Summary
يوصف أسلوب الرواية التي تنطوي على التحليل الكمي من الحنق (فورستر نقل الطاقة الرنين) إشارات لدراسة حركية الانزيم.
Abstract
وتستخدم على نطاق واسع تعديلات ما بعد النقل عكسها من البروتينات مع البروتينات مثل اليوبيكويتين أو اليوبيكويتين-(Ubls) لتنظيم نشاط حيوي البروتين وأدوار متنوعة في العديد من العمليات البيولوجية. على سبيل المثال، SUMO يعدل تساهميا عدد كبير أو البروتينات مع أدوارا هامة في العديد من العمليات الخلوية، بما في ذلك الخلايا دورة التنظيم وبقاء الخلية والوفاة، استجابة DNA الأضرار، والإجهاد استجابة 1-5. SENP، وSUMO محددة البروتيني، تكون بمثابة ببتيداز داخلية في نضوج السلائف SUMO أو باعتبارها isopeptidase لإزالة SUMO من البروتينات هدفه وتحديث دورة SUMOylation 1،3،6،7.
ويتميز كفاءة الحفاز أفضل أو خصوصية انزيم من نسبة الثوابت الحركية، ك القط / M K. في العديد من الدراسات، وقد تم تحديد المعلمات الحركية للSUMO-SENP أزواج بطرق مختلفة، بما في ذلك على أساس هلام بولكرلميد الغربي صمة عار، رادioactive التي تحمل علامات المسمى الركيزة، مجمع الفلورسنت أو البروتين الركيزة 8-13. ومع ذلك، فإن تقنيات بولكرلميد هلام القائم، والتي تستخدم في "الأم" هي بروتينات ولكن شاقة وتطالب من الناحية الفنية، التي لا تخضع بسهولة لأنفسهم التحليل الكمي مفصلة. وحصلت ك القط / M K من الدراسات التي تستخدم tetrapeptides أو البروتينات مع ACC (7-الأمينية-4-carbamoylmetylcoumarin) أو AMC (7-الأمينية-4-methylcoumarin) fluorophore إما يصل الى اثنين من أوامر من حجم أقل من ركائز الطبيعية أو لا يمكن التمييز بوضوح على شهادة الأيزو والأنشطة ببتيداز داخلية من SENPs.
واستخدمت مؤخرا فحوصات البروتيني، الحنق القائم على دراسة الأنزيمات deubiquitinating (يصف) أو SENPs مع الزوج الحنق من بروتين فلوري سماوي (CFP) وبروتين فلوري الصفراء (YFP) 9،10،14،15. تم استخدام نسبة الانبعاثات إلى الانبعاثات متقبل المانحة كمعلمة الكمية لرصد الحنق إشارة لميلان البروتينيtivity المصير. ومع ذلك، تجاهل هذا الأسلوب إشارة عبر التلوث ومتقبل في موجات من الانبعاثات المانحة ومتقبل المانحة الذاتي مضان وبالتالي لم يكن دقيقا.
وضعنا رواية شديدة الحساسية والكمية الفحص البروتيني الحنق القائم لتحديد معالم الحركية في مرحلة ما قبل النضج SUMO1 من SENP1. وهندسيا الحنق CyPet الزوج وYPet بكفاءة الحنق تحسنت بشكل ملحوظ ومضان العائد الكم، واستخدمت لتوليد CyPet-(قبل SUMO1)-YPet الركيزة 16. نحن متباينة وكميا إشارات مضان المطلقة ساهمت من قبل الجهة المانحة ومتقبل والحنق على موجات متقبل والانبعاثات على التوالي. تم الحصول على قيمة القط ك / M K ك (3.2 ± 0.55) X10 7 M -1 ق -1 من SENP1 نحو SUMO1 المسبق، وهو ما يتفق مع المعايير العامة الحركية الأنزيمية. لذلك، هذه المنهجية صالحة ويمكن استخدامSA النهج العام لتوصيف البروتياز الأخرى كذلك.
Protocol
1. بلازميد التركيبات
- تضخيم الإطارات القراءة مفتوحة من الجينات بواسطة PCR، واستنساخ المنتجات PCR-TOPO PCRII في ناقلات.
- تأكيد المنتجات من قبل التسلسل، واستنساخ [كدنا] الترميز CyPet-(قبل SUMO1)-YPet، CyPet SUMO1، وYPet المجالات الحفاز SENP1 في ناقلات (ب) pET28 مع علامة hexahistidine N-الطرفية.
2. بروتين تعبير وتنقية
- تحويل خلايا الإشريكية القولونية من سلالة BL21 (DE3) مع pET28 (ب) ناقلات ترميز CyPet-(قبل SUMO1)-YPet، CyPet SUMO1، YPet والمجالات الحفاز SENP1.
- تنمو البكتيريا تحول في المتوسط 2xYT لمدة 3 ساعة عند 37 درجة مئوية (في 250 دورة في الدقيقة تهتز) للتوصل إلى الكثافة البصرية من 0.5 في 600 نانومتر.
- إضافة 100 ميكرومتر الآيزوبروبيل β-D--thiogalactoside (IPTG) (تركيز النهائي) للحث على التعبير البروتين ويهز لمدة 16 ساعة في 25 في 200 دورة في الدقيقة C °.
- حصاد البكتيريا عن طريق centrifugأوجه في 10،000 دورة في الدقيقة عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق و resuspend لهم في منطقة عازلة من 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 7.4)، 50 ملي كلوريد الصوديوم، و 5 ملي الاميدازول.
- يصوتن الخلايا لمدة 10 دقيقة في 5-ثوانى فترات في وضع السلطة في 25 W باستخدام MiSonics 4000 sonicator وجمعها بواسطة الطرد المركزي في 35000 XG في 4 لمدة 30 دقيقة C °.
- إعداد العمود الخرز مع 500 مل ني NTA للثقافة L 1 ونقل طاف في العمود.
- غسل الراتنج مع العازلة من 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 7.4)، 500 كلوريد الصوديوم ملم، و 10 ملم الاميدازول مرتين.
- أزل البروتين مع العازلة من 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 7.4)، 500 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 500 ملي الاميدازول وغسيل الكلى في منطقة عازلة من 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 7.4)، 50 مم كلوريد الصوديوم و 1 ملي dithiothreitol (DTT) في 4 ° C ليلة وضحاها.
- تحديد تركيزات البروتينات تنقيته بواسطة الفحص برادفورد. يتبع طريقة بديلة لقياس تركيز البروتين سوف يكون SDS-PAGE الكهربائي للهلام وملطخة باللون الأزرق ثم Coomassie مع التصويرالكمية.
3. الكمية الحنق تحليل الطيف
- وتستند الاستراتيجية العامة لفحص على الحنق يشير (الشكل 1). الزوج الحنق، وكانت المعلمة وCyPet YPet، إلى N-C-ومصطلحات، على التوالي، من SUMO1 مسبقة. SENP1 يشق البروتين الانصهار CyPet-(قبل SUMO1)-YPet في موقع الغليسين-الغليسين في لSUMO1 C-محطة، وبالتالي يطلق الذيل SUMO مع YPet. والحنق تتعطل إشارة، مما أدى إلى زيادة الانبعاثات من من CyPet وحدث تراجع كبير في الانبعاثات في YPet في الطول الموجي الإثارة CyPet.
- يمكن عند اثارته ضوء طول موجي 414 نانومتر، والانبعاثات الإجمالية مضان من CyPet-(قبل SUMO1)-YPet في 530 نيوتن متر يمكن أن تستمد من ثلاثة مصادر: الانبعاثات المطلقة الحنق الناجم عن YPet، وCyPet المباشر الانبعاثات وYPet المباشر الانبعاثات (الشكل 2).
حيث FL 530/414 </ دون> هو مجموع الانبعاثات في مضان 530 نيوتن متر عند متحمس في 414 نانومتر، FL الحنق هو إشارة المطلقة الحنق، FL CyPet (تابع) هو CyPet الانبعاثات المباشرة عندما متحمس في 414 نانومتر، وFL YPet (تابع) هو YPet توجيه الانبعاثات عند 414 نانومتر متحمس في. ومنخفض من (تابع) لتقف على المساهمة.
- والانبعاثات المباشرة من CyPet في 530 نيوتن متر كان يتناسب مع الانبعاثات في 475 نانومتر في حين متحمس في 414 نانومتر مع نسبة ثابتة من α. تم إعداد CyPet-SUMO1 بتركيزات 50، 100، 200، 500، 750 و نانومتر ومم 1 ، ولقد تم قياس الانبعاثات في 475 و 530 نانومتر بعد الإثارة في 414 نانومتر لتحديد α (الشكل 3-1).
- كان الانبعاثات المباشرة من YPet في 530 نيوتن متر تحت الإثارة في 414 نانومتر يتناسب مع الانبعاثات أعمالها في 530 نيوتن متر عند متحمس في 475 نانومتر مع نسبة ثابتة من β. أعد YPet بتركيزات 50، 100، 200، 500، 750 Aوقد تم قياس الثانية 1000 نيوتن متر، والانبعاثات في 530 نيوتن متر عند منتهى السعادة لعينات من موجات من 414 نانومتر و475 إلى تحديد β (الشكل 3-2).
- عندما يهضم CyPet-(قبل SUMO1)-YPet من SENP1، والانقسام صدر CyPet-SUMO1 والذيل مع SUMO1 YPet. عندما كان في منتهى السعادة لمجمع 414 في نانومتر، انخفضت الانبعاثات مضان في 530 نيوتن متر ('FL 530/414)، ولكن لا يزال من الممكن تقسيمها إلى ثلاثة أجزاء على النحو التالي:
حيث FL "530/414 هو مجموع الانبعاثات في مضان 530 نيوتن متر عند الهضم بعد متحمس في 414 نانومتر، FL" الحنق هو المتبقية المطلقة الحنق إشارة، FL CyPet "(475/414) هو الانبعاثات في 475 نانومتر CyPet بعد الهضم عندما متحمس في 414 نانومتر (هنا هو من الانبعاثات CyPet قسمين: غير مهضوم CyPet-(قبل SUMO1)-YPet وهضمها CyPet-SUMO1)، وYPet FL(530/475) هو الانبعاثات YPet عندما متحمس في 475 نانومتر، والتي هي مستمرة ما إذا كان يهضم CyPet-(قبل SUMO1)-YPet أم لا.
- بعد الهضم من قبل SENP1، ما تبقى من الحنق الانبعاثات ('FL الحنق) هو:
حيث C هو التركيز الكلي للCyPet-YPet-(قبل SUMO1) و x هو تركيز هضمها CyPet-(قبل SUMO1)-YPet.
- من خلال الجمع بين كافة العناصر، والكشف عن مضان الانبعاثات في 530 نيوتن متر تحت الإثارة من 414 نانومتر (FL "530/414) هو:
4. الحنق القائم على الفحص البروتياز لدراسة الحركية إنزيم
- وقد حضنت CyPet-(قبل SUMO1)-YPet مع المجال الحفاز في SENP1 C ° 37 في مخزن مؤقت 20 مم 0.1٪ تريس، حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 7.4)، 50 مم كلوريد الصوديوم، (ت /ت) توين-20 و 1 ملم DTT إلى وحدة تخزين ما مجموعه 80 مل ونقلها إلى 384 لوحة جيدا.
- وأجريت أشواط من خلال قياس الانبعاثات مضان في 475 و 530 نانومتر بعد الإثارة في 414 نانومتر في لوحة مضان القارئ multiwell لمدة 5 دقائق مع 15 ثانية فترات.
- ارتبط معدل التفاعل (V) مع تغيير في كمية الركيزة (S) على النحو التالي:
- تركيز المنتج زادت أضعافا مضاعفة من 0 كما [S] 0 (الأصلي تركيز الركيزة) عندما ر = 0:
- عندما ر = 0، سرعة الأصلي (V 0) هو:
- واضربتم إصلاح entration من SENP1، وتمت زيادة تركيز CyPet-YPet-(قبل SUMO1) من 100 مرة أكثر من تركيز الانزيم، الذي هو مطلوب من قبل ميكايليس-Menten المعادلة.
- وقد تم تحليل كل من القراءات الفلورسنت من خلال طريقة التحليل الكمي والحنق المرسومة في البرنامج GraphPad V بريزم لتناسب المعادلة ميكايليس-Menten. ويمكن أيضا الانحدار غير الخطية أن يقوم بمساعدة أكثر حزم البرمجيات الشائعة مثل برامج جداول البيانات (مثل Microsoft Excel).
5. ممثل النتائج
يمكن تحديد النضج من قبل SUMO1 من SENP1 عن طريق رصد التغيرات في إشارة مضان في 475 و 530 نانومتر خلال العملية. وأظهرت النتيجة أن سرعة الهضم قبل SUMO1 من SENP1 بطريقة تعتمد الركيزة بالجرعات (الشكل 4). هذا يشير إلى أن المجال الحفاز لSENP1 المعارض النشاط ممتازة لنضوج ما قبل SUMO1 ل. ومفاعل الأوليةتم حساب السرعات نشوئها من التحليل الوارد أعلاه مع تركيزات مختلفة الركيزة (الجدول 1).
يستخدم عادة نسبة ك M القط / K لمقارنة كفاءة الإنزيمات المختلفة مع بعضها الركيزة أو إنزيم خاص مع ركائز مختلفة. K M والحد الأقصى V يمكن الحصول عليها من المعادلة ميكايليس-Menten من قبل المتهم بالتآمر في السرعات المختلفة، المقابلة الأولية لتركيزات مختلفة من CyPet-(قبل SUMO1)-YPet (الشكل 5) والتي تم الحصول عليها ك القط على النحو التالي:
وفقا لتحليل أعلاه، كان يحسب K M 0.21 ± 0.04 ميكرومتر، ك القط كان 6،90 ± 0.28 ق -1، والقط / K M ك نسبة كانت (3.2 ± 0.55) X10 7 M -1 > ق -1.
الشكل 1. رسم بياني لفحص البروتيني الحنق القائم لنضوج ما قبل SUMOs SENP ل.
الشكل 2. التحليل الكمي للإشارة الفلورسنت والمساهمات التي متقبل والجهات المانحة والحنق. تشريح أطياف الانبعاثات من CyPet FL CyPet-(قبل SUMO1)-YPet تحت الإثارة في 414 نانومتر. (530/414) والانبعاثات CyPet لفي 530 نيوتن متر تحت الإثارة من 414 نانومتر، FL الحنق هو الانبعاثات YPet الحنق الناجم في 530 نيوتن متر تحت الإثارة من 414 نانومتر، وFL YPet (530/414) هو الانبعاثات YPet لفي 530 نيوتن متر تحت الإثارة من 414 نانومتر.
load/4430/4430fig3.jpg "/>
الشكل 3. حساب الانبعاثات الاتجاه α β عامل و.
الشكل 4. تحليل الكمي ل-CyPet YPet-(قبل SUMO1) يهضم بنسب مختلفة من المجال الحفاز لSENP1. تم رصد ردود الفعل داخل 5 دقائق الأولى.
الشكل 5. ميكايليس Menten تحليل رسومي للهضم CyPet-(قبل SUMO1)-YPet من قبل SENP1. تم التخطيط البيانات وتحليلها من قبل GraphPad بريزم V والانحدار غير الخطية.
| [S] (ميكرومتر) | V 0 (ميكرون / ثانية) | ||
| 0،115 | 0.0023 ± 0.00005 | 0،214 | 0.0028 ± 0.00004 |
| 0،407 | 0.0033 ± 0.00007 | ||
| 0،594 | 0.0037 ± 0.00013 | ||
| 0،725 | 0.0043 ± 0.00012 | ||
| 1،471 | 0.0051 ± 0.00036 | ||
| 1،899 | 0.0050 ± 0.00031 | ||
| 2،300 | 0.0050 ± 0.00062 |
الجدول 1. الأولية السرعات تحديد نضوج ما قبل SUMO1 من قبل SENP1. في كل تركيز الركيزة، واستخدمت أربع عينات لقياس عملية الهضم. جاء الانحراف المعياري من أشكال مختلفة من هذه العينات الأربع.
| K M (ميكرومتر) | ك القط (ق-1) | ك القط / ك M (M -1 ق •-1) |
| 0.21 ± 0.04 | 6.90 ± 0.28 | 3.2 ± 0.55 × 10 7 |
الجدول 2. المعلمات الحركية من النضج ما قبل SUMO1 من قبل SENP1 من كمية الحنق التحليل. جاء الانحراف المعياري من العينات الأربع في كل تركيز الركيزة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم استخدام التكنولوجيا الحنق لدراسة ما قبل النضج SUMO1 من قبل SENP1 9. وقد استخدم CFP-YFP حيث يتحرك هذا الزوج الحنق وتحليل ratiometric، والتي هي نسبة انبعاثات متقبل لالمانحة، تم استخدامه لوصف خصائص الحركية. ومع ذلك، لا يوجد أي النظر في الجهات المانحة ومتقبل الذاتي مضان في ratiometric التقليدية الحنق التحليل. نسبة لا ترتبط بشكل مباشر مع كمية الركيزة هضمها.
نحن هنا الإبلاغ عن تطوير حساسة للغاية الفحص البروتيني الحنق قائم على دراسة الحركية للنضوج ما قبل SUMO1 من قبل SENP1. وعلى النقيض من نهج ratiometric السابقة، فإننا تحسين جذري في الطريقة مع نظرية جديدة من الحنق إشارة لتحليل الحركية وإجراء التجارب لاستخلاص المعلمات الحركية من خلال تحديد الكمي للمساهمات مضان الذاتي من الجهات المانحة ومتقبل، والحنق الحقيقي الناجم عن الانبعاثات في متقبل. يمكن تحليل Ratiometric لا تفعل هذا. القد جهل الذاتي الفلورسنت انبعاثات المانحة ومتقبل يؤدي إلى المبالغة في تقدير إشارة الحنق والانبعاثات المتبرع. قد لا overestimations تؤثر بشكل كبير على نسبة M ك النهائي القط / K (3.81 X10 -1 7 M ق -1 للتحليل ratiometric، 3.2 X10 7 M -1 ث -1 من تحليلنا الحنق الكمية)، ولكن النتيجة هي أكثر واضح عند دراسة المعلمات الفردية، K M (0.098 مقابل 0.21 ميكرومتر) وك القط (3.43 ث -1 مقابل 6،90 ق -1)، والتي تعتبر مهمة في تحديد سعر منظم للقوة وخطوة المانع من الانزيمات.
طريقة ننقل هنا هو فحص من خطوة واحدة من المعلمات حركية الأنزيم البروتيني، ويتطلب الاستنساخ الجزيئي والتعبير فقط دون وضع العلامات البروتين المشعة أو الصكوك مكلفة. الإجراء خطوة واحدة فقط لا يبسط الإجراءات التجريبية ولكن يحد أيضا الكثيرمن الاختلافات. البروتينات الفلورية الموسومة في المرحلة المائية، وهو عادة مشابهة لبيئتها الطبيعية في الخلايا. يمكن تحديد كثافة مضان مضان الطيفي بواسطة العامة أو القراء لوحة مضان، وهي متوافرة على نطاق واسع. مقارنة مع الطريقة التقليدية "القائمة على هلام"، مقايسة لدينا البروتيني الحنق القائم يوفر العديد من المزايا، بما في ذلك زيادة الحساسية، وقياس في الوقت الحقيقي، وأقل الوقت والعمل المطلوب. وعلاوة على ذلك، فإن المنهجية والإجراءات من قرارات حركية الأنزيم البروتيني المعلمة هي مواد صديقة للبيئة وغير الخطرة، مثل النظائر المشعة أو المواد الكيميائية القاسية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام حساسة للغاية الحنق القائم على الفحص عالية الإنتاجية في المقايسات البيولوجية، مثل عروض مثبط البروتياز. ويمكن أيضا دراسة الحركية استخدامها لتوصيف خصائص مثبطات (على سبيل المثال كي، IC50).
ولذلك، فإن الكمية حساسة للغاية الحنق-BASيمكن إد المقايسات البروتيني يكون طريقة فعالة في تطوير الجينوم على نطاق البروتيني-الركيزة التنميط وعروض المانع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ونحن ممتنون جدا لفيكتور GJ رودجرز للمشورة قيمة. نشكر جميع أعضاء الفريق لياو للعمل التعاوني وثيقة للغاية وللمساعدة في هذه الدراسة. وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة (المنح AI076504 لJL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR II TOPO Kit | Invitrogen | K466040 | |
| 2xYT | Research Products Internationa.l Corp. | X15600 | |
| Ni-NTA Agrose | Thermo Scientific | 88222 | |
| Coomassie plus (Bradford) Assay Regent | Thermo Scientific | 23238 | |
| 384-well plate (glass bottom) | Greiner | 781892 | |
| FlexStation II 384 plate reader | Molecular Device |
References
- Johnson, E. S. Protein modification By SUMO. Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes & Development. 18, 2046-2059 (2004).
- Hay, R. T. SUMO: a history of modification. Molecular Cell. 18, 1-12 (2005).
- Müller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., Jentsch, S. SUMO, ubiquitin's mysterious cousin. Nature. , 202-210 (2001).
- Hochstrasser, M. SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein. Cell. , 5-8 (2001).
- Drag, M., Salvesen, G. S. DeSUMOylating enzymes-SENPs. IUBMB Life. 60, 734-742 (2008).
- Mukhopadhyay, D., Dasso, M. Modification in reverse: the SUMO proteases. Trends in Biochemical Sciences. 32, 286-295 (2007).
- Reverter, D., Lima, C. D. Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1060-1068 (2006).
- Shen, L., et al. SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1069-1077 (2006).
- Horton, R., Strachan, E., Vogel, K., Riddle, S. A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein. Analytical Biochemistry. 360, 138-143 (2007).
- Mikolajczyk, J., et al. Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs. Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).
- Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes. Biochem. J. , 335-344 (2010).
- Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family. Biochemical Journal. 409, 461 (2008).
- Engels, I. H., et al. A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity. Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).
- Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing. Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).
- Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).
