Un programma di installazione a basso costo per audiometria comportamentale nei roditori

Summary

Un metodo veloce ed economico per la determinazione del comportamento di sentire parametri come soglie uditive, uditive o percezioni fantasma (tinnito soggettivo) è descritto. Esso utilizza pre-impulso di inibizione della risposta agli stimoli acustici e può essere facilmente implementato in un personal computer utilizzando un programmabile AD / DA-convertitore e un sensore piezoelettrico.

Abstract

Nella ricerca uditiva degli animali è fondamentale per avere informazioni precise sui parametri acustici fondamentali dei soggetti animali che sono coinvolti negli esperimenti. Tali parametri possono essere caratteristiche di risposta fisiologiche del percorso uditivo, ad esempio attraverso audiometria del tronco cerebrale (BERA). Ma questi metodi consentono estrapolazioni solo indirette e incerto circa la percezione uditiva che corrisponde a questi parametri fisiologici. Per valutare il livello percettivo dell'udito, metodi comportamentali devono essere utilizzati. Un potenziale problema con l'uso di metodi comportamentali per la descrizione della percezione in modelli animali è il fatto che la maggior parte di questi metodi comportano una qualche tipo di apprendimento paradigma prima che i soggetti possono essere testati comportamentale, per esempio animali possono imparare a premere una leva in risposta ad un suono. Dal momento che questi paradigmi di apprendimento cambiamento stessa percezione ^1,2 che di conseguenza influenzano alcun risultato sulla percezione ottenuto conquesti metodi e quindi devono essere interpretati con cautela. Le eccezioni sono paradigmi che fanno uso di risposte riflesse, perché qui non paradigmi di apprendimento devono essere effettuate prima del test percettivo. Una tale risposta riflessa è la risposta agli stimoli acustici (ASR), che possono essere altamente riproducibile suscitato con inattesi suoni forti negli animali naïve. Questo ASR a sua volta può essere influenzato da precedenti suoni a seconda della percettibilità questo stimolo precedente: Suoni ben sopra soglia uditiva sarà inibire completamente l'ampiezza della ASR, suoni vicino al limite solo leggermente inibire l'ASR. Questo fenomeno è denominato pre-impulso inibizione (PPI) ^3,4, e la quantità di PPI sul ASR dipende gradualmente sulla percettibilità della pre-impulso. PPI del ASR è quindi adatto per determinare audiogrammi comportamentali in ingenui, non addestrato gli animali, per determinare handicap dell'udito o anche per individuare eventuali percezioni soggettive tinnito in questianimali. In questo articolo viene illustrato l'utilizzo di questo metodo in un modello roditore (cfr. anche rif. ^5), il gerbillo della Mongolia (Merione unguiculatus), che è un noto specie modello per la ricerca della risposta agli stimoli all'interno della gamma normale udito umano (ad es ^6).

Protocol

1. Assemblaggio e installazione software di programmazione

1. Installare un D / A carta in un Personal Computer (ad esempio: NI PCI 6229, National Instruments) e collegarlo a un breakout-box (ad esempio: BNC-2110, National Instruments), entrambi dovrebbero sostenere almeno un ingresso e un canale di uscita con una frequenza di campionamento di almeno 44,1 kHz ciascuno.
2. Collegare l'uscita del breakout-box via cavo BNC ad una amplificazione del suono (ad esempio: AMP75 amplificatore di potenza a larga banda, Thomas Wulf).
3. Installare una webcam a infrarossi (ad esempio: Grand Pro IP Camera, GrandTec Elettronica) per la sorveglianza degli animali nelle tenebre.
4. Installare un ambiente di sviluppo integrato (es.: Matlab) per l'attuazione di un programma definito dal diagramma di flusso riportato in figura 1. Una versione in esecuzione su Matlab 2007b possono essere ottenuti gratuitamente presso l'autore corrispondente.
5. All'interno di una camera insonorizzata installare un altoparlante su un tavolo. Collegare il diffusore to l'amplificatore audio.
6. Installare un sensore piezoelettrico (ad esempio sensore di forza FSG15N1A, Honeywell) su di un pannello isolante, lo sostengono con forza e collegarlo via cavo BNC per l'ingresso del breakout-box, a terra il segnale del sensore.
7. Costruire una camera di misura da un tubo di vetro acrilico adattato alle dimensioni del roditore per misurare (per es gerbilli: lunghezza 15 cm, diametro interno 4,3 cm, diametro esterno 4,8 cm). Fissare una griglia con una larghezza di maglia di 0,5 mm per la parte anteriore del tubo e una porta imbottita con un meccanismo di bloccaggio (ad esempio, un gancio) al retro. Il fissaggio può essere fatto con colla a caldo, la porta si fissa solo la cerniera e la staffa per il gancio al tubo.
8. Fissare piedini in plastica schiuma che si adattano alle dimensioni del tubo di misura sulla scheda del sensore di isolamento. Piedi devono sostenere il tubo sotto l'estremità anteriore e posteriore e sollevare il tubo al sensore di livello. Assicurarsi che vi sia un contatto luce tra il sensore piezoelettrico e la camera di misura. Fissare la scheda del sensore con la camera di misura al centro di fronte al diffusore e mettere un microfono per il controllo del suono accanto ad esso (ad esempio B & Tipo K 2669 / B & Tipo K 4190 collegato ad amplificatore di misura B & K tipo 2610 tutti: Bruel e Kjaer) a livello della testa animali in modo che non interferisca con il tubo.
9. Si noti che la qualità dei dati audiometrici dipenderà dalla qualità del sistema audio. In ogni caso, utilizzare il microfono e amplificatore di misura per determinare la funzione di trasferimento di frequenza del sistema prima ai vostri primi esperimenti e includere una routine nel proprio software per correggere questa funzione di trasferimento di frequenza per rendere l'output spettrale della piana diffusore.
10. Allineare la webcam con la configurazione in modo che si possa controllare il comportamento degli animali.

2. Determinazione del comportamento delle soglie uditive (audiogrammi)

1. Prendere l'animale dalla gabbia casa e metterlo capofitto nel tubo; cperdono la porta.
2. Mettere il tubo sui piedi di schiuma e il sensore. Spegnere qualsiasi luce e chiudere la porta della camera. La camera stessa non è dotata di aria condizionata, ma ha la temperatura, umidità e altre variabili ambientali del laboratorio circostante. Cambiamento aria da ventilatori non è consigliabile a causa del rumore indotto ma il volume della camera sostiene ossigeno per l'animale per molte ore. Attendere 15 minuti per consentire agli animali di abituarsi al setup. Il tempo di acclimatazione è benefico per l'animale in quanto si può calmare il proprio ritmo e abituarsi al tubo. D'altra parte, non si vede alcuna differenza nel comportamento durante il periodo di acclimatazione sopra sessione diversi, che indica che una sessione extra per familiarizzare l'animale con il tubo e la camera prima dell'esperimento non è necessaria.
3. Avviare il programma e definire i parametri per la stimolazione (cfr. anche rif ^5.): Gli stimoli sono costituiti da toni puri con diverse frequenzequenze. Lo stimolo startle deve essere presentato con un livello di pressione sonora sufficiente a suscitare un riproducibile risposte di allarme. Nel nostro laboratorio usiamo intensità di 105 dB SPL (stimolo durata 6 ms di cui 2 ms coseno-squared rampe di salita e di caduta) per ottenere risposte startle in gerbilli della Mongolia. Gli stimoli prova precedente gli stimoli startle sono presentati a varie frequenze ed intensità nell'intervallo da testare, di solito da sotto soglia uditiva a livelli ben al di sopra della soglia e con frequenze che coprono l'intera gamma udibile della specie. Frequenza e durata del startle e lo stimolo di prova sono abbinati in ogni prova, l'intervallo tra interstimulus startle e stimolo test è impostato su 100 ms. Utilizzare almeno 15 ripetizioni con intervalli interstimulus randomizzati di 10 ± 2,5 sec per ogni frequenza e combinazione l'intensità degli stimoli di prova (cfr. figura 2A, a sinistra). Stimoli di test successivi possono essere presentati sia randomizzati o non-corseordine randomizzato. Se si utilizza un non-randomizzato approccio (ad esempio, un livello di stimolo test fissato per tutte le frequenze testate) permettono 5 minuti di recupero tra le serie di stimolo diversi. Si noti che la soglia determinata assoluta dipenderà dalla randomizzazione degli stimoli, ma possibili spostamenti relativi di soglia non (ad esempio dopo trauma acustico, cfr. Rif. ^​​5).
4. Prima di analizzare i dati, rimuovere prove non valide dal set di dati (ad esempio, processi in cui l'animale spostate prima stimolo; trasalimento. Cf Figura 2B).
5. All'interno di una finestra di tempo del primo 50 ms dopo lo stimolo startle, calcolare l'ampiezza di risposta (da picco a picco tra il primo massimo al minimo prima della risposta) e la latenza di risposta (tempo dall'inizio stimolo alla comparsa di risposta) di ogni singola prova .
6. Montare un Boltzmann-funzione per i dati completi ampiezza di risposta indicati su una frequenza ordinati per intensità prestimulus per tutti singl validoposta prove. Il punto 50% del Boltzmann-funzione ⁷ indica la soglia dell'udito per questa frequenza di stimolazione.

3. Trauma acustico e quantificazione di danni all'udito

1. Preparare ketamina-xilazina-anestesia con una miscela di chetamina cloridrato: 96 mg / kg (ketamina-ratiopharm Ratiopharm); xilazina cloridrato: 4 mg / kg (Rompun 2%, Bayer); atropina solfato: 1 mg / kg (Atropinsulfat, B. Braun Melsungen AG) e NaCl-soluzione fisiologica (Berlin-Chemie AG, Berlino) con un rapporto di 9:1:2:8.
2. Iniettare l'animale con 3 ml / kg di anestesia sottocutanea. Attendere fino a quando l'animale è profondamente anestetizzato (ca. 5 minuti, controllare i riflessi, ad esempio, utilizzare il ritiro riflesso pedale). Per mantenere l'anestesia durante le misurazioni, continuamente iniettare la soluzione di anestetico ad una velocità di 3 ml / kg / ora usando una pompa a siringa. Controllare i segni vitali con attrezzature adeguate (ad esempio, la respirazione tramite telecamera) e tenere al caldo sottoprodotti di origine animale Placing su un pad riscaldamento.
3. Indurre un trauma acustico, ad esempio usando un tono puro ad alta voce: ad esempio 2 kHz a 115 dB SPL per 75 min.
4. Dopo la fine del trauma fermare la pompa a siringa e lasciare che l'animale sveglio in un servizio di sveglia gabbia su un blocco di riscaldamento in un luogo tranquillo. Controllare regolarmente durante la fase di risveglio, se i segni vitali sono stabili. Mettere l'animale nella sua gabbia casa solo quando è completamente sveglio. Lasciate che l'animale riprendersi dall'anestesia (almeno 2 giorni) e di riposo nella sua gabbia casa.
5. Eseguire 2,1-2,6 nuovo. Confronta le soglie uditive prima e dopo il trauma acustico calcolando la percentuale di perdita dell'udito per ogni frequenza. Dopo la fine di tutti gli esperimenti indolore eutanasia dell'animale.

4. Test per acustica Percezione Phantom (L'acufene soggettivo)

1. Eseguire queste misurazioni prima e dopo il trauma acustico.
2. Seguire 2,1-2,2 se l'animale non è già nel setup.
3. A numero di paradigmi di stimolazione può essere usato per testare roditori per tinnito soggettivo. Il rapporto in tutti questi approcci è quello di testare per la rilevanza di una lacuna silenziosa all'interno di un rumore di fondo. Se la distanza è percepita dagli animali, può essere utilizzato come stimolo di prova per ridurre una risposta startle analogamente a quanto descritto al punto 2. Se l'animale soffre di tinnito (che è a rischio di sviluppare dopo trauma acustico), questo sarà tinnito percepito nel gap silenzioso e rende quindi il divario meno rilevanti. L'effetto del gap sulla risposta di trasalimento conseguenza sarà più debole in animali tinnito rispetto ai controlli sani (PPI ridotto, cf. ^8). Questa percezione è testato con due protocolli leggermente diversi.
4. Nel primo paradigma tinnito soggettivo presentato qui (. Figura 2A, centro, cf ⁹⁾ utilizzare i seguenti parametri per la stimolazione: intensità sonora startle 105 dB SPL, con frequenze da 1 a 16 kHz in passi di 1 ottava, Stimulnoi lunghezza 6 ms di cui 2 ms coseno-squared ascesa e rampe di caduta. Presentare uno sfondo bianco rumore di 50 dB SPL durante l'esperimento, con o senza un gap 15 ms che precede lo stimolo trasalimento di 100 ms; presenti almeno 15 prove per ogni frequenza e gap-condizione. Se si utilizza un approccio non-randomizzato, permettono 5 minuti di recupero tra i set di stimoli diversi. L'uso di differenti frequenze di stimolo startle darà una stima approssimativa della frequenza percepita tinnito.
5. Come un secondo paradigma tinnito soggettivo (Figura 2A, a destra) è possibile utilizzare i seguenti parametri di stimolazione: intensità sonora startle 105 dB SPL, fare doppio clic su stimolo con 0,1 ms di durata per click e 0,1 ms tra i due clic, il secondo clic con la direzione invertita rispetto al primo. Presentare un fondo filtrato passa-banda di rumore di 50 dB SPL con una larghezza di filtro gaussiano di 0.5 ottave e frequenze centrali che vanno da 1 a 16 kHz in ottava. Presentate questo EI rumorether con o senza fessure 15 ms che precede lo stimolo startle da 100 ms; presenti almeno 15 prove per ogni frequenza e gap-condizione. Se si utilizza un approccio non-randomizzato, permettono 5 minuti di recupero tra i set di stimoli diversi. L'uso di frequenze centrali diverse del rumore di fondo banda darà una stima approssimativa della frequenza percepita tinnito.
6. Seguire 2,4-2,5; normalizzare tutti i dati acquisiti con un dati di riferimento fissati per ogni frequenza testata e ogni condizione di trauma, cioè prima e dopo un trauma acustico.. Questo riferimento è l'ampiezza risposta allo stimolo puro startle tono senza prestimulus (cf. 2,3). La frequenza è determinata dal tono puro o la frequenza centrale del rumore passabanda filtrato. Calcolare la risposta media di ogni riferimento e di normalizzare ogni ampiezza di risposta calcolato dividendo attraverso il suo riferimento.
7. Calcola PPI dividendo le ampiezze di risposta normalizzati del conditio gapn attraverso la media normalizzata no-gap condizione di ciascuna frequenza testate.
8. Calcolare la variazione PPI dopo il trauma in percentuale per ogni frequenza testata.

Le risposte di startle animali sono facili da generare e analizzare. Figura 2B fornisce una panoramica di un tipico risultato di un animale stimolato con un tono puro di 105 dB SPL senza prestimulus per 15 volte. La maggior parte delle prove sono prove valide e non valide sono facili da riconoscere (prove contrassegnato da quadrato rosso). Le ampiezze e latenze di risposta vengono calcolati solo da prove valide.

Un tipico cambiamento comportamentale soglia è data in Figura 3A. L'audiogramma di un animale esemplare acquisito con il metodo descritto in 2 è dato prima (blu) e dopo (rosso) un trauma acustico a 2 kHz (area gialla). La perdita dell'udito è mostrata chiara specificamente a 2 kHz. Le risposte relative ad un tinnito soggettivo percezione può esserevisto in figura 3B, le ampiezze normalizzate risposta dell'animale stesso come sopra indicato sono esemplarmente per stimolazioni un'ottava sotto e sopra il trauma come descritto in 4.5. Il confronto delle risposte agli stimoli con e senza spazio prima (blu) e dopo il trauma (rosso) permette l'interpretazione di una possibile percezione tinnito. Sotto la frequenza trauma nessun cambiamento di modello di risposta può essere trovata mentre sopra il trauma l'effetto del gap scomparso dopo il trauma, indicando un mispercept a questa frequenza.

Figura 1. Diagramma di flusso del programma utilizzato per acquisire le soglie comportamentali e soggettive dati tinnito. Si noti che questa è solo una versione semplificata del codice di programma. Abbreviazioni: GUI - interfaccia grafica utente, ISI - intervallo tra stimolo.

Figura 2. Uditive startle risposta (ASR) stimoli. A Schemi di tre diversi protocolli di stimolazione utilizzati. Sinistra: pre-impulso inibizione (PPI) del ASR misurata senza alcuno stimolo puro tono di prova prima (verde) il tono di startle (rosso), il tempo di reazione è rappresentato in blu. Pannello centrale: gap / paradigma rumore con pura presentazione dello stimolo tono trasalimento di frequenze diverse su uno sfondo di rumore bianco. Pannello destro: gap / rumore paradigma con la presentazione click stimolo di trasalimento al passa-banda filtrata sfondo di frequenze centrali diverse B esemplari risposte uditive startle di 15 studi registrati con il paradigma soglia senza prestimulus a 1 kHz stimolazione.. Tre studi sono contati non validi (quadrati rossi) come l'animale si muoveva già prima dell'inizio stimolazione.

<img alt = "Figura 3" src = "/ files/ftp_upload/4433/4433fig3.jpg" />
Figura 3. Risultati esemplari di ASR in un animale. Una soglia comportamentale prima (blu) e dopo (rosso) il trauma acustico a 2 kHz (area gialla). Le soglie sono calcolate dalle risposte al modulato protocollo PPI ASR utilizzando la funzione di Boltzmann-svolta come valore di soglia. Si noti che la perdita dell'udito a 2 kHz pari a oltre il 66%, mentre farer di distanza dal trauma una frequenza spesso può vedere anche un miglioramento della soglia audiometrica B ampiezze effetto normalizzato (cerchi aperti:. Prove singole, cerchi pieni: mezzi, baffi: deviazione standard) durante la stimolazione con lo spazio / rumore click ASR protocollo (4.5) per le frequenze kHz 1 e 4 centri. Le risposte sono ordinati per prove senza e con gap nel rumore prima e dopo il trauma a 2 kHz. Solo a 4 kHz l'effetto del gap svanisce dopo il trauma che indica una percezione soggettiva tinnito risolvere questofrequenza.

Discussion

Vi presentiamo una configurazione a basso costo e facile da costruire per le misure audiometrici nei roditori sulla base di pre-impulso inibizione di risposte acustiche startle che possono essere utilizzati per determinare le soglie uditive comportamentali (= audiogrammi ¹⁰⁾ e uditive percetti fantasma come tinnito soggettivo ^11. In particolare le misure di questi ultimi sono al centro di alcuni recenti rapporti ^8,12,13,14 e può essere visto come un prerequisito per le indagini elettrofisiologiche dei meccanismi neuronali alla base di questa malattia. Con questo metodo è possibile distinguere gli animali che ha elaborato un tinnito soggettivo percept dopo trauma acustico e quelli che non ha fatto, e poi più a fondo tali individui, ad esempio, con le registrazioni elettrofisiologiche nella corteccia uditiva primaria.

Un punto critico nell'analisi dei dati startle dopo trauma acustico è la normalizzazione dei dati per l'ampiezza che può startleal massimo essere raggiunta senza precedenti stimolo test: Questo è particolarmente importante distinguere ridotte risposte startle basato su perdita dell'udito da PPI ridotta negli animali tinnito: Gli effetti del trauma acustico stanno cambiando nel corso del tempo, come l'animale recupera parzialmente da esso, ma circa il 50 % della perdita dell'udito è permanente. In contrasto con i rapporti di cui sopra, dove vengono testate le soglie uditive ma non utilizzati per la calibrazione, si è cercato di minimizzare gli effetti delle diverse soglie uditive di ogni frequenza e l'effetto del trauma acustico si normalizzando ciascuna ampiezza della risposta con un riferimento. Inoltre si utilizzano due diversi tipi di protocolli per valutare qualsiasi percezione tinnito, con il primo (4.4) di lavoro migliore per gli animali testati su tempi più lunghi di una settimana dopo il trauma e il secondo sul "classico" (4.5) lavorare meglio per gli animali sottoposti a test una settimana dopo il trauma.

Un limite di questo metodo è Clearly che non è possibile valutare gli effetti acuti di un trauma acustico. Almeno due giorni tra l'anestesia e la prima post-misura deve essere scelto, come l'animale deve recuperare da esso. Per ottenere una stima della perdita di udito acuto subito dopo il trauma, audiometria tronco cerebrale (BERA) può essere utilizzato.