Summary
Un nuevo método que implica el análisis cuantitativo de FRET (transferencia de energía por resonancia de Förster) señales se describe para el estudio de la cinética de enzimas.
Abstract
Reversibles modificaciones postraduccionales de proteínas con proteínas de ubiquitina o ubiquitina como-(Ubls) son ampliamente utilizados para regular dinámicamente actividad de la proteína y tiene diversas funciones en muchos procesos biológicos. Por ejemplo, SUMO modifica covalentemente un gran número o proteínas con papeles importantes en muchos procesos celulares, incluyendo la regulación del ciclo celular, la supervivencia celular y la muerte, la respuesta de daño del ADN, y la respuesta de estrés 1-5. SENP, como SUMO-proteasa específica, funciona como una endopeptidasa en la maduración de los precursores SUMO o como un isopeptidase para eliminar SUMO de sus proteínas diana y refrescar el ciclo SUMOylation 1,3,6,7.
La eficiencia catalítica o la especificidad de una enzima se caracteriza mejor por la relación de las constantes cinéticas, k cat / K M. En varios estudios, los parámetros cinéticos de SUMO-SENP pares han sido determinados por varios métodos, incluyendo en gel de poliacrilamida basado en western-blot, radIOActive sustrato marcado, compuesto fluorescente o proteína sustrato marcado 8-13. Sin embargo, las técnicas de poliacrilamida-gel a base, que utilizaron los "nativos" de proteínas, pero son laboriosos y técnicamente exigente, que no se prestan a un análisis cuantitativo detallado. La obtenido k cat / K M de estudios usando tetrapéptidos o proteínas con un ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) o AMC (7-amino-4-metilcumarina) fluoróforo eran o bien hasta dos órdenes de magnitud menor que los sustratos naturales o no puede diferenciar claramente las iso-y las actividades de endopeptidasa SENPs.
Ensayos de la proteasa Recientemente, basados en FRET se utilizan para estudiar las enzimas deubiquitinating (DUBs) o SENPs con el par de FRET cian proteína fluorescente (PPC) y la proteína amarilla fluorescente (YFP) 9,10,14,15. La relación de emisión de aceptor de emisión del donante se utiliza como el parámetro cuantitativo para FRET monitor de señal de proteasa acdad determinación. Sin embargo, este método ignora la señal contaminaciones cruzadas en el aceptor y longitudes de onda de emisión por donantes aceptor y donante de auto-fluorescencia y por lo tanto no era correcta.
Hemos desarrollado un novedoso altamente sensible y cuantitativo FRET basada en el ensayo de la proteasa para la determinación de los parámetros cinéticos de pre-SUMO1 maduración por SENP1. Un par de ingeniería FRET CyPet y YPet con mejorado significativamente la eficiencia de FRET y rendimiento cuántico de fluorescencia, se usaron para generar el CyPet-(pre-SUMO1)-YPet sustrato 16. Hemos diferenciado y cuantificados absolutos señales de fluorescencia aportados por el donante y el aceptor y FRET en las longitudes de onda de emisión de aceptor y, respectivamente. El valor de k cat / K M se obtuvo como (3,2 ± 0,55) x 10 7 M -1 s -1 de SENP1 hacia pre-SUMO1, que está de acuerdo con los parámetros generales de cinéticas enzimáticas. Por lo tanto, esta metodología es válida y se puede utilizar unsa Enfoque general para caracterizar otras proteasas también.
Protocol
1. Construcciones de plásmidos
- Amplificar los marcos de lectura abiertos de los genes por PCR, y clonar los productos de PCR en pCRII-TOPO vector.
- Confirmar los productos mediante secuenciación, y clonar el ADNc que codifica CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet SUMO1-, YPet y dominios catalíticos de SENP1 en la pET28 (b) vector con una etiqueta de hexahistidina N-terminal.
2. Expresión y purificación de proteínas
- Transformar células de Escherichia coli de la cepa BL21 (DE3) con pET28 (b) vectores que codifican CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet SUMO1-, YPet y los dominios catalíticos de SENP1.
- Crecido las bacterias transformadas en medio 2xYT durante 3 horas a 37 ° C (con agitación a 250 rpm) hasta alcanzar una densidad óptica de 0,5 a 600 nm.
- Añadir 100 mM isopropil-β-D-tiogalactósido (IPTG) (concentración final) para inducir la expresión de la proteína y agitar durante 16 horas a 25 ° C a 200 rpm.
- Coseche las bacterias por centrifugación a 10.000 rpm a 4 ° C durante 5 min y se resuspenden en un tampón de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 50 mM, y 5 mM de imidazol.
- Sonicar las células durante 10 min en 5-sec intervalos a una potencia de 25 W utilizando MiSonics 4.000 sonicador y recogerlas por centrifugación a 35.000 xg a 4 ° C durante 30 min.
- Configurar la columna con 500 ml de Ni-NTA perlas para el cultivo de L 1 y transferir el sobrenadante a la columna.
- La resina se lava con tampón de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 500 mM, y 10 mM imidazol dos veces.
- Proteína se eluye con tampón de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 500 mM, y 500 mM de imidazol y la diálisis en un tampón de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 50 mM y 1 mM de ditiotreitol (DTT) a 4 ° C durante la noche.
- Determinar las concentraciones de las proteínas purificadas mediante el ensayo de Bradford. Método alternativo para las mediciones de concentración de proteínas será SDS-PAGE electroforesis en gel y después se tiñeron con azul de Coomassie seguido con imágenescuantitativo.
3. Cuantitativo FRET análisis de espectro
- La estrategia general para el ensayo FRET se basa en la señalización (Figura 1). El par de FRET, CyPet y YPet, fue etiquetada para la N-y C-terminales, respectivamente, de pre-SUMO1. SENP1 escinde la proteína de fusión CyPet-(pre-SUMO1)-YPet en el lugar de Gly-Gly en SUMO1 del C-terminal y, por lo tanto, libera la cola con SUMO YPet. La señal de FRET se interrumpe, lo que resulta en un aumento de la emisión de CyPet y una dramática disminución de la emisión de YPet en la longitud de onda de excitación CyPet.
- Cuando es excitado por la luz de longitud de onda de 414 nm, la emisión total de fluorescencia de CyPet-(pre-SUMO1)-YPet a 530 nm se puede derivar de tres fuentes: la emisión del absoluto FRET inducida YPet, el CyPet directa de emisiones y YPet directa de emisiones (Figura 2).
donde FL 530/414 </ Sub> es el total de las emisiones de fluorescencia a 530 nm cuando se excita a 414 nm, FL FRET es el absoluto señal de FRET, FL CyPet (cont) es la emisión CyPet directa cuando se excita a 414 nm, y FL YPet (cont) es la YPet directas de las emisiones cuando se excita a 414 nm. El subíndice de (cont) representa la contribución.
- La emisión directa de CyPet a 530 nm era proporcional a su emisión a 475 nm cuando se excita a 414 nm con una relación constante de α. CyPet-SUMO1 se preparó a concentraciones de 50, 100, 200, 500, y 750 nM y 1 mM y las emisiones a 475 y 530 nm se midió después de excitación a 414 nm para determinar α (Figura 3-1).
- La emisión directa de YPet a 530 nm con excitación a 414 nm era proporcional a su emisión a 530 nm cuando se excita a 475 nm con una relación constante de β. YPet se preparó a concentraciones de 50, 100, 200, 500, 750 and 1.000 nm, y la emisión a 530 nm se midió cuando las muestras fueron excitados por longitudes de onda de 414 y 475 nm para determinar β (Figura 3-2).
- Cuando CyPet-(pre-SUMO1)-YPet fue digerido por SENP1, la escisión libera CyPet-SUMO1 y la cola SUMO1 con YPet. Cuando el compuesto se excita a 414 nm, la emisión de fluorescencia a 530 nm (FL '530/414) se redujo, pero aún se pueden dividir en tres partes como:
donde FL '530/414 es la emisión total de fluorescencia a 530 nm después de la digestión cuando se excita a 414 nm, FL' FRET es el restante absoluto señal de FRET, CyPet FL '(475/414) es la emisión CyPet a 475 nm después de la digestión cuando excita a 414 nm (en este caso la emisión CyPet es de dos partes: sin digerir CyPet-(pre-SUMO1)-YPet y digerido CyPet-SUMO1), y YPet FL(530/475) es la emisión YPet cuando se excita a 475 nm, que es constante si CyPet-(pre-SUMO1)-YPet se digiere o no.
- Después de la digestión por SENP1, el restante FRET emisión (FL-FRET) es:
donde C es la concentración total de CyPet-(pre-SUMO1)-YPet y x es la concentración de digerido CyPet-(pre-SUMO1)-YPet.
- Mediante la combinación de todos los elementos, la emisión de fluorescencia detectada a 530 nm bajo excitación de 414 nm (530 FL '/ 414) es:
4. FRET basada en el Ensayo de la Proteasa Estudio de cinética enzimática
- CyPet-(pre-SUMO1)-YPet se incubó con el dominio catalítico de SENP1 a 37 ° C en un tampón de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 0,1% (v /v) de Tween-20 y 1 mM de DTT a un volumen total de 80 ml y se transfirió a 384-así placa.
- Carreras se llevaron a cabo mediante la medición de la emisión de fluorescencia a 475 y 530 nm después de una excitación a 414 nm en un lector de placas de fluorescencia de múltiples pocillos durante 5 min con 15-sec intervalos.
- La velocidad de reacción (v) se correlacionó con el cambio en la cantidad de sustrato (S) como:
- La concentración de producto aumentado exponencialmente desde 0 como [S] 0 (concentración de sustrato original) cuando t = 0:
- Cuando t = 0, la velocidad inicial (V 0) es:
- La concentration de SENP1 se fijó, y la concentración de CyPet-(pre-SUMO1)-YPet se aumentó de 100 veces más que la concentración de la enzima, que es requerido por la ecuación de Michaelis-Menten.
- Todas las lecturas fluorescentes fueron analizadas por el método de análisis cuantitativo FRET y se representan en GraphPad Prism Software V para adaptarse a la ecuación de Michaelis-Menten. La regresión no lineal también se puede realizar con la ayuda de paquetes de software más comunes, como los programas de hojas de cálculo (por ejemplo, Microsoft Excel).
5. Los resultados representativos
La maduración de pre-SUMO1 por SENP1 puede determinarse controlando los cambios en la señal de fluorescencia a 475 y 530 nm durante el proceso. El resultado mostró que la velocidad de la pre-SUMO1 digestión por SENP1 en una manera dependiente de la dosis-sustrato (Figura 4). Esto sugiere que el dominio catalítico de SENP1 exhibe una excelente actividad para la maduración de los pre-SUMO1. La reacción inicialvelocidades ción se calcularon por el análisis anterior con diferentes concentraciones de sustrato (Tabla 1).
El k cat / K M se utiliza generalmente para comparar las eficiencias de los diferentes enzimas con un sustrato o una enzima en particular con diferentes sustratos. K M y V max se puede obtener de la ecuación de Michaelis-Menten por el trazado de las diversas velocidades iniciales, correspondientes a las diferentes concentraciones de CyPet-(pre-SUMO1)-YPet (Figura 5) k gato se obtuvo en forma.:
De acuerdo con el análisis anterior, se calculó un K M fue de 0,21 ± 0,04 mM, el gato k fue 6,90 ± 0,28 s -1, y la k cat / K M proporción fue de (3,2 ± 0,55) x 10 7 M -1 > S -1.
Figura 1. Gráfico de ensayo de la proteasa FRET basado en un pre-sumos SENP de maduración.
Figura 2. Análisis cuantitativo de la señal fluorescente como contribuciones por el donante, aceptor y FRET. La disección de los espectros de emisión de CyPet-(pre-SUMO1)-YPet bajo excitación a 414 nm. CyPet FL (530/414) Se emisión CyPet de a 530 nm bajo excitación de 414 nm, FL FRET es la emisión FRET inducida YPet a 530 nm bajo excitación de 414 nm, y FL YPet (530/414) es la emisión YPet de a 530 nm bajo excitación de 414 nm.
load/4430/4430fig3.jpg "/>
Figura 3. Cálculo del factor de α y β dirección de emisión.
Figura 4. Análisis cuantitativo de CyPet-(pre-SUMO1)-YPet digerido por diferentes proporciones de al dominio catalítico de SENP1. Las reacciones se controlaron dentro de los primeros 5 min.
Figura 5. Michaelis-Menten análisis gráfico de digestión CyPet-(pre-SUMO1)-YPet de por SENP1. Los datos se representaron gráficamente y se analizaron por GraphPad Prism V y regresión no lineal.
| [S] (mM) | V 0 (mM / s) | ||
| 0,115 | 0,0023 ± 0,00005 | 0,214 | 0,0028 ± 0,00004 |
| 0,407 | 0,0033 ± 0,00007 | ||
| 0,594 | 0,0037 ± 0,00013 | ||
| 0,725 | 0,0043 ± 0,00012 | ||
| 1,471 | 0,0051 ± 0,00036 | ||
| 1,899 | 0,0050 ± 0,00031 | ||
| 2,300 | 0,0050 ± 0,00062 |
Tabla 1. Determinación de las velocidades iniciales de la maduración de los pre-SUMO1 por SENP1. En cada concentración de sustrato, cuatro muestras se utilizaron para medir la digestión. La desviación estándar de vino de las variaciones de estas cuatro muestras.
| K M (M) | k cat (s-1) | k cat / K M (M -1 s •-1) |
| 0,21 ± 0,04 | 6,90 ± 0,28 | 3,2 ± 0,55 × 10 7 |
Tabla 2. Parámetros cinéticos de la maduración del pre-SUMO1 por SENP1 cuantitativos de análisis FRET. La desviación estándar de vino de las cuatro muestras en cada concentración de sustrato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tecnología FRET ha sido utilizada para estudiar la maduración pre-SUMO1 de por SENP1 9. CFP-YFP se utilizó como el par de FRET y el análisis radiométrico, que es la relación de aceptor a las emisiones de los donantes, se utilizó para caracterizar las propiedades cinéticas. Sin embargo, no existe ninguna consideración de donante y aceptor de auto-fluorescencia en la ratiométrica tradicional análisis FRET. La relación no se correlacionan directamente con la cantidad de sustrato digerido.
Aquí mostramos un desarrollado muy sensible FRET ensayo basado en la proteasa para estudiar la cinética de la maduración pre-SUMO1 por parte SENP1. En contraste con el enfoque ratiométrica anterior, fundamentalmente mejorado el método con una nueva teoría de la señal de FRET para el análisis cinético y un procedimiento experimental para derivar los parámetros cinéticos mediante la determinación de las contribuciones cuantitativas de auto-fluorescencia del donante y aceptor, y el real FRET emisión inducida aceptor. Análisis radiométrico no puede hacer esto. Lala ignorancia de la auto-fluorescentes emisiones de donante y aceptor puede llevar a una sobreestimación de la señal de FRET y la emisión del donante. Las sobreestimaciones no puede afectar en gran medida a la final k cat / K M (3,81 x10 7 M -1 s -1 para el análisis radiométrico, 3,2 x10 7 M -1 s -1 por nuestro análisis cuantitativo FRET), pero el efecto es más evidente cuando se estudian los parámetros individuales, K M (0,098 vs 0,21 M) y k gato (3,43 vs 6,90 s -1 s -1), que son importantes en la determinación de la etapa limitante de velocidad y potencia inhibidor de enzimas.
El método que se presenta aquí es un ensayo de una etapa de la proteasa parámetros cinéticos y requiere únicamente la clonación molecular y expresión de la proteína sin marcaje radioactivo o instrumentos costosos. El procedimiento de una etapa no sólo simplifica el procedimiento experimental pero también limita muchode variaciones. Las proteínas fluorescentes son etiquetados en la fase acuosa, que típicamente es similar a su hábitat natural en las células. La intensidad de fluorescencia se puede determinar en general por espectroscopia de fluorescencia o lectores de placas de fluorescencia, que están ampliamente disponibles. En comparación con el tradicional "basado en gel" método, nuestro FRET basada en ensayo de la proteasa ofrece varias ventajas, incluyendo aumento de la sensibilidad, la medición en tiempo real, y menos tiempo y mano de obra necesaria. Además, la metodología y el procedimiento de determinación de los parámetros cinéticos de proteasa son materiales respetuosos del medio ambiente y no peligrosos, tales como radioisótopos o productos químicos fuertes. Además, la alta sensibilidad de FRET a base de ensayo puede ser utilizado en ensayos de alto rendimiento biológicos, tales como la detección de inhibidores de proteasa. El estudio cinético también se puede utilizar para caracterizar las propiedades de los inhibidores (por ejemplo, Ki, IC50).
Por lo tanto, el cuantitativo de alta sensibilidad FRET-based ensayos de la proteasa podría ser un poderoso enfoque en el desarrollo de todo el genoma proteasa sustrato de perfiles y detección de inhibidores.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Estamos muy agradecidos a Victor GJ Rodgers por sus valiosos consejos. Agradecemos a todos los miembros del grupo Liao para el trabajo en colaboración muy estrecha y ayuda con este estudio. Este estudio fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (Grant AI076504 a JL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR II TOPO Kit | Invitrogen | K466040 | |
| 2xYT | Research Products Internationa.l Corp. | X15600 | |
| Ni-NTA Agrose | Thermo Scientific | 88222 | |
| Coomassie plus (Bradford) Assay Regent | Thermo Scientific | 23238 | |
| 384-well plate (glass bottom) | Greiner | 781892 | |
| FlexStation II 384 plate reader | Molecular Device |
References
- Johnson, E. S. Protein modification By SUMO. Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes & Development. 18, 2046-2059 (2004).
- Hay, R. T. SUMO: a history of modification. Molecular Cell. 18, 1-12 (2005).
- Müller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., Jentsch, S. SUMO, ubiquitin's mysterious cousin. Nature. , 202-210 (2001).
- Hochstrasser, M. SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein. Cell. , 5-8 (2001).
- Drag, M., Salvesen, G. S. DeSUMOylating enzymes-SENPs. IUBMB Life. 60, 734-742 (2008).
- Mukhopadhyay, D., Dasso, M. Modification in reverse: the SUMO proteases. Trends in Biochemical Sciences. 32, 286-295 (2007).
- Reverter, D., Lima, C. D. Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1060-1068 (2006).
- Shen, L., et al. SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1069-1077 (2006).
- Horton, R., Strachan, E., Vogel, K., Riddle, S. A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein. Analytical Biochemistry. 360, 138-143 (2007).
- Mikolajczyk, J., et al. Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs. Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).
- Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes. Biochem. J. , 335-344 (2010).
- Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family. Biochemical Journal. 409, 461 (2008).
- Engels, I. H., et al. A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity. Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).
- Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing. Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).
- Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).
