrâmero para uma concentração final de 10 nM (concentração ou empiricamente optimizados).
- Mix e incubaçãote durante 1 hora à temperatura ambiente (ou a hora empiricamente optimizados e temperatura).
- Adicionar tampão classificador fria até um volume de 15 ml e centrifugar o tubo durante 5 minutos a 300 xg, 4 ° C. Manter as amostras em gelo ou a 4 ° C a partir de agora.
- Aspirar o sobrenadante cuidadosamente, certificando-se gotículas de líquido não são deixados sobre os lados do tubo. Ressuspender o sedimento de células em tampão de classificador para um volume final de 200 ul. Para o enriquecimento de tetrâmero de casal, ressuspender a um volume final de 150 ul.
3. Enriquecimento magnética
- Adicionar 50 ul de microesferas de Miltenyi anti-PE ou anti-APC. Para o enriquecimento de tetrâmero de casal, adicionar 50 ul de ambas.
- Misturar e incubar durante 20 min a 4 ° C.
- Adicionar tampão classificador fria até um volume de 15 ml e centrifugar o tubo durante 5 minutos a 300 xg, 4 ° C.
- Enquanto espera, configurar uma Miltenyi coluna LS magnético em um ímã MidiMACS ou QuadroMACS. Uma posição aberta 15 ml tubo de centrífuga de polipropileno com umacumular diretamente abaixo da coluna.
- Adicionar 3 ml de tampão de classificador para a parte superior da coluna, o que permite que seja drenado para o tubo de 15 ml.
- Coloque um quadrado de 100 um de malha de nylon no topo da coluna.
- Quando as células de ter terminado a fiação, aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 3 ml de tampão de classificador.
- Transferir a suspensão de células através da malha de nylon para o topo da coluna.
- Quando a suspensão de células foi completamente drenada para a coluna, lavar o tubo inicial com um outro de 3 ml de tampão e transferir o classificador de tampão através da malha de nylon para a coluna, lavagem da malha durante o processo. Descarte a malha de nylon.
- Quando o tampão foi completamente drenada para a coluna, adicionar 3 ml de um outro tampão classificador para a coluna.
- Repetir o passo 10 para um total de 3 x 3 ml lavagens.
- Remover a coluna do magnete e local ao longo de um novo tubo de 15 ml de centrífuga de polipropileno.
- Adicionam-se 5 ml de tampão de classificador de tele coluna.
- Imediatamente inserir o êmbolo no topo da coluna e com um movimento contínuo, empurre o êmbolo para baixo, forçando o tampão para fora da coluna dentro do tubo.
- Centrifugar os tubos contendo a fracção eluída ligado e a fracção não ligada por escoamento durante 5 minutos a 300 xg, 4 ° C.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante a partir da fracção ligada, certificando-se gotículas de líquido não são deixados sobre os lados do tubo. Ressuspender o sedimento de células em tampão de classificador para um volume final de 95 ul exactamente. Aspirar e ressuspender a fracção não ligada a um volume final de 2 ml.
4. Citometria de Fluxo
- Para cada fracção, remover e adicionar 5 ul a 200 ul de pérolas de contagem (ajustada para uma concentração de 200,000 / ml em tampão sorter) em um tubo de 5 ml de FACS. Separe a 4 ° C para análise posterior. Para poupar tempo, os grânulos podem ser pré-aliquotadas para tubos marcados antes do início da experiência.
- Prepare amaster mistura de anticorpos para marcadores de superfície de manchar as células (Tabela 1). Para poupar tempo, isto pode ser feito antes do início da experiência.
- Para a fracção ligada, adicionar uma dose de cocktail de anticorpos directamente para o ~ 90 ul de células no tubo. Se a análise da fracção não ligada é desejada, transferir 90 ul de células para um tubo de 5 ml de FACS e adicionar uma dose de cocktail de anticorpos.
- Criação de um painel de controles de cor única compensação para o citômetro de fluxo. Para cada fluorocromo a ser utilizado, misturar 50 ul de células não ligadas que tenham ficado fracção num tubo de 5 ml de FACS com 1 ul de anticorpo anti-CD4 conjugado com o fluorocromo correspondente. Lembre-se de configurar um controle sem manchas também.
- Agitar em vórtice e incubar as amostras durante 30 min a 4 ° C.
- Adicionam-se 5 ml de tampão de classificador a cada tubo e centrifugar durante 5 minutos a 300 xg, 4 ° C.
- Para a fracção ligada, aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender as células em 200 ul de buf classificadorfer. Transferir as células para um microtubo de 1,2 ml de FACS. Enxaguar o tubo com outro ul de tampão 200 e separador de piscina para o microtubo mesmo. Se aglomerados de células são evidentes, passar as células através de um filtro ^ M 50.
- Para a fracção livre e controles de compensação, decantar ou aspirar o sobrenadante e ressuspender em tampão classificador 2 ml.
- Configure o citômetro de fluxo, utilizando os controles de cor única compensação. Selecione lado dispersão de largura (SSC-W) como parâmetro adicional a ser gravado.
- Analisar as amostras coradas utilizando uma sequência de sucessivas portas de inclusão para identificar células CD4 + ou CD8 +, como ilustrado nas Figuras 1 e 2. Para frações encadernados, coletar células como muitos como possível até um máximo de 2.000.000 total de eventos. Para fracções não ligadas, recolher 1.000.000 total de eventos. Manter a velocidade de aquisição em ou abaixo de 3000 eventos por segundo.
- Usando as configurações da máquina mesmo, analisar as amostras de contagem de contas. Colete 10.000 total de eventos. </ Li>
- Guarde todos os dados como arquivos FCS.
5. Análise de Dados
- Analisar os arquivos de dados de FCS para as amostras de contagem de contas usando o software FlowJo. Dispersão trama para frente por FITC e definir uma porta aroung os colares de contas (ver Figuras 1 e 2). Determinar o número total de pérolas de contagem detectadas em cada amostra. Subtrair a partir do número total de eventos recolhidos para determinar o número de eventos celulares recolhidos.
- Calcula-se o número total de todas as células em cada amostra, utilizando as equações descritas no Quadro 1.
- Analisar os arquivos de dados para os FCS manchadas amostras fração associados e não associados. Defina-se uma sequência de sucessivas portas de inclusão para identificar + linfóide, do lado de dispersão de largura de eis-despejo, CD3 +, CD4 + ou CD8 +, células tetrâmero + T em cada uma das amostras tal como é ilustrado nas Figuras 1 e 2.
- Multiplicar o número total de células na amostra por as frequências de cada um dos portões de inclusão usados para definir CD4 + tetrâmero+ Ou CD8 + + tetrâmero células para calcular o número total de células T específicas do epítopo (Quadro 1).
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Representative Results
A Figura 1 mostra gráficos representativos de fluxo de citometria de pMHCII baço enriquecida tetrâmero e amostras de nódulos linfáticos de ratinhos ingénuos, enquanto que a Figura 2 mostra os dados representativos dos ratos anteriormente imunizados com o péptido relevante + CFA. Gating Serial remove autofluorescente e outros eventos indesejados a partir da análise das células T CD4 + populações de células T. A CD8 + da população de células T serve como um controlo interno útil negativa para pMHCII coloração tetrâmero de células T CD4 +. Note-se que frações encadernados do enriquecimento geralmente contêm uma proporção significativamente maior de células autofluorescente que as fracções não ligadas, fazendo gating mais desafiador.
Números absolutos de células epitopo T específicas de uma amostra são calculados multiplicando o número total de todas as células na fracção ligada da amostra enriquecida, tal como determinado a partir da análise de contagem de grânulo, com a proporção destas células, que são + tetrâmero, como determinaçãoNed a partir da análise de coloração celular (Quadro 1).
Para o rato ingénuo na Figura 1, a concentração de todas as células na fracção ligada da amostra é (4411/5589) (200.000) (0.200/0.005) = 6,31 x 10 6 / ml. O número total de todas as células na amostra é (6,31 x 10 6 / ml) (0,095) = 6,00 x 10 5. Finalmente, o número total de epitopos específicos de células T CD4 + é (6,00 x 10 5) (41,5%) (96,6%) (10,2%) (62,3%) (0,64%) = 98.
Para o rato imunizado na Figura 2, a concentração de todas as células na fracção ligada da amostra é (6410/3590) (200.000) (0.200/0.005) = 1,43 x 10 7 / ml. O número total de todas as células na amostra é (1,43 x 10 7 / ml) (0,095) = 1,36 x 10 6. Finalmente, o número total de epitopos específicos de células T CD4 + é (1,36 x 10 6) (40,9%) (93,9%) (9,54%) (72,0%) (42,7%) = 1,53 x 10 4 </ Strong>.
A eficiência das reduções de enriquecimento como o número de células T específicas para epitopo aumenta 8, então as células tetrâmero + pode ser visto na fracção não ligada das amostras contendo frequências muito elevadas de células T específicas do epítopo. Em tais casos, o número de células T específicas para epitopos presentes na fracção não ligada pode ser calculado separadamente e adicionadas ao número encontrado na fracção ligada. Assim, na Figura 2, a concentração de todas as células da fracção não ligada da amostra é (9031/969) (200.000) (0.200/0.005) = 7,46 x 10 7 / ml, o número total de todas as células é (7,46 x 10 7 / ml) (2,0) = 1,49 x 10 8, e o número total de epitopos específicos de células T CD4 + é (1,49 x 10 8) (62,7%) (96,4%) (44,5%) (54,7%) (0,0409 %) = 8,97 x 10 3. Somando os números das frações associados e não associados, existem 1,53 x 10 4 + 8,97 x 10 3 = 2,43 x10 4 Total epítopo específicos células T CD4 + em toda a amostra. Com efeito, se um epitopo específico de expansão celular é suficientemente robusta, o processo de enriquecimento pode ser ignorada.
| Fluorocromo | Anticorpo |
| Pacific Blue | dump (B220, CD11b, CD11c, F4/80) |
| Pacífico Laranja | CD8 |
| FITC | CD3 |
| PE | pMHC tetrâmero ou marcador fenotípico |
| PerCP | CD4 |
| APC | pMHC tetrâmero ou marcador fenotípico |
| AlexaFluor 700 | CD44 |
Tabela 1. Estratégia sugerida coloração de anticorpos
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Figura 1. Análise citométrica de epítopo específicos células T CD4 + em ratinhos ingénuos seguintes pMHCII enriquecimento tetrâmero com base. Parcelas representativas são mostrados para os encadernados (A) e livre (B) frações. Uma sucessão de portas são definidas para selecionar dispersão de linfóide +, lado scatter-widthlo, despejo, CD3 + eventos. Destes, CD4 + ou CD8 + são gated eventos para a análise das células T específicas do epítopo ou de coloração de fundo. Alíquotas de células não coradas do limite (C) e não associados fração (D) foram misturados com fluorescentes colares de contas e analisados separadamente. Clique aqui para ver maior figura .
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Figura análise de fluxo 2. Citometria de epítopo específicos células T CD4 + em ratinhos imunizados com péptidos seguintes pMHCII enriquecimento tetrâmero com base. Parcelas representativas são mostrados para os encadernados (A) e livre (B) frações. Uma sucessão de portas são definidas para selecionar dispersão de linfóide +, lado scatter-widthlo, despejo, CD3 + eventos. Destes, CD4 + ou CD8 + são gated eventos para a análise das células T específicas do epítopo ou de coloração de fundo. Alíquotas de células não coradas do limite (C) e não associados fração (D) foram misturados com fluorescentes colares de contas e analisados separadamente. Clique aqui para ver maior figura .
Quadro 1. Cálculo do epitopo de células T específicas de números
Números absolutos de células T específicas para epitopo são melhor calculado com o auxílio de esferas fluorescentes de contagem. Uma alíquota de unstainedAs células de cada amostra é misturada com um volume definido de contagem grânulos fixados a uma concentração conhecida e, em seguida, analisadas por citometria de fluxo. A concentração de células na amostra pode ser inferida a partir de uma comparação da sua frequência, com a concentração conhecida de contas fluorescentes de contagem.
O número total de células na amostra é então calculada multiplicando a concentração de células com o volume total da amostra.
O número total de epitopos específicos de células T em que a amostra é simplesmente o número total de todas as células na amostra multiplicado pela percentagem de células que são tetrero-positivas.
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Discussion
O pMHC tetrâmero método de enriquecimento baseado célula apresentada por este protocolo é uma ferramenta poderosa para estudar epítopo-específicas células T de endógenos repertórios de células T. O uso de tetrâmeros pMHC permite a detecção de células T específicas para epitopo diretamente dependente da capacidade dos seus TCR se ligar ligandos cognatos pMHC. O enriquecimento fornece um nível de sensibilidade de modo que as populações extremamente raros de células T específicas de antigénio pode ser detectado a partir de repertórios endógenos de células T sem qualquer manipulação da sua composição genética ou a frequência do precursor. Como resultado, esta técnica permite ao investigador para rastrear directamente endógenos específicos de antigénios a partir de populações de células T in vivo a partir de sistemas experimentais seus níveis naive através de todas as fases da resposta imunitária.
Este protocolo foi optimizado para a utilização de pMHC de classe II (pMHCII) tetrâmeros para enriquecer epítopo específicos células T CD4 + a partir do órgão linfóide secundários de ratos. No entanto, a técnica é também aplicável aos tetrâmeros (pMHCI) pMHC de classe I e CD8 + 9. Ao contrário de CD4, o co-receptor CD8 desempenha um papel importante na estabilização de TCR-MHC interacções, e isto pode ter implicações práticas para pMHCI coloração tetrâmero 10. Mais notavelmente, a utilização de anticorpos CD8 deve ser restringida a clones que não prejudiquem CD8-tetrâmero de ligação, e estes devem ser adicionados a células após coloração tetrâmero. Na verdade, alguns tetrâmeros pMHCI foram projetados com mutantes MHCI-CD8 locais de ligação para a ligação não específica para atenuar células T CD8 + 11,12.
Tetrâmero concentração, tempo de incubação, incubação e temperatura podem afetar significativamente a eficiência de coloração tetrâmero e condições devem ser otimizados para atingir a melhor combinação de sinal tetrâmero alta, sinal de fundo baixo, a interiorização tetrâmero baixo, e alterações mínimas fisiologia celular. Idealmente, estas condições deve be empiricamente determinada para cada reagente único. Nas nossas mãos, no entanto, uma concentração final de 10 nM e uma incubação de 1 h à temperatura ambiente, fornece boas condições genéricas para a maioria dos tetrâmeros pMHCI ou pMHCII. Em geral, os tetrâmeros pMHCI parecem mancha mais facilmente do que os tetrâmeros pMHCII e coloração pode muitas vezes ser realizada a 4 ° C por menos de 30 min.
A escala deste procedimento é adequado para a análise de quase todos os órgãos linfóides secundários de um rato em uma única amostra. Por conseguinte, cada uma das amostras representa uma análise bastante abrangente de toda a circulação de repertório de células T periféricas de um rato. As células T específicas do epítopo pode também ser enriquecido a partir de outros tecidos relevantes, incluindo o timo, 13,14. Quando thymii 4-5 semanas de idade, ratinhos são analisados, epítopo específicos individuais timócitos positivos podem ser detectados em números semelhantes aos dos periféricos células T naive. Epítopo específicos duplo-positivos timócitos,no entanto, são muito difíceis de detectar devido aos seus baixos níveis de expressão de TCR.
Este protocolo pode também ser adaptado para detectar epítopos específicos de CD4 + humanas ou células T CD8 + no sangue ou outros tecidos 15-17. A frequência de células T específicas para epitopo é aproximadamente o mesmo entre ratos e humanos 17, para a análise de 50 - 100 ml de sangue produziria números comparáveis de epítopo de células T específicas, como o baço e os gânglios linfáticos reunidas de um rato 18.
Um grande desafio na análise por citometria de fluxo de células seguintes tetrâmero baseada em enriquecimento é distinguir eventos celulares verdadeiras de fundo. Isto é principalmente devido ao fato de que muitas células autofluorescente também são não-especificamente enriquecido durante o processo. Se não fora cuidadosamente fechado, estas células autofluorescente pode aparecer como falsos-positivos células tetrâmero e deitar fora a exactidão da análise, em particular no caso de rara ingénuo célula T populations. O protocolo emprega uma estratégia em duas etapas gating em que os eventos CD3 + é o primeiro fechado longe da linhagem de despejo + eventos, e depois CD4 + são eventos gated longe de CD8 + eventos. No processo, as células autofluorescente, que tendem a se situam ao longo do centro da diagonal de qualquer trama, FACS estão fora gated da análise em dois passos iterativos. A remoção eficaz de eventos autofluorescente vem a custo de muitas cores fluorescentes, por isso recomendamos o uso de citómetros de fluxo capaz de pelo menos 6 parâmetros fluorescentes.
Tetrâmeros mais pMHC são conjugados com PE e APC, devido ao brilho dos fluorocromos, e anti-PE e anti-APC microesferas magnéticas são facilmente disponíveis para permitir o enriquecimento com eles. No entanto, outros fluorocromos também pode ser usado, desde que correspondentes microesferas magnéticas estão disponíveis. Com efeito, tetrâmeros múltiplos com diferentes fluorocromos rótulos podem ser utilizados em conjunto com o microfone de anticorpo-conjugado correspondenterobeads simultaneamente enriquecer vários epítopos específicos de populações de células T a partir da mesma amostra. Nós descrevemos uma configuração muito básica de anticorpos fluorocromo que é optimizado para a utilização de PE-e APC marcadas com tetrâmeros (Tabela 1), mas muitas outras combinações são possíveis eficazes para aumentar a flexibilidade no estudo de marcadores fenotípicos.
CD8 + populações de células T podem ser usadas como um controlo negativo interno, uma vez que eles não devem ligar-se a ligandos pMHCII (e vice-versa para um epitopo específico de enriquecimento de células CD8 + T). A frequência de tetrero + CD8 +, em uma amostra fornece uma boa avaliação do nível de coloração tetrâmero de fundo, apesar de bona fide tetrero-positivas CD8 + com cross-restricted especificidade para epítopos pMHCII podem existir em frequências muito pequenas 19. Ocasionalmente, durante muito fortes respostas imunes, estas células podem existir em frequências expandido. Se desejar, TCR transgênico T sagacidade célulash ou sem especificidade de epítopo relevante pode ser usado como adicionais controlos positivos e negativos. Note-se que, por razões desconhecidas, algumas células TCR transgênicos e hibridomas não mancha bem com seus tetrâmeros relevantes.
O protocolo envolve a utilização de pérolas de contagem fluorescentes para ajudar no cálculo do número de células. Embora as contagens de células também pode ser conseguido manualmente com um hemacitómetro, descobrimos que a utilização de resultados de contagem de grânulos de precisão experimental muito maior, especialmente quando estão envolvidos vários investigadores. Devido ao pequeno número de células e os volumes que são tratados neste protocolo, a minimização do erro experimental deve ser uma alta prioridade.
Coloração tetrâmero é compatível com a célula de fixação e permeabilização, e muitos estudos têm êxito analisados citoquina intracelular e expressão do factor de transcrição em células de tetrâmero com base na sequência de enriquecimento celular 20,21.No entanto, os passos adicionais envolvidos contribuir para perdas celulares adicionais nas amostras.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a André Han e Yen Lawrence para assistência técnica, e os membros do laboratório Jenkins ajuda para o desenvolvimento deste protocolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PE or APC conjugated pMHC tetramer (or multimer) | Made by investigator, obtained from the NIH tetramer core, or purchased from commercial sources | ||
| Anti-PE conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | |
| Anti-APC conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
| LS magnetic columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MidiMACS or QuadroMACS magnet | Miltenyi | 130-042-302 or 130-090-976 | |
| Cell counting beads | Life Technologies | PCB-100 |
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