Низкая стоимость установки для поведенческой аудиометрии в Грызуны

Summary

Быстрый и недорогой метод для определения поведенческих услышав такие параметры, как порогов слуха, нарушениями слуха или фантомного восприятия (субъективного шума в ушах) описывается. Он использует предварительного импульса торможения акустического отклика испуга и может быть легко реализована в персональном компьютере с использованием программируемых AD / DA-конвертер и пьезо датчик.

Abstract

В слуховых исследований на животных важно иметь точную информацию об основных параметрах слух животного субъектов, которые участвуют в эксперименте. Такими параметрами могут быть физиологические особенности реакции слухового пути, например, через ствол мозга аудиометрия (BERA). Но эти методы позволяют лишь косвенные и неопределенные экстраполяции о слухового восприятия, который соответствует этим физиологическим параметрам. Для оценки уровня восприятия слуха, поведенческие методы должны быть использованы. Потенциальная проблема с использованием поведенческих методов для описания восприятия в моделях на животных является тот факт, что большинство из этих методов включают некоторые виды обучения парадигмы перед субъектами могут быть поведенчески испытания, например, животных, возможно, придется научиться нажимать на рычаг в ответ на звук. Поскольку эти изменения парадигмы обучения восприятию себя ^1,2, следовательно, они будут влиять любой результат о восприятии, полученные сэти методы, и поэтому должны быть интерпретированы с осторожностью. Исключением являются парадигмами, которые используют рефлекторные реакции, потому что здесь нет парадигмы обучения должны быть проведены до восприятия тестирование. Одним из таких рефлекс представляет собой акустический ответ испуга (ASR), которая может сильно воспроизводимо быть вызваны неожиданными громкими звуками в наивной животных. Это ASR в свою очередь может зависеть от предшествующих звуков в зависимости от ощутимость этой предыдущего стимула: Звучит намного выше порога слышимости будет полностью подавляют амплитуду ASR; звучит, близких к пороговым будет лишь слегка тормозить ASR. Это явление называется предварительного импульса торможения (PPI) ^3,4, а количество PPI на ASR постепенно зависит от ощутимость предварительного импульса. ИЦП ASR поэтому хорошо подходит для определения поведенческих аудиограммы в наивным, не дрессированных животных, чтобы определить, нарушениями слуха или даже для выявления возможных субъективных восприятий шум в ушах в этихживотных. В этой статье мы продемонстрируем применение этого метода в грызунах (см. также исх. ^5), Монгольская песчанка (Meriones unguiculatus), который представляет собой хорошо знать модель вида для испуга исследования реагирования в рамках нормального человеческого диапазон слуха (например, ^6).

Protocol

1. Сборка и установка программного обеспечения Программирование

1. Установите D / A карту в персональный компьютер (например, NI PCI 6229, National Instruments) и подключить его к прорыву-бокс (например: BNC-2110, National Instruments), оба должны поддерживать по крайней мере один вход и один выход канала с частотой дискретизации не менее 44,1 кГц каждый.
2. Подключите выход прорыва ящик через BNC кабель усилитель звука (например: AMP75 широкополосный усилитель мощности, Томас Вульф).
3. Установите инфракрасную веб-камеру (например: Grand Pro IP-камера, Grandtec Electronics) для животных наблюдение в темноте.
4. Установка интегрированной среды разработки (например, Matlab) для реализации программы по определению схема приведена на рисунке 1. Версия работает на Matlab 2007b может быть получен бесплатно от соответствующего автора.
5. В звуконепроницаемой камере установки громкоговорителя на стол. Подключите динамик тO усилитель звука.
6. Установить датчик пьезо (например, датчик силы FSG15N1A, Honeywell) в верхней части изоляционные плиты, поддерживать его и подключить его через BNC кабель к входу прорыва коробки; землю сигнала датчика.
7. Сборка измерительной камере с акриловой стеклянной трубки доводят до размера грызуна для измерения (для песчанок, например: длина 15 см, внутренний диаметр 4,3 см, внешний диаметр 4,8 см). Исправить решетку с размером ячеек 0,5 мм в передней части трубки и мягкая дверь с замком механизма (например, крюк) в тыл. Фиксация может быть сделано с горячим клеем, к двери только петли и залог за крючок крепится к трубе.
8. Прикрепить пенопласта ног, которые соответствуют размерам измерительной трубки на изолирующей датчиков. Ноги должны поддерживать трубу под передний и задний конец и поднимите трубку с датчиком уровня. Убедитесь в том, что есть легкий контакт между датчиком и пьезо-измерительную камеру. Закрепить датчик доска с измерительной камере в центре передней панели динамик и положил микрофон для звукового контроля рядом с ним (например, B & K типа 2669 / B & K типа 4190 подключен к измерительный усилитель B & K типа 2610, всего: Bruel и Kjaer) на уровне головы животных, чтобы она не мешала трубку.
9. Обратите внимание, что качество вашей аудиометрических данных будет зависеть от качества вашей звуковой системы. В любом случае, использовать микрофон и измерительный усилитель для определения функции частоты передачи вашей системы до вашего первые опыты и включают в себя рутину в ваше программное обеспечение для исправления этой функцией передачи частот, чтобы сделать спектральный выход акустической плоской.
10. Совместите веб-камера с установкой так, что один может контролировать поведение животных.

2. Поведенческие определения порогов слуха (аудиограмма)

1. Возьмите животное из своей клетки и положил его головой вперед в трубу, стеряют дверь.
2. Положите трубку на пену ногами и датчиком. Выключите свет и любые закрыть дверь в камеру. Камера сама по себе не кондиционер, но имеет температуры, влажности и других параметров окружающей среды окружающих лаборатории. Air изменений, вентиляторы не рекомендуется в связи с индуцированной шумом, но объем камеры поддерживает кислорода для животных в течение многих часов. Подождите 15 минут, чтобы позволить животному привыкнуть к установке. Акклиматизации время является выгодным для животных, как это может успокоиться в своем собственном темпе и привыкнуть к трубке. С другой стороны, не видит никакого различия в поведении во время акклиматизации времени, в течение нескольких сессии, которая указывает, что дополнительная сессия для ознакомления животных с трубкой и камерой до эксперимента не требуется.
3. Запустите программу и определить параметры стимуляции (см. также ссылка ^5.): Стимулы состоят из чистых тонов различной частотычастотами. Испуга стимул должны быть представлены с уровня звукового давления достаточно высоким, чтобы воспроизводимо вызывать реакции испуга. В нашей лаборатории мы используем интенсивностью 105 дБ SPL (стимул длительностью 6 мс 2 мс в том числе косинус квадрат взлеты и падения рампы), чтобы вызвать испуг ответы в монгольских песчанок. Тест стимулов предшествующей испуга стимулов представлены на различных частот и интенсивностей в диапазоне быть проверены, как правило, снизу порога слышимости до уровня значительно выше порога и с частотами, охватывающей весь звуковой диапазон видов. Частота и продолжительность испуга и тестового стимула подбираются в каждом испытании, interstimulus интервал между испуга и тестового стимула установлено в 100 мс. Используйте как минимум 15 повторений с интервалом рандомизированных interstimulus 10 ± 2,5 сек для каждой частоты и интенсивности сочетание тестовых воздействий (см. рис 2А, слева). Последующие стимулы теста могут быть представлены в любом рандомизированных или не побежалрандомизированных порядке. Если вы используете нерандомизированных подход (например, один тестовый стимул уровень, установленный для всех протестированных частотах), позвольте 5 мин восстановления между различными наборами стимулов. Обратите внимание, что определяется абсолютный порог будет зависеть от рандомизации раздражители, но возможны относительные сдвиги пороговой не будет (например, после акустической травмы, ср. Исх. ^5).
4. Прежде чем анализировать данные, удалять неверные испытаний из набора данных (например, испытания, где животное перемещается до испуга стимулов;. См. Рисунок 2B).
5. За время окна первых 50 мс после испуга стимул, рассчитать амплитуды отклика (от пика до пика между первым максимумом на первый минимум ответа) и задержку ответа (время от начала стимула к реакции начало) каждого отдельного суда .
6. Установить Больцмана-функция полного ответа амплитуды набор данных одной частоте отсортированы по prestimulus интенсивности для всех действительных синглэлектронной испытания. 50% точкой Больцмана-функция ⁷ указывает на порог слышимости для этой стимуляции частотой.

3. Акустическая травма и количественной оценки нарушением слуха

1. Подготовка кетамин-ксилазина-анестезии смесью кетамина гидрохлорид 96 мг / кг (кетамин-ратиофарм, Ratiopharm); ксилазина гидрохлорид: 4 мг / кг (Rompun 2%, Bayer), атропина сульфата 1 мг / кг (Atropinsulfat, B. Braun Melsungen AG) и физиологический раствор NaCl-(Berlin-Chemie AG, Берлин) при соотношении 9:1:2:8.
2. Вводят животным с 3 мл / кг массы подкожной анестезии. Подождите, пока животное находится глубоко под наркозом (около 5 мин, проверить рефлексы, например, использовать рефлекс педаль вывода). Для поддержания анестезии во время измерений, непрерывно вводят обезболивающий раствор со скоростью 3 мл / кг / ч с помощью шприца насос. Управление жизненно важных с соответствующим оборудованием (например, дыхание через камеру) и держать животное теплом placiнг его на потепление площадку.
3. Вызвать акустической травмы, например, с помощью громкого чистого тона: например, 2 кГц, 115 дБ SPL в течение 75 минут.
4. После окончания травмы остановить шприцевой насос и дайте животному спать в пробуждения клетке на потепление площадку в тихом месте. Регулярно проверяйте во время пробуждения фазу, если жизненно важные признаки являются стабильными. Положите животное в своем доме клетка лишь тогда, когда он полностью проснулся. Пусть животное оправиться от наркоза (по крайней мере 2 дня) и отдыха в своем доме клетке.
5. Выполните 2,1 до 2,6 раз. Сравнить порогов слуха до и после акустической травмы, вычисляя процент потери слуха для каждой частоты. После окончания всех экспериментов безболезненно усыпить животное.

4. Тест для акустического восприятия Phantom (субъективный шум в ушах)

1. Выполнить эти измерения до и после акустической травмы.
2. Следите 2,1 до 2,2, если животное уже не в установке.
3. Пхариус стимуляции парадигмы может быть использован для тестирования грызунов для субъективного шума в ушах. Соотношение во всех этих подходов для проверки значения, которое придается тихий разрыв в пределах фоновых шумов. Если разрыв воспринимается животным, он может быть использован в качестве тестового стимула к снижению реакции испуга аналогично процедуре, описанной в 2. Если животное страдает от шума в ушах (что, скорее всего, развиваться после акустической травмы), этот звон в ушах будет восприниматься в тихой щели и, следовательно, делает разрыв менее значимыми. Влияние щели на старт-рефлекс, следовательно, будет слабее, шум в ушах у животных по сравнению с контрольной (снижение PPI, ср. ^8). Это восприятие проверяется с двух слегка различных протоколов.
4. В первом субъективного шума в ушах парадигмы, представленные здесь (. Рисунок 2А, центр, ср ⁹⁾ использовать следующие параметры для стимуляции: испуга интенсивности звука 105 дБ SPL с частотой от 1 до 16 кГц в 1 октаву, Стимулнам длину 6 мс 2 мс в том числе косинус квадрат взлеты и падения рампы. Представьте белом фоне шума 50 дБ УЗД в ходе эксперимента, с или без 15 мс разрыв, который предшествует испуга стимулов на 100 мс; настоящему не менее 15 испытаний для каждой частоты и пробелов состоянии. При использовании нерандомизированных подхода, позволяющие 5 мин восстановления между различными наборами стимулов. Использование различных частот испуга стимул даст грубую оценку предполагаемой частоты шума в ушах.
5. В качестве второй субъективный шум в ушах парадигмы (рис. 2A, право), вы можете использовать следующие параметры стимуляции: испуга интенсивности звука 105 дБ SPL, дважды щелкните стимула 0,1 мс за клик и 0,1 мс между кликами, второй клик имеющие перевернутого направлении по сравнению с первым. Представьте фильтруется полосовым фоновый шум 50 дБ SPL с гауссовым фильтром шириной 0,5 октавы и центральными частотами в диапазоне от 1 до 16 кГц с интервалом в октаву. Представить этот шум Е.И.термо с или без 15 мс разрыв, который предшествует испуга стимулов на 100 мс; настоящему не менее 15 испытаний для каждой частоты и пробелов состоянии. При использовании нерандомизированных подхода, позволяющие 5 мин восстановления между различными наборами стимулов. Использование различных частот центре фонового шума полосовой даст грубую оценку предполагаемой частоты шума в ушах.
6. Следите 2,4 до 2,5; нормализовать все полученные данные со ссылкой набор данных для каждого испытания частоты и каждая травма состояния, то есть до и после акустической травмы.. Эта ссылка амплитуды отклика к чистой стимул испуга тон без prestimulus (ср. 2,3). Частота определяется либо чистый тон или центральной частоте полосы пропускания фильтруют шум. Рассчитать среднюю характеристику каждой ссылки и нормализовать каждый рассчитан ответ амплитудой, разделив его через свою ссылку.
7. Рассчитайте индекс цен путем деления нормированных амплитуд реакции разрыва conditioп через среднее нормированного не запрещенной состояние каждого испытания частоты.
8. Рассчитать изменение PPI после травмы в процентах для каждого испытания частоты.

Испуга реакции животных легко генерировать и анализировать. Рис. 2В дает обзор типичных результате одно животное стимулировали чистый тон 105 дБ SPL без prestimulus в 15 раз. Большинство испытаний действительных и недействительных испытаний легко распознать (испытаний отмечены красным квадратом). Ответ амплитуды и задержки рассчитываются только из действительных испытаний.

Типичные поведенческие изменения порога приведена на рис 3А. Аудиограммы примерной животных, полученных с помощью метода, описанного в 2 дается до (синий) и после (красная) акустической травмы при 2 кГц (желтая зона). Ясно потерей слуха показано конкретно на 2 кГц. В ответах, связанных с восприятием субъективного шума в ушах может бытьпоказано на рисунке 3B, нормированные амплитуды ответа одного и того же животного, как выше показано образцово для раздражения одну октаву выше и ниже травмы, как описано в 4.5. Сравнение ответов на стимулы и без зазора до (синий) и после травмы (красный) позволяет интерпретация возможного восприятия шума в ушах. Ниже травмы частоты без изменения ответ картина может быть найден в то время как над травмой эффект разрыв исчез после травмы, что указывает на mispercept на этой частоте.

Рисунок 1. Блок-схема программы, используемой для приобретения поведенческих порогов и субъективные данные шум в ушах. Обратите внимание, что это всего лишь упрощенная версия кода программы. Сокращения: GUI - графический интерфейс пользователя; ISI - интервал между стимулом.

Рисунок 2. Слуховая реакция вздрагивания (ASR) раздражители. Схемы из трех различных протоколов стимуляции используется. Слева: предымпульса торможения (PPI) в ASR измеряется без чистого стимула тестового сигнала до (зеленый) испуга тона (красный); ответа период изображен в синем. Центр панель: Разрыв / шум парадигмы с чистого тона испуга стимул презентации различных частот на белом фоне шумов. Справа: Разрыв / шум парадигмы со щелчком презентации стимул испуга на полосовых фильтром фоне различных частотах центр B Примерные слуховые испуга ответов из 15 испытаний, записанные с порога парадигму без prestimulus на частоте 1 кГц стимуляции.. Три испытания считаются недействительными (красный квадрат), как животное переехала еще до начала стимуляции.

<IMG ALT = "Рисунок 3" SRC = "/ files/ftp_upload/4433/4433fig3.jpg" />
Рисунок 3. Примерные результаты ASR у одного животного. Поведенческие порога до (синий) и после (красная) акустической травмы на 2 кГц (желтая зона). Пороги рассчитываются из ответов на PPI модулированный протокол ASR помощью функции Больцмана-поворотным пунктом как пороговое значение. Обратите внимание, что потеря слуха на 2 кГц составляет более 66%, в то время как путник от одной частоты травм часто можно увидеть даже улучшение порогов слуха B нормализованной амплитуды ответа (кружки. Одного испытания, кружки: средства, усы: стандартное отклонение) при стимуляции с разрывом / шум нажмите ASR протокола (4,5) для 1 и 4 кГц частоты центра. Ответы сортируются для проведения испытаний без и с щелью в шум до и после травмы на 2 кГц. Только в 4 кГц эффект разрыва исчезает после травмы, которая указывает на субъективное восприятие шума в ушах вокруг этогочастоты.

Discussion

Мы представляем дешево и легко построить установку для измерения аудиометрии у грызунов на основе предварительного импульса торможения акустических испуга ответов, которые могут быть использованы для определения поведенческих порогов слуха (аудиограмма = ¹⁰⁾ и слухового восприятия, как призрак субъективный шум в ушах ^11. Особенно последнего измерения находятся в центре внимания нескольких последних докладах ^8,12,13,14 и может рассматриваться как одна предпосылка для электрофизиологических исследований нейронные механизмы, лежащие в основе этого заболевания. С помощью этого метода можно дифференцировать, какие животные действительно развивать субъективный шум в ушах воспринимать после акустической травмы и те, которые не сделали, и затем дальнейшее расследование этих лиц, например, с помощью электрофизиологических записей в первичной слуховой коры.

Важным шагом в анализе данных испуга после акустической травмы является нормализация данных на испуга амплитуды, которые могутмаксимально быть вызвана без предварительного тестового стимула: Это особенно важно различать уменьшить испуга ответы, основанные на потерю слуха от снижения PPI у животных, шум в ушах: эффекты акустической травмы меняются с течением времени, как животное частично восстанавливается, но примерно на 50 % от потери слуха является постоянным. В отличие от докладов, упомянутых выше, где слуховые пороги испытания, но не используется для калибровки, мы постарались свести к минимуму влияние различных порогов слуха каждой частоты и эффект акустической травмы само по нормализации каждый ответ амплитуды со ссылкой. Кроме того, мы используем два вида протоколов для оценки любой шум в ушах восприятия, с первого (4,4) работает лучше для подопытных животных в течение длительных временных масштабах от одной недели после травмы, а второй «классической» (4,5) работает лучше для подопытных животных в течение через неделю после травмы.

Ограничение этого метода является Клиожелезная дорога, что никто не может оценить острых эффектов акустической травмой. По крайней мере, два дня между анестезией и первый после измерения должны быть выбраны, как у животного, чтобы оправиться от этого. Для получения оценки острой потере слуха непосредственно после травмы, аудиометрия ствола мозга (BERA) могут быть использованы.