Summary
ここでは、のために必要なツールを開発
Abstract
私たちは、蛍光マーカーおよび胚マウス神経上皮の培養スライスのライブイメージングを統合するシステムを開発しました。私たちは、トレース系統遺伝細胞のための既存のマウス系統を利用しました：タモキシフェン誘導性CreのラインとのCreレポーターラインはCreを媒介組換えによりDsRedの発現。タモキシフェンの比較的低レベルを用いて、我々は我々は、個々の細胞分裂に従うことを可能にして、少数の細胞で組換えを誘導することができた。さらに、我々は、Olig2-EGFPトランスジェニックライン1-3を使用して、我々はウイルスが繊毛マーカー、SSTR3-GFP 4を発現培養スライスを感染させることにより繊毛の形成を監視シグナリング（シーッ）ソニック·ザ·ヘッジホッグに転写応答を観察した。イメージするためには神経上皮は、我々は神経管を単離し、E8.5で胚を採取し、撮影室への適切な培養条件の神経スライスをマウントし、タイムラプス共焦点イメージングを行った。当社EX生体ライブイメージング法は、一次繊毛形成と生理学的に適切な方法でShhの応答の相対的なタイミングを評価するために、単一の細胞分裂をトレースすることを可能にします。この方法は簡単明瞭な蛍光マーカーを使用して適応され、フィールドを、その場で 、リアルタイムで細胞の挙動を監視するためにどのとツールを提供しすることができます。
Protocol
成体マウスは、機械頸椎脱臼により安楽死させる。すべての動物の手順はIACUCとエモリー大学のバイオセーフティ委員会によって承認された。
1。胚の生成
- クロスタモキシフェン誘導性Creをライン、CAGGCreER、およびdsRedCreレポーターライン点（Tg（CAG-Bgeo、-DsRedを* MST）1Nagy）（ 図1）5,6。娘細胞、クロスCAGGCreERとOlig2-EGFP BACトランスジェニックマウス（Tgは（Olig2-EGFP）EK23Gsat）（ 図1）7,8とDsRedのラインにおけるShhの応答の相対的なタイミングを監視する。
- 100％エタノールでタモキシフェンを溶解し、Creの発現と細胞の小さなサブセットでDsRedのラベルを誘導するために胚6.5（E6.5）で妊娠した女性に体重40グラムあたり2.5 mgのタモキシフェンの腹腔内注射を行う。
- 48時間、後、胚を解剖蛍光顕微鏡を用いたDsRed肯定胚を特定し、培養皿にそれらを転送しobservex vivoでの撮影時の電子の単一細胞分裂（下記参照）。
2。全体マウス胚培養
- 10％新生仔ウシ血清及び1％ペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）9を補充したDMEM/F12（1:1）を含む予め温めた洗浄媒体でE8.5胚を解剖する。
- 直接蛍光顕微鏡下で37℃の加熱ステージ上で解剖、場所後の胚及びGFPおよび/またはDsRedをプラス（下記参照）として識別します。
- L-グルタミン、フェノールレッドを含まない50％のSprague-Dawley系雄性ラットの血清および50％DMEM/F12（1:1）を含む予め平衡培地500μlの降下との1％に2胚まで転送0.85％NaCl及びP / S 9の1M HEPES。
- 蒸発を防ぎ、培養皿を37℃、5％CO 2インキュベーターに胚を含む転送する媒体を介して平衡化した軽油の薄い層（0.1センチ）を適用します。
3。ウイルス感染
- 神経上皮におけるラベル繊毛するためには、E8.5胚を含む培養培地500μlの平衡化の一滴までSSTR3-GFPレンチウイルスの5-10μlを、約200万ビリオンを追加します。
- 文化の18時間後、ウイルスを洗い流すと、神経管のスライスを準備するために洗浄媒体の数滴に感染した胚を移す。
4。ライブイメージングのための神経管のスライス標本
- 1％寒天コーティングされた皿に、マイクロナイフの大きさ0.025ミリメートルを使用して予め温めておいた洗浄媒体におけるE8.5胚の神経管を解剖。
- 35ミリメートルポリ-L-リジンコートガラスボトムディッシュ上のフェノールレッドなしの平衡化培地150μlのドロップで孤立神経管腹側を下に置きます。
- するために、ガラスカバースリップの狭い部分で100％純粋なワセリンとマウント神経管の周りに溶けたろうそくのろう（IKEAからろうそく）、ゆっくりと押しから作られた1:1の混合物の少量を入れてサンプルを固定。
- 平衡化した軽油の薄い層（〜0.1センチメートル）（ 図2）皿をカバーしています。
5。ライブイメージングとタイムラプス共焦点顕微鏡
- 温度を調節する環境室を装備ニコンA1Rレーザ走査共焦点倒立顕微鏡下に置く皿は、37℃、5％CO 2を設定してください。
- 40倍の油浸対物レンズの使用がOlig2-GFPとDsRedの陽性細胞を監視する一方、GFPラベル繊毛とDsRedの陽性細胞を記録するために60倍の油浸対物レンズを使用してください。
- タイムラプス撮影条件を設定するためにNISの要素ソフトウェアを開きます。 10分ごとに1.5ミクロン（40倍目標）と0.4μmの（60倍目標）の間隔で最大8ミクロンの間隔で25ミクロンまでのzスタックを取得する。必要に応じて488と561 nmの励起波長と送信チャネルを使用してください。 512×512のサイズで画像を取得する。 int型の複数のユーザ定義領域を設定する同時記録を行うことerest。
、スキャン速度1、線平均2とピンホールの大きさ（61、画像のレーザパワーと明るさに最適な露出、使用低いレーザー強度（4.5％までEGFP 488分の405 mCherry 561は最大11％）で調整したDsRedのためのミクロン; Olig2ための28.1ミクロン; SSTR3GFPための72ミクロン、DsRedのとSSTR3GFPための61.3ミクロン、DsRedのとOlig2用58ミクロン）。遺伝的に符号化された蛍光レポーターの使用は、低レーザパワーと明るさを検出することができました。 - Imaris 3D再構築ソフトウェアを使用して記録されたデータを分析します。
6。免疫蛍光
- ガラス皿で1時間氷上で4％パラホルムアルデヒド/ 0.1 Mリン酸緩衝液（4℃）で胚あるいは孤立神経チューブを固定します。
- 氷（4℃）でPBSのサンプル2時間（変化PBS数回）洗浄し、一晩または胚シンクまで、30％スクロース/ 0.1Mリン酸緩衝液に入れ。
- -80でドライアイスや店舗℃の上、10月に凍結を埋め込むPクライオスタット（10ミリメートル）で切片erform。
- 1％の熱不活化羊血清および0.1％トリトンX-100 PBS中を含む洗浄溶液中で10分間スライドを洗浄します。
- ウサギ抗血清Arl13b 1:1500及びマウスモノクローナル抗Arl13b 1時05分（295B/54）;、ウサギ抗Olig2ラットモノクローナル抗RFP（5F8）、1:200以下の濃度で洗浄溶液中の一次抗体を希釈1:300、マウスモノクローナルPax6の、シーッとNkx2.2-すべて1時10分、およびKi67の1:500ポリクローナルウサギ。乾燥避け、4℃で一晩のままにフラット加湿チャンバー内のスライドあたり150μlの、パラフィルムでカバー周り追加℃に
- 三回、20分毎に時間室温で洗浄溶液中でスライドを洗浄します。
- 1:200濃度の洗浄溶液で二次抗体アレクサフルーア488、568、350を希釈。核を染色するためにヘキスト1:3,000またはTO-PRO-3 1:500を使用します。スライドあたり150μlを添加し、光から保護加湿チャンバー内で室温で1時間のままにしておきます。
- 洗浄ソリューションTWのスライドを洗うoが時間、室温で30分間、毎回。
- 80％でマウントスライドは24時間以内にゴールドアンチフェード試薬およびビューを延ばす。
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Representative Results
ここでは、E8.5マウス神経上皮内の単一細胞分裂のex vivoでのライブイメージングを行った。個々の細胞を標識するためには、組換え5,6（ 図3A）に基づいDsRedを表明したCreレポーター行を含む細胞のサブセットにCreリコンビナーゼを誘導した。したがって、48時間後に我々はex vivoでイメージング（ 図4A-D）の間に単一の細胞分裂を観察することができました。 1-3、標識された細胞は、BACトランスジェニックOlig2-EGFPライン（ 図4G-N図3C-D）に変更Shhの転写レポーターを含めて、Shhの応答になったときに付随して、我々は監視した。繊毛の形成を観察するために、我々は文化の中で胚を感染させるためにSSTR3-GFPレンチウイルスを生成した（ 図3B、図4A-D）4。免疫蛍光は、 インビボの結果（ 図4E-F） で確認するために実施した。
時間周電子dsRedCreリポーター胚の共焦点イメージング観測Olig2-EGFPを発現しているか、またはin vitro培養中SSTR3-GFPレンチウイルスを感染させたが、 図5で示している。我々は繊毛を可視化するために使用していたSSTR3-GFP発現が基礎となる生物学的プロセスに干渉していなかったことを確認するために、我々は一定の野生型胚セクションで私たちのライブイメージングデータを裏付け。我々は、繊毛の形成とShhの応答で非同期の同じ割合を発見したので、SSTR3-GFPウイルスは（ 図5A）これらのプロセスに影響を与えなかったことを示します。
図1。マウス神経上皮を用いたex vivoでのライブイメージング手順のフローチャート。最終マウスクロスとtamoxiフェン処理は、全体マウス胚培養法に続いて示されている。蛍光標識タンパク質を発現する胚を選択してライブイメージングのために準備されています。 大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。神経管のライブイメージングのためのスライス標本。）体節のペアの最初の外観を持つE8.5ひっくり返されていない胚。マイクロナイフを使用して予め温めておいた培地中で解剖B）神経管。C）神経管スライスが上腹側を下にマウントされている神経管の周囲に塗布し、穏やかナによって覆わワセリン、ワックスの混合物から作られたポリ-L-リジン被覆ガラスボトムディッシュ。D）少量ガラスカバースリップのrrowピース。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3。共焦点顕微鏡で神経管の生細胞内の蛍光標識タンパク質を可視化する。）DsRedのラベルは、個々の細胞。彼らは形（黄色矢印）などの一次繊毛で表現B）SSTR3-GFPレンチウイルス。CD）Olig2-GFPを運ぶE8.5胚神経上皮内でGFPの発現を示す。バーは30μmの（A、D）、15ミクロン（B）と1.5μmの（C）である。
図4。分裂を受けて監視開発神経管の分裂細胞における繊毛形成とShhのシグナル。AD）シングルDsRedの陽性細胞は、事前の他の細胞（C、白矢印）への1つの娘細胞に繊毛の形態を示しています。映画は10分ごとに1フレームの割合で画像化した。EF）免疫蛍光は緑色でRFP（DsRedの系譜トレース用）と赤でArl13b（繊毛用）に対する抗体を用いた。ヘキスト（F）なしで囲まれた領域の拡大（E）。GN）DsRedの陽性細胞が分裂（IM）を受ける。 Olig2-GFPは、1つの娘（J、N）で表される。記録1フレーム毎に10分の速度で画像化した。バーは5μmの（AD）、50ミクロン（F）、25ミクロン（GN）です。
図5。繊毛とShhの外観を持つDsRedの陽性細胞の計数。分裂と繊毛局在を受けたDsRed細胞の）番号 。ライブイメージングの繊毛形成が同期だったことで記号*を意味しますB）たDsRedと除算とShhのシグナルを受けOlig2-GFP陽性細胞の数。
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Discussion
当社のex vivoでシステムが直接、リアルタイムで開発神経上皮内の単一細胞分裂を観察することを可能にします。例として、我々はマウス胚神経管の中に細胞分裂を検討し、繊毛形成またはShhの応答のいずれかを監視した。私たちは、イメージング結果（N = 24）私たちの技術は生理学的に適切なデータを提供示す固定部（N = 178）の結果と一致していたことを確認した。
我々の手法は、タモキシフェンの投与量が正確でなければならないので、細胞のサブセットに限定されるものではCreの誘導に依存しています。我々は、単一の細胞を標識するための投薬を働いた。我々は、それがタモキシフェン6に用量依存的な反応を示したCAGGcreERラインの初期分析に基づく線量のわずかな増加と細胞の小さなクローンにラベルを付けることは簡単だろうと考えています。条件がオフである場合に発達異常が発生するとさらに、胚培養条件は、重要である。私たちは、開発は、少なくとも36時間11のために働くことが知られている我々が使用される培養条件の下で正常に進行することが確認された。
我々が使用する誘導性のCreとCreをレポーターラインは公に利用可能なので、質問の様々な研究者に、この手法は非常に適応作り容易に得ることができる。本手法の真の力は、遺伝的に単一細胞を標識では、我々のアプローチは、多くの既存および将来の変異マウス系統の単一の細胞の挙動を調べるために使用できることである。これは、開発中の哺乳類の胚内の細胞を直接観察が広く検討されていないとして、本当にこれらの行の多くで間違って何が起こっているかを理解する上で重要になります。低レーザパワーと明るさを検出するために遺伝的に符号化された蛍光レポーターの私達incorporatonは、このような観察のための本当の利点を提供する。これは、特定の細胞小器官をマーキング蛍光標識タンパク質または他のTRを想像することは容易であるanscriptional記者は、将来的に統合される。
我々は一次繊毛形成と分裂細胞の娘細胞におけるShhの応答の相対的なタイミングに興味を持っていた。しかし、私たちはShhの応答を監視するために有効にトランスジェニックラインが同じセル内に一次繊毛、SSTR3-GFPのマーカーを見てから私たちを排除し、細胞質全体Olig2-EGFPを発現した。従って、我々は非常に制限された核のOlig2-EGFPまたはスペクトル的に異なるSSTR3蛍光タンパク質融合どちらの恩恵を受けたであろう。
ターゲットを絞ったトランスジェニックラインを使用することに加えて、私たちは技術はウイルスの構造を使用して適応し、文化の中で神経上皮に感染すると、有用なデータを提供することができることを示した。これは、遺伝子組み換えマウスラインの世代よりも速くする方法を提供することに研究者に有用であろう。さらに、このアプローチは、そのような行の生成を検証することができ、確かに、我々のデータは、トランスを主張SSTR3-GFPを発現している遺伝子の行は、フィールドに大いに役立つでしょう。
本手法は、フィールドがもっとすぐに細胞の挙動を監視することのできるツールを提供します。マウス変異体の豊富な資源に結合された私たちは、この方法は、その場で携帯電話の動作の配列を調べることで、特に強力であることを期待しています。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されていない。
Acknowledgments
この研究プロジェクトは、ARRAサプリメント、5 R01 NS056380によってサポートされていました。追加のサポートは、ウイルスベクターコアとエモリー神経NINDSコア設備助成、P30NS055077の顕微鏡コアを介して提供されました。 SSTR3-GFPレンチウイルスコンストラクトのために、ブラッドリーYoder発信;安定SSTR3-GFP IMCD3細胞ラインのグレッグPazour、我々はGENSATからマウスラインを導出するためのコアをターゲットエモリートランスジェニックマウスと遺伝子に感謝します。モノクローナル抗体は、NICHDの後援の下で開発された発達研究ハイブリドーマ銀行、、から入手し、アイオワ大学、生物科学科、アイオワシティ、アイオワ52242によって維持された。すべての動物の手順はIACUCとエモリー大学のバイオセーフティ委員会によって承認された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
| Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
| CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
| Newborn calf serum | Lonza | 14-416F | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Rat Serum SD male | Harlan Bioproducts | 4520 | |
| 1M Hepes | BioWhittaker | 17-737E | |
| L-Glutamine | GIBCO | 21041-025 | |
| Light mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Sstr3-GFP lentivirus | Emory Viral Core | ||
| Micro-knife, size 0.025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
| 35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish | MatTek | P35GC-0-10-C | |
| 100% Petroleum Jelly | Kroger | FL9958c | |
| A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope | Nikon | ||
| NIS Elements software | Nikon | ||
| Imaris 3D software | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Parafolmaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffer | Lab made | ||
| Rat monoclonal anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
| Rabbit anti-Arl13b serum | NeuroMab | ||
| mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
| Rabbit anti-Olig2 | Chemicon | AB9610 | |
| Mouse monoclonals Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
| Mouse monoclonalsShh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
| Mouse monoclonals Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
| Rabbit polyclonal Ki67 | Abcam | AB15580 | |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
| Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| H–chst | Fisher | AC22989 | |
| TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36934 |
References
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