Une configuration à faible coût pour l'audiométrie comportementale chez les rongeurs

Summary

Une méthode rapide et peu coûteuse pour la détermination du comportement de l'audition des paramètres tels que les seuils d'audition, une déficience auditive ou des perceptions fantômes (acouphène subjectif) est décrite. Il utilise pré-impulsion inhibition de la réaction de sursaut acoustique et peut être facilement mis en oeuvre dans un ordinateur personnel à l'aide d'un AD programmable / convertisseur numérique-analogique et un capteur piézo-électrique.

Abstract

Dans la recherche des animaux acoustique, il est crucial d'avoir des informations précises sur les paramètres de base auditifs des sujets animaux qui sont impliqués dans les expériences. Ces paramètres peuvent être des caractéristiques physiologiques de réponse de la voie auditive, par exemple par l'intermédiaire d'audiométrie du tronc cérébral (BERA). Mais ces méthodes permettent des extrapolations ne indirects et incertain sur le percept auditif qui correspond à ces paramètres physiologiques. Pour évaluer le niveau de la perception de l'audition, les méthodes comportementales doivent être utilisées. Un problème potentiel avec l'utilisation de méthodes comportementales pour la description de la perception dans des modèles animaux est le fait que la plupart de ces méthodes impliquent une sorte de paradigme de l'apprentissage avant que les sujets peuvent être testés comportemental, par exemple, les animaux peuvent apprendre à appuyer sur un levier dans réponse à un son. Comme ces paradigmes changent la perception apprentissage lui-même, par conséquent, ils seront ^1,2 influencer un résultat obtenu sur la perception desces méthodes et doivent par conséquent être interprétés avec prudence. Les exceptions sont les paradigmes qui font appel à des réponses réflexes, car ici pas de paradigmes d'apprentissage doivent être effectuées avant le test perceptif. Une telle réponse réflexe est la réponse de sursaut acoustique (ASR) qui peut être obtenue de façon reproductible très inattendus avec les sons forts chez les animaux naïfs. Ce ASR, à son tour peut être influencée par des sons qui précède en fonction de la perceptibilité de ce stimulus précédent: Sons bien au-dessus du seuil auditif va inhiber complètement l'amplitude de l'ASR, semble proche de seuil légèrement inhiber l'ASR. Ce phénomène est appelé pré-impulsion d'inhibition (PPI) ^3,4, et le montant de l'IPP sur l'ASR dépend progressivement sur ​​la perceptibilité de la pré-impulsion. PPI de l'ASR est donc bien adapté pour déterminer audiogrammes de comportement dans naïfs, non-qualifiés animaux, afin de déterminer une déficience auditive ou même de détecter d'éventuels subjectives percepts acouphènes dans cesanimaux. Dans cet article, nous démontrons l'utilisation de cette méthode dans un modèle de rongeur (voir aussi ref. ^5), la gerbille de Mongolie (Meriones unguiculatus), qui est une espèce modèle bien connu pour la recherche de sursaut dans la gamme de l'audition humaine normale (par exemple, ^6).

Protocol

1. Montage et configuration du logiciel de programmation

1. Installez un convertisseur D / A la carte dans un ordinateur personnel (par exemple: NI PCI 6229, National Instruments) et le connecter à un casse-boîte (par exemple: BNC-2110, de National Instruments), les deux doivent supporter au moins une entrée et un canal de sortie avec un taux d'échantillonnage d'au moins 44,1 kHz chacune.
2. Connectez la sortie de la boîte de dérivation via un câble BNC à un amplificateur de son (par exemple: AMP75 Amplificateur de puissance à large bande, Thomas Wulf).
3. Installer une webcam infrarouge (par exemple: Grand Pro Caméra IP, GrandTec Electronics) pour la surveillance des animaux dans l'obscurité.
4. Installer un environnement de développement intégré (ex: Matlab) pour mettre en œuvre un programme tel que défini par l'organigramme de la Figure 1. Une version fonctionnant sur Matlab 2007b peuvent être obtenus gratuitement auprès de l'auteur correspondant.
5. Dans une chambre insonorisée installer un haut-parleur sur une table. Connectez le haut-parleur to l'amplificateur audio.
6. Installer un capteur piézo-électrique (par exemple capteur de force FSG15N1A, Honeywell) au-dessus d'un panneau isolant, de le soutenir avec le pouvoir et de le connecter via un câble BNC à l'entrée de la boîte de dérivation; sol le capteur de signal.
7. Construire une chambre de mesure à partir d'un tube en verre acrylique ajustée à la taille du rongeur à mesurer (par exemple pour les gerbilles: longueur 15 cm, diamètre intérieur 4,3 cm, 4,8 cm de diamètre extérieur). Fixer une grille avec une largeur de maille de 0,5 mm à l'avant du tube et une porte rembourrée avec un mécanisme de verrouillage (par exemple, un crochet) à l'arrière. La fixation peut se faire avec de la colle à chaud, pour que la porte de la charnière et la patte de retenue pour le crochet est fixé au tube.
8. Fixez les pieds de mousse plastique qui correspondent aux dimensions du tube de mesure sur la carte du capteur isolant. Les pieds doivent supporter le tube sous l'extrémité avant et à l'arrière et soulevez le tube au niveau du capteur. Assurez-vous qu'il ya un léger contact entre le capteur piézo-électrique et la chambre de mesure. Fixer le capteur avec la chambre de mesure centrée devant le haut-parleur et de mettre un microphone pour le contrôle du son à côté de lui (par exemple B & K Type 2669 / B & K Type 4190 connecté à amplificateur de mesure B & K type 2610, tous: Bruel et Kjaer) au niveau de la tête des animaux afin qu'il n'interfère pas avec le tube.
9. Notez que la qualité de vos données audiométriques dépendra de la qualité de votre système de sonorisation. Dans tous les cas, utilisez le microphone et l'amplificateur de mesure pour déterminer la fonction de transfert en fréquence de votre système avant de faire vos premiers pas et inclure une routine dans votre logiciel pour corriger cette fonction de transfert en fréquence pour que le spectre de sortie de votre appartement haut-parleur.
10. Alignez la webcam avec la mise en place de sorte que l'on peut surveiller le comportement des animaux.

2. Détermination du comportement des seuils auditifs (audiogrammes)

1. Prenez l'animal de sa cage et mettre la tête la première dans le tube; cperdre la porte.
2. Mettre le tube de mousse sur les pieds et le capteur. Eteindre toute lumière et fermer la porte de la chambre. La chambre elle-même n'est pas climatisé mais il a de la température, de l'humidité et d'autres variables d'environnement du laboratoire environnante. Renouvellement de l'air par des ventilateurs n'est pas recommandé à cause du bruit induit, mais le volume de la chambre apporte son soutien à l'oxygène de l'animal pendant plusieurs heures. Attendre 15 minutes pour permettre à l'animal de s'habituer à la configuration. Le temps d'acclimatation est bénéfique pour l'animal car il peut se calmer à son propre rythme et de s'habituer au tube. D'autre part, on ne voit pas les différences de comportement lors de la session de temps d'acclimatation sur plusieurs, ce qui indique qu'une session supplémentaire pour familiariser l'animal avec le tube et la chambre avant l'expérience n'est pas nécessaire.
3. Lancez le programme et définir les paramètres de stimulation (voir aussi ref ^5).: Les stimuli sont constitués de sons purs avec différentes fréquences. Le stimulus de sursaut doit être présentée avec un niveau de pression sonore assez élevé pour obtenir de façon reproductible une réaction de sursaut. Dans notre laboratoire, nous utilisons des intensités de 105 dB SPL (stimulus durée 6 ms 2 ms y compris les cosinus carré montée et la chute des rampes) pour obtenir des réponses en sursaut gerbilles de Mongolie. Les stimuli de test précédant les stimuli sont présentés sursaut à différentes fréquences et intensités de l'ordre à tester, le plus souvent en dessous du seuil auditif à des niveaux bien supérieurs au seuil et avec des fréquences couvrant toute la gamme audible de l'espèce. Fréquence et durée de la surprise et le stimulus de test sont mis en correspondance dans chaque essai, l'intervalle entre interstimulus sursaut et stimulus de test est fixée à 100 ms. Utilisez au moins 15 répétitions avec des intervalles aléatoires interstimulus de 10 ± 2,5 sec pour chaque combinaison de fréquence et d'intensité des stimuli de test (cf. Figure 2A, à gauche). Stimuli de test suivantes peuvent être présentées soit aléatoire ou non-ranAfin randomisé. Si vous utilisez une approche non randomisée (par exemple, un stimulus de test de niveau fixé pour toutes les fréquences testées) permettent 5 min de récupération entre les séries de relance différentes. Notez que le seuil déterminé absolue dépendra de la randomisation des stimuli, mais possible décalages relatifs de seuil ne sera pas (par exemple après un traumatisme acoustique, cf. Ref. ^5).
4. Avant d'analyser les données, retirez les essais non valides de données (par exemple, les essais où l'animal déplacé avant le stimulus de sursaut;. Cf Figure 2B).
5. Dans une fenêtre temporelle du premier 50 ms après la stimulation réflexe de sursaut, calculer l'amplitude de réponse (crête à crête maximale entre la première de la première minimum de la réponse) et la latence de réponse (temps de début de déclenchement de stimulation de réponse) de chaque essai unique .
6. Monter un Boltzmann-fonction pour l'ensemble des données d'amplitude de réponse prévus d'une fréquence de l'intensité triés prestimulus pour tous singl valideessais électroniques. Le point 50% de la ^7-Boltzmann fonction indique le seuil d'audition pour cette fréquence de stimulation.

3. Traumatisme acoustique et la quantification de la déficience auditive

1. Préparer la kétamine-xylazine-anesthésie avec un mélange de chlorhydrate de kétamine: 96 mg / kg (kétamine-ratiopharm, Ratiopharm); chlorhydrate de xylazine: 4 mg / kg (Rompun 2%, Bayer), le sulfate d'atropine: 1 mg / kg (Atropinsulfat, B. Braun Melsungen AG) et une solution de NaCl physiologique (Berlin-Chemie AG, Berlin) avec un rapport de 9:1:2:8.
2. Injecter l'animal avec 3 ml / kg de l'anesthésie sous-cutanée. Attendez jusqu'à ce que l'animal est profondément anesthésié (environ 5 min, vérifier les réflexes, par exemple, utiliser le réflexe de retrait pédale). Pour maintenir l'anesthésie lors des mesures en continu injecter la solution anesthésique à un débit de 3 ml / kg / h à l'aide d'une seringue. Contrôler les signes vitaux avec l'équipement approprié (par exemple, la respiration par caméra) et conserver la chaleur animale par placing-le sur un coussin chauffant.
3. Provoquer un traumatisme acoustique, par exemple à l'aide d'une voix forte pure: par exemple, 2 kHz à SPL 115dB pendant 75 min.
4. Après la fin de traumatisme arrêter la pompe seringue et laisser l'animal éveillé dans une cage de réveil sur un coussin chauffant dans un endroit calme. Vérifier régulièrement pendant la phase de réveil si les signes vitaux sont stables. Placez l'animal dans sa cage que lorsqu'il est complètement éveillé. Laissez l'animal se remettre de l'anesthésie (au moins 2 jours) et reste dans sa cage.
5. Effectuer 2,1 à 2,6 fois. Comparez les seuils d'audition avant et après le trauma acoustique en calculant le pourcentage de perte d'audition pour chaque fréquence. Après la fin de toutes les expériences sans douleur euthanasier l'animal.

4. Test de Phantom Perception acoustique (acouphène subjectif)

1. Effectuez ces mesures avant et après le trauma acoustique.
2. Suivez 2,1 à 2,2 si l'animal n'est pas déjà dans la configuration.
3. A nombre des paradigmes de stimulation peut être utilisé pour tester les rongeurs pour acouphène subjectif. Le rapport dans toutes ces approches est de tester la saillance d'un écart de silence dans un bruit de fond. Si l'écart est perçue par les animaux, il peut être utilisé comme un stimulus de test pour réduire une réaction d'alarme de façon analogue à la procédure décrite au point 2. Si l'animal souffre d'acouphènes (qui est susceptible de se développer après un traumatisme acoustique), ce acouphènes sera perçue au sein de l'espace silencieux et permet donc l'écart moins important. L'effet de l'écart sur ​​la réponse de sursaut par conséquent, sera plus faible chez les animaux d'acouphènes chez les témoins sains (PPI réduit, cf. ^8). Ce percept est testé avec deux protocoles légèrement différents.
4. Dans le paradigme de l'acouphène subjectif première présentée ici (. Figure 2A, centre, cf ⁹⁾ utiliser les paramètres suivants pour la stimulation d'intensité sonore: 105 dB SPL sursaut avec des fréquences de 1 à 16 kHz par pas de 1 octave, StimulNous longueur de 6 ms 2 ms y compris les cosinus carré montée et la chute des rampes. Présenter un fond de bruit blanc de 50 dB SPL pendant l'expérience, avec ou sans intervalle de 15 ms qui précède le stimulus de sursaut par 100 ms, présente au moins 15 essais pour chaque fréquence et écart-état. Si vous utilisez une approche non-randomisée, attendez 5 min de récupération entre les séries de relance différentes. L'utilisation de différentes fréquences de stimulation sursaut donnera une estimation approximative de la fréquence perçue acouphènes.
5. Comme un paradigme acouphènes deuxième subjective (Figure 2A, droite), vous pouvez utiliser les paramètres de stimulation suivants: l'intensité du son sursaut 105 dB SPL, double-cliquez sur relance à 0,1 ms de durée par clic et 0,1 ms entre les clics, le second clic ayant le sens inversé par rapport à la première. Présenter un fond de bruit filtré passe-bande de 50 dB SPL avec une largeur de filtre gaussien de 0,5 octaves et des fréquences centrales allant de 1 à 16 kHz par octaves. Présentez ce bruit either, avec ou sans un écart de 15 ms qui précède le stimulus de sursaut de 100 ms, présente au moins 15 essais pour chaque fréquence et l'écart-condition. Si vous utilisez une approche non-randomisée, attendez 5 min de récupération entre les séries de relance différentes. L'utilisation des fréquences centrales différentes du bruit de fond de bande passante donnera une estimation approximative de la fréquence perçue acouphènes.
6. Suivez 2,4 à 2,5; normaliser toutes les données acquises avec des données de référence fixés pour chaque fréquence testée et chaque condition traumatisme, c'est à dire avant et après un trauma acoustique.. Cette référence est l'amplitude de réponse au stimulus de sursaut sons purs sans aucune prestimulus (cf. 2.3). La fréquence est déterminée soit par le ton pur ou la fréquence centrale de la bande passante de bruit filtré. Calculer la réponse moyenne de chaque référence et de normaliser chaque amplitude de la réponse calculée en divisant par sa référence.
7. Calculer IPP en divisant les amplitudes de réponse normalisés de la conditio écartn par la moyenne de l'écart normalisé de non-état de chaque fréquence testée.
8. Calculer la variation IPP après le traumatisme pour cent pour chaque fréquence testée.

Les réactions effarouchées d'animaux sont faciles à générer et à analyser. Figure 2B donne un aperçu d'un résultat typique d'un animal stimulé par un son pur de 105 dB SPL sans prestimulus de 15 fois. La majorité des essais sont des essais valides et non valides sont faciles à reconnaître (essais marquée par un carré rouge). Les amplitudes et latences de réponse sont calculées uniquement à partir des essais valables.

Un changement de comportement de seuil typique est donnée sur la figure 3A. L'audiogramme d'un animal exemplaire acquise avec la méthode décrite au point 2 est donné avant (bleu) et après (rouge) d'un traumatisme acoustique à 2 kHz (zone jaune). Une perte auditive est clairement indiqué spécifiquement à 2 kHz. Les réponses se rapportant à un percept subjective acouphène peut êtrevu sur la figure 3B, les amplitudes de réponse normalisées de l'animal même que ci-dessus sont présentés de manière exemplaire pour les stimulations une octave en dessous et au-dessus du traumatisme tel que décrit à la section 4.5. La comparaison des réponses à des stimuli avec ou sans espace avant (bleu) et après le traumatisme (rouge) permet une interprétation d'une possible percept acouphènes. Dessous de la fréquence des traumatismes aucun changement de schéma de réponse peut être trouvée ci-dessus tandis que le traumatisme de l'effet de l'écart a disparu après le traumatisme, ce qui indique une mispercept à cette fréquence.

Figure 1. Schéma du programme utilisé pour acquérir les seuils comportementaux et subjectifs de données acouphènes. Notez qu'il ne s'agit que d'une version simplifiée du code de programme. Abréviations: GUI - Interface utilisateur graphique; ISI - intervalle entre stimuli.

Figure 2. Stimuli auditifs réponse (ASR) stimuli. A Schémas des trois différents protocoles de stimulation utilisés. Panneau de gauche: pré-impulsion d'inhibition (PPI) de l'ASR mesurée sans aucun stimulus de test de tonalité pure avant (en vert) le ton sursaut (rouge), le délai de réponse est représentée en bleu. Panneau central: espace / paradigme du bruit à la présentation de ton pur stimulus de sursaut de fréquences différentes sur un fond de bruit blanc. Panneau de droite: espace / bruit de paradigme avec la présentation clic stimulus de sursaut sur ​​fond filtré passe-bande de fréquences centrales différentes réponses B exemplaires sursaut auditif de 15 essais enregistrés avec le paradigme du seuil sans prestimulus à 1 kHz fréquence de stimulation.. Trois essais sont comptés invalides (carrés rouges) que l'animal s'est déjà avant le début de la stimulation.

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Figure 3. Résultats exemplaires de l'ASR dans un animal. Un seuil comportemental avant (bleu) et après (rouge) le trauma acoustique à 2 kHz (zone jaune). Les seuils sont calculés à partir des réponses au protocole PPI ASR modulée à l'aide de la fonction de Boltzmann-tournant comme valeur seuil. Notez que la perte d'audition à 2 montants kHz à plus de 66%, tandis que farer loin de la fréquence des traumatismes peuvent souvent voir même l'amélioration des seuils d'audition B amplitudes de réponse normalisés (cercles ouverts:. Essais simples, cercles pleins: des moyens, des moustaches: écart-type) lors de la stimulation avec le protocole écart / bruit de déclic ASR (4,5) pour 1 et 4 fréquences centrales kHz. Réponses sont triées pour des essais avec et sans lacune dans le bruit avant et après le traumatisme à 2 kHz. Seulement à 4 kHz l'effet de l'écart disparaît après le traumatisme qui indique une perception subjective acouphènes autour de cettefréquence.

Discussion

Nous présentons une configuration pas cher et facile à construire pour les mesures audiométriques chez les rongeurs basée sur l'inhibition pré-impulsion du acoustiques réactions effarouchées qui peuvent être utilisés pour déterminer les seuils auditifs comportementaux (= audiogrammes ¹⁰⁾ et auditives fantômes percepts comme acouphènes subjectifs ^11. En particulier, les dernières mesures sont l'objet de plusieurs rapports récents ^8,12,13,14 et peut être considérée comme une condition préalable pour les enquêtes électrophysiologiques des mécanismes neuronaux qui sous-tendent cette maladie. En utilisant cette méthode, il est possible de différencier les animaux qui n'ont point un acouphène subjectif percept après un traumatisme acoustique et ceux qui n'en ont pas, et ensuite étudier plus avant ces individus, par exemple, avec des enregistrements électrophysiologiques dans le cortex auditif primaire.

Une étape essentielle de l'analyse des données de sursaut après un traumatisme acoustique est la normalisation des données à l'amplitude du sursaut qui peutau maximum être obtenus sans précédant stimulus de test: Ceci est particulièrement important de faire la distinction réduit réactions effarouchées sur la base de la perte auditive de réduction IPP chez les animaux d'acouphènes: Les effets du traumatisme acoustique évoluent au fil du temps, que l'animal récupère partiellement de celle-ci, mais à peu près 50 % de la perte auditive est permanente. Contrairement aux rapports mentionnés ci-dessus, où les seuils auditifs sont testés mais non utilisé pour la calibration, nous avons essayé de réduire au minimum les effets des différents seuils d'audition de chaque fréquence et l'effet du traumatisme acoustique lui-même en normalisant chaque amplitude de la réponse à une référence. En outre, nous utilisons deux types de protocoles pour évaluer tout percept acouphènes, avec le premier (4,4) travailler mieux pour animaux testés sur de longues échelles de temps allant d'une semaine après le traumatisme et le second sur «classique» (4,5) fonctionnent mieux pour les animaux testés dans une semaine après le traumatisme.

Une limitation de cette méthode est clearly que l'on ne peut pas évaluer les effets aigus d'un traumatisme sonore. Au moins deux jours entre l'anesthésie et le premier poste de mesure doit être choisi, comme l'animal doit s'en remettre. Pour obtenir une estimation de la perte soudaine de l'audition directement après un traumatisme, une audiométrie du tronc cérébral (BERA) peuvent être utilisés.