Summary
यहाँ हम के लिए आवश्यक उपकरणों का विकास
Abstract
हम फ्लोरोसेंट मार्करों और भ्रूण माउस neuroepithelium के संवर्धन के स्लाइस के रहते इमेजिंग एकीकृत एक प्रणाली विकसित की है. हम अनुरेखण वंश आनुवंशिक सेल के लिए मौजूदा माउस लाइनों का फायदा उठाया: एक tamoxifen-inducible Cre लाइन और Cre की मध्यस्थता पुनर्संयोजन पर dsRed व्यक्त एक Cre संवाददाता लाइन. Tamoxifen के एक अपेक्षाकृत कम स्तर का उपयोग करके, हम हमारे व्यक्तिगत कोशिका विभाजन का पालन करने की अनुमति, कोशिकाओं की एक छोटी संख्या में पुनर्संयोजन को उत्पन्न करने में सक्षम थे. इसके अतिरिक्त, हम एक Olig2-EGFP ट्रांसजेनिक लाइन 1-3 का उपयोग कर ध्वनि का हाथी (श) संकेत करने ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया मनाया और हम सिलिया मार्कर, Sstr3-GFP के 4 व्यक्त वायरस के साथ सुसंस्कृत टुकड़ा संक्रमण से सिलिया के गठन पर नजर रखी. छवि के क्रम में neuroepithelium, हम न्यूरल ट्यूब अलग, E8.5 पर भ्रूण काटा, इमेजिंग कक्ष में समुचित संवर्धन परिस्थितियों में तंत्रिका टुकड़ा घुड़सवार और समय चूक confocal इमेजिंग प्रदर्शन किया. हमारे पूर्वविवो रहते इमेजिंग विधि हमें एक physiologically प्रासंगिक ढंग से प्राथमिक cilia गठन और श्श्श प्रतिक्रिया के सापेक्ष समय का आकलन करने के लिए एकल कोशिका विभाजन का पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है. इस विधि को आसानी से अलग फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग कर अनुकूलित और क्षेत्र में सीटू और वास्तविक समय में सेल के व्यवहार पर नजर रखने के साथ जो उपकरण प्रदान किया जा सकता है.
Protocol
वयस्क चूहों यांत्रिक ग्रीवा अव्यवस्था से euthanized हैं. सभी जानवर प्रक्रियाओं IACUC और एमोरी विश्वविद्यालय में जैव सुरक्षा समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.
1. भ्रूण पीढ़ी
- क्रॉस tamoxifen-inducible Cre लाइन, CAGGCreER, और dsRedCre संवाददाता रेखा (टीजी (सीएजी Bgeo, dsRed * MST) 1Nagy) (चित्रा 1) 5,6. बेटी कोशिकाओं, पार CAGGCreER और Olig2-EGFP बीएसी ट्रांसजेनिक चूहों (टीजी (Olig2-EGFP) के EK23Gsat) (चित्रा 1) 7,8 साथ dsRed लाइन में श प्रतिक्रिया के सापेक्ष समय पर नजर रखने के लिए.
- 100% इथेनॉल में tamoxifen के भंग, और रचनात्मक अभिव्यक्ति और कोशिकाओं के एक छोटे सबसेट में dsRed लेबलिंग प्रेरित करने के लिए भ्रूण 6.5 (E6.5) पर गर्भवती महिलाओं में शरीर के वजन के 40 ग्राम प्रति 2.5 मिलीग्राम tamoxifen के intraperitoneal इंजेक्शन प्रदर्शन करते हैं.
- 48 घंटे बाद, भ्रूण काटना फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग dsRed सकारात्मक भ्रूण की पहचान, संस्कृति डिश के लिए स्थानांतरण और observपूर्व vivo इमेजिंग के दौरान ई एकल कोशिका विभाजन (नीचे देखें).
2. पूरे माउस भ्रूण संस्कृति
- 10% नवजात बछड़ा सीरम और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) 9 के साथ पूरक DMEM/F12 (1:1) युक्त पूर्व गर्म धोने मध्यम में E8.5 भ्रूण काटना.
- सीधे फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे 37 डिग्री सेल्सियस हीटिंग मंच पर विच्छेदन, जगह भ्रूण के बाद और GFP और / या dsRed सकारात्मक (देखें नीचे) के रूप में पहचान.
- एक एल Glutamine साथ पूरक फिनोल लाल के बिना 50% एक Sprague-Dawley पुरुष से सीरम चूहा और 50% DMEM/F12 (1:1) युक्त पूर्व equilibrated संस्कृति मीडिया के 500 μl ड्रॉप और के 1% में 2 भ्रूण के लिए ऊपर स्थानांतरण 0.85% NaCl और पी / एस 9 में 1 एम HEPES.
- वाष्पीकरण को रोकने और संस्कृति पकवान 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर भ्रूण युक्त स्थानांतरित करने के लिए मध्यम से अधिक equilibrated प्रकाश खनिज तेल की एक पतली परत (0.1 सेमी) लागू करें.
3.वायरल संक्रमण
- Neuroepithelium में लेबल सिलिया करने के लिए, एक E8.5 भ्रूण युक्त संस्कृति के माध्यम से एक 500 μl equilibrated ड्रॉप करने Sstr3-GFP lentivirus के 5-10 μl, लगभग 2 लाख virions, जोड़ें.
- संस्कृति के 18 घंटे के बाद, वायरस बाहर धोने और न्यूरल ट्यूब टुकड़ा तैयार करने के लिए धोने के माध्यम के कई बूंदों में संक्रमित भ्रूण हस्तांतरण.
4. लाइव इमेजिंग के लिए तंत्रिका ट्यूब स्लाइस तैयारी
- एक 1% अगर लेपित पकवान पर, एक माइक्रो चाकू आकार 0.025 मिमी का उपयोग कर पूर्व गर्म धोने मध्यम में E8.5 भ्रूण की न्यूरल ट्यूब काटना.
- 35 मिमी पाली एल lysine लेपित गिलास नीचे पकवान पर फिनोल लाल बिना equilibrated संस्कृति के माध्यम से एक 150 μl ड्रॉप में अलग न्यूरल ट्यूब उदर नीचे की ओर रखें.
- क्रम में कांच coverslip के एक संकीर्ण टुकड़ा द्वारा 100% शुद्ध पेट्रोलियम जेली और घुड़सवार न्यूरल ट्यूब के आसपास पिघल मोमबत्ती मोम (IKEA से मोमबत्ती), और धीरे प्रेस से बना एक 1:1 मिश्रण की छोटी मात्रा में रखोनमूना स्थिर करना.
- Equilibrated प्रकाश खनिज तेल की एक पतली परत (~ 0.1 सेमी) (चित्रा 2) के साथ पकवान कवर.
5. इमेजिंग और समय चूक Confocal माइक्रोस्कोपी जीते
- तापमान को नियंत्रित करता है कि एक पर्यावरण कक्ष के साथ सुसज्जित Confocal उल्टे माइक्रोस्कोप स्कैन निकॉन A1R लेजर के तहत जगह पकवान, 37 के लिए सेट डिग्री सेल्सियस, और 5% सीओ 2.
- 40x उद्देश्य तेल विसर्जन उपयोग Olig2-GFP और dsRed सकारात्मक कोशिकाओं पर नजर रखने के लिए है, जबकि GFP लेबल सिलिया और dsRed सकारात्मक कोशिकाओं को रिकॉर्ड करने के लिए 60x उद्देश्य तेल विसर्जन का प्रयोग करें.
- समय चूक इमेजिंग की स्थिति स्थापित करने के लिए एनआईएस तत्वों सॉफ्टवेयर खोलें. हर 10 मिनट में 1.5 माइक्रोन (40x उद्देश्य) और 0.4 माइक्रोन (60x उद्देश्य) की एक अंतर के साथ ऊपर से 8 मीटर की दूरी के साथ z-ढेर 25 माइक्रोन तक का अधिग्रहण. यदि आवश्यक हो तो 488 और 561 एनएम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और प्रेषित चैनल का प्रयोग करें. 512 x 512 आकार में छवियों मोल. पूर्णांक के एकाधिक उपयोगकर्ता से परिभाषित क्षेत्रों सेट करेंerest एक साथ रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने के लिए.
, स्कैन गति 1, रेखा औसत 2 और पिन होल का आकार (61, छवि के लेजर शक्ति और चमक के लिए इष्टतम जोखिम उपयोग कम लेजर तीव्रता (4.5% तक की EGFP 405/488 mCherry 561 के लिए ऊपर से 11%) द्वारा समायोजित किया गया dsRed के लिए माइक्रोन, Olig2 के लिए 28.1 माइक्रोन, SSTR3GFP के लिए 72 माइक्रोन, dsRed और SSTR3GFP के लिए 61.3 माइक्रोन, dsRed और Olig2 के लिए 58 माइक्रोन). आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट संवाददाताओं का उपयोग हमें कम लेजर शक्ति के साथ चमक का पता लगाने में सक्षम होना चाहिए. - Imaris 3D पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर दर्ज डेटा का विश्लेषण.
6. Immunofluorescence
- एक गिलास पकवान में 1 घंटे के लिए बर्फ पर 4% paraformaldehyde / 0.1 एम फास्फेट बफर (4 डिग्री सेल्सियस) में भ्रूण या अलग न्यूरल ट्यूब को ठीक करें.
- नमूने बर्फ पर पीबीएस में 2 घंटे (4 डिग्री सेल्सियस) (परिवर्तन पीबीएस कुछ बार) और रात में या भ्रूण सिंक तक 30% सूक्रोज / 0.1 एम फास्फेट बफर में डाल धो लें.
- -80 में सूखी बर्फ और दुकान डिग्री सेल्सियस पर, अक्टूबर में फ्रीज शामिल करें पीcryostat (10 मिमी) पर सेक्शनिंग erform.
- 1% गर्मी निष्क्रिय भेड़ सीरम युक्त धोने के समाधान में 10 मिनट और 0.1% पीबीएस में ट्राइटन X-100 के लिए स्लाइड्स धो लें.
- सांद्रता निम्नलिखित में धोने के समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी पतला: चूहा मोनोक्लोनल विरोधी आरएफपी (5F8), 1:200, खरगोश विरोधी Arl13b सीरम 1:1500 और माउस मोनोक्लोनल विरोधी Arl13b 01:05 (295B/54), खरगोश विरोधी Olig2 1:300, माउस monoclonals Pax6, श और Nkx2.2 सभी 01:10; और Ki67 1:500 पॉलीक्लोनल खरगोश. फ्लैट humidified कक्ष में स्लाइड प्रति 150 μl आसपास जोड़ें, बाहर सुखाने से बचने और 4 बजे रात में छोड़ डिग्री सेल्सियस तक parafilm के साथ कवर
- तीन बार, 20 मिनट प्रत्येक समय कमरे के तापमान पर धोने के समाधान में स्लाइड्स धो लें.
- 1:200 एकाग्रता में धोने के समाधान में माध्यमिक एंटीबॉडी एलेक्सा Fluor 488, 568, 350 पतला. नाभिक दाग Hoechst 1:3,000 या करने वाली प्रो 3 1:500 का प्रयोग करें. स्लाइड प्रति 150 μl जोड़ें, प्रकाश से सुरक्षित humidified कक्ष में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए छोड़ दें.
- धोने समाधान tw में स्लाइड्स धो लेंओ बार, कमरे के तापमान पर 30 मिनट प्रत्येक समय.
- माउंट 24 घंटे के भीतर गोल्ड विरोधी फीका अभिकर्मक और देखने लम्बा 80% में स्लाइड.
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Representative Results
यहाँ हम E8.5 माउस neuroepithelium भीतर एकल कोशिका विभाजन के पूर्व vivo रहते इमेजिंग प्रदर्शन किया. व्यक्ति की कोशिकाओं लेबल करने के लिए, हम पुनर्संयोजन 5,6 (चित्रा 3) पर dsRed व्यक्त कि एक Cre संवाददाता लाइन युक्त कोशिकाओं के एक सबसेट में Cre recombinase प्रेरित किया. इस प्रकार, 48 घंटा बाद हम पूर्व vivo इमेजिंग (आंकड़े -4 ए डी) के दौरान एकल कोशिका विभाजन का निरीक्षण कर रहे थे. 1-3, लेबल कोशिकाओं बीएसी ट्रांसजेनिक Olig2-EGFP रेखा (आंकड़े 4G एन आंकड़े -3 सी डी) संशोधित एक श्श्श ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर सहित द्वारा श्श्श उत्तरदायी बन गया जब समन्वित रूप से, हम पर नजर रखी. सिलिया गठन का पालन करने के लिए हम संस्कृति में भ्रूण को संक्रमित करने Sstr3-GFP lentivirus उत्पन्न (चित्रा 3 बी, आंकड़े -4 ए डी) 4. Immunofluorescence विवो परिणाम (आंकड़े 4E एफ) में पुष्टि करने के लिए किया गया था.
समय गोदOlig2-EGFP व्यक्त या इन विट्रो संस्कृति में दौरान Sstr3-GFP lentivirus से संक्रमित dsRedCre संवाददाता भ्रूण की ई confocal इमेजिंग अवलोकन चित्रा 5 10 में दिखाया जाता है. हम सिलिया कल्पना करने के लिए इस्तेमाल कर रहे थे Sstr3-GFP अभिव्यक्ति किसी भी अंतर्निहित जैविक प्रक्रिया के साथ हस्तक्षेप नहीं किया गया था सुनिश्चित होना करने के लिए, हम निश्चित जंगली प्रकार भ्रूण वर्गों के साथ हमारे जीने इमेजिंग डेटा पुष्टि की. हम सिलिया गठन और श्श्श जवाब में asynchrony की इसी प्रतिशत पाया, क्योंकि यह SSTR3-GFP के वायरस इन प्रक्रियाओं (चित्रा 5A) को प्रभावित नहीं किया है इंगित करता है.
चित्रा 1. माउस neuroepithelium का उपयोग कर पूर्व vivo रहते इमेजिंग प्रक्रिया का प्रवाह चार्ट. अंतिम माउस पार और tamoxiदलदल उपचार पूरे माउस भ्रूण संस्कृति विधि द्वारा पीछा चित्रित कर रहे हैं. Fluorescently टैग प्रोटीन व्यक्त भ्रूण चयनित और रहते इमेजिंग के लिए तैयार हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. रहते इमेजिंग के लिए न्यूरल ट्यूब टुकड़ा तैयारी. ए) विखंड जोड़े की पहली उपस्थिति के साथ E8.5 बेसुरा भ्रूण. बी) के पूर्व गर्म माध्यम में विच्छेदित न्यूरल ट्यूब एक सूक्ष्म चाकू का उपयोग कर. सी) न्यूरल ट्यूब टुकड़ा पर उदर की ओर नीचे मुहिम शुरू की है न्यूरल ट्यूब के आसपास लागू किया और धीरे से एक ना द्वारा कवर पेट्रोलियम जेली और मोम से बना एक मिश्रण की पाली एल lysine लेपित गिलास नीचे पकवान. डी) छोटी राशिकांच coverslip के RROW टुकड़ा. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. Confocal माइक्रोस्कोपी के साथ न्यूरल ट्यूब के जीवित कोशिकाओं में fluorescently टैग प्रोटीन Visualizing. ए) dsRed लेबल व्यक्ति की कोशिकाओं. वे फार्म (पीले तीर) के रूप में प्राथमिक cilia में व्यक्त बी) SSTR3-GFP lentivirus. सीडी) Olig2-GFP ले जाने E8.5 भ्रूण neuroepithelium भीतर GFP अभिव्यक्ति से पता चलता है. बार 30 माइक्रोन (ए, डी), 15 माइक्रोन है (बी) और 1.5 माइक्रोन (सी).
4 चित्रा. विभाजन के दौर से गुजर विकासशील न्यूरल ट्यूब की कोशिकाओं को विभाजित में निगरानी सिलिया गठन और श्श्श संकेत. ई.) एकल dsRed सकारात्मक सेल पहले अन्य सेल (सी, सफेद तीर) को एक बेटी सेल में एक पलक रूपों को दर्शाता है. फिल्म के हर 10 मिनट में एक फ्रेम की दर से उतारी थी. एफई) इम्यूनोफ्लोरेसेंस हरे रंग में आरएफपी (dsRed वंश अनुरेखण के लिए) और लाल रंग में Arl13b (सिलिया के लिए) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग. Hoechst (एफ). जीएन) बिना बॉक्सिंग क्षेत्र (ई), की वृद्धि dsRed सकारात्मक कोशिका विभाजन (आईएम) आए. Olig2-GFP के ही एक बेटी (जे, एन) में व्यक्त किया है. रिकॉर्डिंग एक फ्रेम हर 10 मिनट की दर पर उतारी थी. बार 5 माइक्रोन (ई.), 50 माइक्रोन (एफ), 25 माइक्रोन (जीएन) है.
चित्रा 5. सिलिया और श्श्श उपस्थिति के साथ dsRed सकारात्मक सेल की गिनती. विभाजन और सिलिया स्थानीयकरण के दौर से गुजर dsRed कोशिकाओं के एक) संख्या. रहते इमेजिंग सिलिया गठन तुल्यकालिक था द्वारा प्रतीक * इसका मतलब है. बी) dsRed और विभाजन और श्श्श संकेत के दौर से गुजर Olig2-GFP सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या.
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Discussion
हमारे पूर्व vivo प्रणाली हमें सीधे वास्तविक समय में विकासशील neuroepithelium भीतर एकल कोशिका विभाजन का निरीक्षण करने के लिए सक्षम बनाता है. एक उदाहरण के रूप में हम माउस भ्रूण न्यूरल ट्यूब के भीतर कोशिका विभाजन की जांच की और पलक गठन या श्श्श प्रतिक्रिया या तो नजर रखी. हम अपनी तकनीक physiologically प्रासंगिक डेटा प्रदान करता है का संकेत निश्चित वर्गों (एन = 178) से परिणामों के साथ संगत कर रहे थे हमारे इमेजिंग परिणाम (एन = 24) की पुष्टि की.
हमारी तकनीक tamoxifen के खुराक सटीक होना चाहिए ताकि Cre प्रेरण कोशिकाओं का एक सबसेट के लिए सीमित किया जा रहा है पर निर्भर करता है. हम एकल कक्षों लेबलिंग के लिए खुराक का काम किया. हम यह tamoxifen के 6 से एक खुराक निर्भर प्रतिक्रिया दिखाई जो CAGGcreER लाइन की प्रारंभिक विश्लेषण के आधार पर खुराक में मामूली वृद्धि के साथ कोशिकाओं के छोटे क्लोन लेबल करने के लिए आसान हो जाएगा विश्वास करते हैं. शर्तों बंद कर रहे हैं अगर असामान्य विकास होता है के रूप में इसके अलावा, भ्रूण संस्कृति की स्थिति, महत्वपूर्ण हैं.हम विकास के कम से कम 36 घंटे 11 के लिए काम करने के लिए जाना जाता है जो हम इस्तेमाल संस्कृति शर्तों के तहत सामान्य रूप से कार्यवाही की पुष्टि की.
हम उपयोग inducible Cre और रचनात्मक संवाददाता लाइनों सार्वजनिक रूप से उपलब्ध हैं इतनी आसानी से सवालों की एक किस्म के साथ शोधकर्ताओं के लिए यह तकनीक काफी अनुकूलनीय बनाने प्राप्त किया जा सकता है. हमारी तकनीक की असली शक्ति आनुवंशिक एकल कक्षों लेबलिंग में, हमारे दृष्टिकोण के कई मौजूदा और भविष्य उत्परिवर्ती माउस लाइनों में एकल कक्ष व्यवहार पूछताछ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह सही मायने में विकास के दौरान स्तनधारी भ्रूण कोशिकाओं के भीतर प्रत्यक्ष अवलोकन के रूप में इन लाइनों के कई में गलत हो रहा है बड़े पैमाने पर जांच नहीं की गई है क्या समझ में महत्वपूर्ण हो जाएगा. कम लेजर शक्ति के साथ चमक का पता लगाने के लिए आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के हमारे incorporaton इस तरह के अवलोकन के लिए एक वास्तविक लाभ प्रदान करता है. यह विशिष्ट सेलुलर organelles अंकन fluorescently टैग प्रोटीन या अन्य टीआर कल्पना करना आसान हैanscriptional संवाददाताओं से भविष्य में एकीकृत किया जा रहा है.
हम प्राथमिक पक्ष्म गठन और एक विभाजित सेल की बेटी कोशिकाओं में श्श्श प्रतिक्रिया के सापेक्ष समय में रुचि रखते थे. हालांकि, हमें श्श्श प्रतिक्रिया पर नजर रखने के लिए सक्षम है कि ट्रांसजेनिक लाइन एक ही सेल में प्राथमिक पलक, Sstr3-GFP के मार्कर को देखने से हमें precluding, cytoplasm भर Olig2-EGFP व्यक्त की. इस प्रकार, हम बहुत एक परमाणु प्रतिबंधित Olig2-EGFP या एक प्रेतसंबंधी अलग Sstr3 फ्लोरोसेंट प्रोटीन संलयन या तो से लाभान्वित होगा.
लक्षित और ट्रांसजेनिक लाइन का उपयोग करने के अलावा, हम अपनी तकनीक वायरल निर्माणों का उपयोग कर अनुकूलित और संस्कृति में neuroepithelium को संक्रमित उपयोगी डेटा प्रदान करता है कि हो सकता है कि पता चला है. यह एक आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस लाइन की पीढ़ी की तुलना में एक तेज विधि प्रदान करने में जांचकर्ताओं के लिए उपयोगी हो जाएगा. इसके अतिरिक्त, दृष्टिकोण इस तरह के एक लाइन की पीढ़ी को मान्य कर सकते हैं, वास्तव में, हमारे डेटा एक ट्रांस बहसSstr3-GFP व्यक्त genic लाइन क्षेत्र के लिए बहुत काम का हो जाएगा.
हमारे विधि के क्षेत्र में अधिक तुरंत सेल व्यवहार की निगरानी कर सकते हैं, जिसके साथ उपकरण प्रदान करता है. माउस म्यूटेंट की समृद्ध संसाधनों के लिए युग्मित हम इस विधि के बगल में सेलुलर व्यवहार की एक सरणी की जांच में विशेष रूप से शक्तिशाली होने की उम्मीद है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस शोध परियोजना के एक ARRA के अनुपूरक, 5 R01 NS056380 द्वारा समर्थित किया गया था. अतिरिक्त समर्थन वायरल वेक्टर कोर और एमोरी न्यूरोसाइंस NINDS कोर सुविधाएं अनुदान, P30NS055077 के माइक्रोस्कोपी कोर के माध्यम से प्रदान किया गया. स्थिर SSTR3-GFP IMCD3 सेल लाइन के लिए ग्रेग Pazour, हम GENSAT से माउस लाइन पाने के लिए एमोरी ट्रांसजेनिक माउस और जीन लक्ष्य निर्धारण कोर धन्यवाद और Sstr3-GFP lentiviral लिए ब्राडली Yoder निर्माण. मोनोक्लोनल एंटीबॉडी NICHD के तत्वावधान में विकसित विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक से प्राप्त की और आयोवा विश्वविद्यालय, जीव विज्ञान विभाग, आयोवा सिटी, आइए 52,242 से बनाए रखा गया. सभी जानवर प्रक्रियाओं IACUC और एमोरी विश्वविद्यालय में जैव सुरक्षा समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
| Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
| CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
| Newborn calf serum | Lonza | 14-416F | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Rat Serum SD male | Harlan Bioproducts | 4520 | |
| 1M Hepes | BioWhittaker | 17-737E | |
| L-Glutamine | GIBCO | 21041-025 | |
| Light mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Sstr3-GFP lentivirus | Emory Viral Core | ||
| Micro-knife, size 0.025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
| 35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish | MatTek | P35GC-0-10-C | |
| 100% Petroleum Jelly | Kroger | FL9958c | |
| A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope | Nikon | ||
| NIS Elements software | Nikon | ||
| Imaris 3D software | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Parafolmaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffer | Lab made | ||
| Rat monoclonal anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
| Rabbit anti-Arl13b serum | NeuroMab | ||
| mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
| Rabbit anti-Olig2 | Chemicon | AB9610 | |
| Mouse monoclonals Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
| Mouse monoclonalsShh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
| Mouse monoclonals Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
| Rabbit polyclonal Ki67 | Abcam | AB15580 | |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
| Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| H–chst | Fisher | AC22989 | |
| TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36934 |
References
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