Summary
Här utvecklar vi de verktyg som behövs för
Abstract
Vi utvecklade ett system som integrerar live-avbildning av fluorescerande markörer och skivor odling av embryonala mus neuroepithelium. Vi drog fördel av befintliga muslinjer för genetisk cellsläktträd spåra: a tamoxifen-inducerbar Cre linje och en Cre reporter som uttrycker DsRed på Cre-medierad rekombination. Genom att använda en relativt låg nivå av tamoxifen, kunde vi inducera rekombination i ett litet antal celler, som tillåter oss att följa individuella celldelningar. Dessutom observerade vi transkriptionell svar på Sonic Hedgehog (Shh) signalering med en OLIG2-eGFP transgen linje 1-3 och vi övervakade bildandet av flimmerhår genom att infektera odlade skiva med virus som uttrycker flimmerhåren markör, Sstr3-GFP 4. För att bilden av neuroepitelet, vi skördade embryon vid E8.5, isolerat neuralrörsdefekter, monterade den neurala skiva i lämpliga odlingsbetingelser till avbildning kammaren och utfört tidsförlopp konfokala avbildning. Vår exvivo realtidsundersökning metod ger oss möjlighet att spåra enskilda celldelningar att bedöma den relativa tidpunkten för primär cilia bildning och Shh svar i en fysiologiskt relevant sätt. Denna metod kan lätt anpassas med olika fluorescerande markörer och ger fältet de verktyg med vilka för att övervaka cellens beteende in situ och i realtid.
Protocol
Vuxna möss avlivas genom mekanisk cervikal dislokation. Alla animaliska förfaranden godkändes av IACUC och Biosäkerhetskommittén vid Emory University.
Ett. Embryo Generation
- Cross tamoxifen-inducerbara Cre linje, CAGGCreER och dsRedCre reporter linje (Tg (CAG-Bgeo,-DsRed * MST) 1Nagy) (Figur 1) 5,6. För övervakning av relativa timingen för Shh respons i dottercellerna, cross CAGGCreER och DsRed linje med OLIG2-EGFP BAC transgena möss (Tg (OLIG2-EGFP) EK23Gsat) (Figur 1) 7,8.
- Lös tamoxifen i 100% etanol, och utför intraperitoneal injektion av 2,5 mg tamoxifen per 40 g kroppsvikt till dräktiga honor vid embryonal 6,5 (E6.5) för att inducera Cre expression och DsRed märkning i en liten delmängd av celler.
- 48 timmar senare dissekera embryon, identifiera DsRed positiva embryon med hjälp av fluorescerande mikroskop, överföra dem till kulturen skålen och observerbarae encelliga divisioner under ex vivo imaging (se nedan).
2. Hel Mouse Embryo Culture
- Dissekera E8.5 embryon i förvärmda tvättmedium innehållande DMEM/F12 (01:01) kompletterat med 10% serum från nyfödd kalv och 1% penicillin / streptomycin (P / S) 9.
- Direkt efter dissekering, placera embryon på 37 ° C värme skede under fluorescerande mikroskop och identifiera som GFP och / eller DsRed positiv (se nedan).
- Överför upp till 2 embryon till en 500 l droppe förjämviktad odlingsmedium innehållande 50% Rat Serum från en Sprague-Dawley han-och 50% DMEM/F12 (01:01) utan fenolrött kompletterat med L-glutamin och 1% av 1 M HEPES i 0,85% NaCl och P / S-9.
- Applicera ett tunt lager (0,1 cm) i jämvikt lätt mineralolja på medellång att förhindra avdunstning och överföra kulturen skålen innehåller embryon till 37 ° C, 5% CO 2 inkubator.
Tre.Viral infektion
- För att etiketten flimmerhår i neuroepitelet, tillsätt 5-10 il Sstr3-GFP lentivirus, cirka 2 miljoner virioner, till en 500 pl jämvikt droppe odlingsmedium innehållande en E8.5 embryo.
- Efter 18 timmar av kultur, överföra infekterade embryo i flera droppar av tvätt medium för att tvätta bort viruset och förbereda neuralrörsdefekter skiva.
4. Neural Tube Slice Förberedelser för Live avbildning
- Dissekera neuralröret av E8.5 embryo i förvärmda tvättmedium med användning av en mikro-kniv storlek 0,025 mm, på en 1% agar belagda skålen.
- Placera den isolerade neuralröret ventrala sidan nedåt i en 150 l droppe ekvilibrerad odlingsmedium utan fenolrött på 35 mm poly-L-lysin belagda glaset nedre skålen.
- Sätt små mängder av en 1:1 blandning av 100% ren vaselin och smält stearin (ljus från IKEA) runt den monterade neuralrörsdefekter, och tryck försiktigt med en smal glasbit täckglas för attimmobilisera provet.
- Täck skålen med ett tunt skikt (~ 0,1 cm) av ekvilibrerad lätt mineralolja (figur 2).
Fem. Live Imaging och Time-lapse konfokalmikroskopi
- Placera skålen under Nikon A1R Laser Scanning Confocal inverterat mikroskop utrustat med en miljökammare som reglerar temperatur, inställt på 37 ° C och 5% CO2.
- Använd 60x oljeimmersionsobjektiv att spela in GFP märkt cilia och DsRed positiva celler, medan den 40x oljeimmersionsobjektiv användning för att övervaka OLIG2-GFP och DsRed positiva celler.
- Öppna NIS Elements att inrätta tidsgränser lapse avbildning. Varje 10 min förvärva z-stackar av upp till 25 pm med ett avstånd av 1,5 m (40x mål) och upp till 8 pm med ett avstånd av 0,4 m (60x objektiv). Använd 488 och 561 nm för exciteringsvåglängder och överförd kanal om det behövs. Hämta bilder på 512 x 512 storlek. Konfigurera flera användardefinierade regioner interest att utföra samtidigt inspelning.
Optimal exponering för laser makt och ljusstyrka justerades genom användning låg laser intensitet (upp till 11% för mCherry 561, upp till 4,5% EGFP 405/488), skanning hastighet 1, rad genomsnitt 2 och storlek pinnhål (61 im för DsRed, 28,1 um för OLIG2, 72 | im för SSTR3GFP, 61,3 pm för DsRed och SSTR3GFP, 58 pm för DsRed och OLIG2). Användningen av genetiskt kodade fluorescerande reportrar möjligt för oss att upptäcka ljusstyrka med låg laser effekt. - Analysera inspelade data med Imaris 3D rekonstruktion programvara.
6. Immunofluorescens
- Fix embryon eller isolerade neurala rör i 4% paraformaldehyd / 0,1 M fosfatbuffert på is (4 ° C) under 1 timme i en glasskål.
- Tvätta prover 2 tim i PBS på is (4 ° C) (ändring PBS några gånger) och sätta in 30% sukros / 0,1 M fosfatbuffert över natten eller tills embryon sjunka.
- Bädda in ULT frysa på torris och förvara i -80 ° C. Perform sektionering på kryostat (10 mm).
- Tvätta objektglasen under 10 minuter i tvättlösning innehållande 1% värmeinaktiverat fårserum och 0,1% Triton X-100 i PBS.
- Späd primära antikroppar i tvättlösning vid följande koncentrationer: Rat monoklonal anti-RFP (5F8,) 1:200, Kanin anti-Arl13b serum 1:1500 och mus monoklonala anti-Arl13b 01:05 (295B/54), kanin anti-OLIG2 1:300, mus monoklonala Pax6, Shh och Nkx2.2-all 1:10; och kanin polyklonala Ki67 1:500. Lägg ca 150 l per bild i platt fuktig kammare, täck med parafilm för att undvika uttorkning och lämna över natten vid 4 ° C.
- Tvätta objektglasen i tvättlösning tre gånger, 20 min varje gång vid rumstemperatur.
- Späd sekundära antikroppar Alexa Fluor 488, 568, 350 i tvättlösningar vid 1:200 koncentration. Använd Hoechst 1:3000 eller TO-PRO-3 1:500 för att färga kärnor. Tillsätt 150 | il per glas, lämna 1 h vid rumstemperatur i fuktig kammare i skydd mot ljus.
- Tvätta objektglasen i tvättlösning two gånger, 30 min varje gång vid rumstemperatur.
- Mount glider i 80% Förläng Guld anti-fade reagens och ståndpunkterna inom 24 timmar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här har vi utfört ex vivo levande avbildning av enstaka celldelningar inom E8.5 musen neuroepitelet. Att märka enskilda celler, inducerade vi Crerekombinas i en delmängd av celler som innehåller ett Cre reporter linje som uttryckte DsRed vid rekombination 5,6 (Figur 3A). Således, 48 timmar senare kunde vi konstatera enstaka celldelningar under ex vivo imaging (figur 4A-D). Samtidigt, övervakade vi när de märkta cellerna blev Shh-lyhörda genom att ta en Shh transkriptionell reporter modifierad BAC transgena OLIG2-eGFP linje (figur 3C-D; Figurer 4G-N) 1-3. Att observera cilia formation vi genererat Sstr3-GFP lentivirus att infektera embryon i kultur (Figur 3B, Figurer 4A-D) 4. Immunofluorescens utfördes för att bekräfta resultat in vivo (figur 4E-F).
Den tid-varve konfokala imaging observation av dsRedCre reporter embryon uttrycker OLIG2-eGFP eller infekterade med Sstr3-GFP lentivirus under in vitro-kultur är visade i figur 5 10. För att vara säker på att Sstr3-GFP uttryck vi använder för att visualisera cilier inte störde någon underliggande biologisk process, bekräftade vi vår levande bilddata med fasta vildtyp embryo sektioner. Eftersom vi hittade samma procentandel av asynkron i cilia bildning och Shh svar, betyder det att SSTR3-GFP viruset inte påverka dessa processer (Figur 5A).
Figur 1. Flödesschema av ex vivo levande avbildning förfarande med hjälp av musen neuroepithelium. Finalen musen kors och tamoxifen behandling skildras följt av hela musembryo odlingsmetod. Embryon som uttrycker fluorescerande taggade proteiner väljs och förberedda för levande avbildning. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Neuralrörsdefekter slice förberedelse för levande avbildning. A) E8.5 unturned embryo med första utseendemässigt av somit par. B) neuralrörsdefekter dissekerades i förvärmda mediet med hjälp av en mikro-kniv.) C neuralrörsdefekter skiva monteras ventrala sidan nedåt på poly-L-lysin belagda glaset nedre skålen. D) Liten mängd av en blandning tillverkad av vaselin och vax appliceras runt neuralröret och försiktigt täckt av en narrow glasbit täckglas. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Visualisera fluorescerande taggade proteiner i levande celler av neuralrörsdefekter med konfokalmikroskopi. A) DsRed etiketter enskilda celler. B) SSTR3-GFP lentivirus uttryckt i primär cilia som de bildar (gula pilar). CD) E8.5 embryo bär OLIG2-GFP visar GFP uttryck inom neuroepithelium. Bar är 30 ^ m (A, D), 15 | im (B) och 1,5 ^ m (C).
Figur 4. Övervakning cilia bildning och Shh signalering i celler som delar av utvecklingsländerna neuralrörsdefekter. AD) Single DsRed positiv cell genomgår division visar en cilium former i en dotter cell innan den andra cellen (C, vit pil). Filmen avbildades med en hastighet av en ram varje 10 min. Användning av antikroppar mot RFP i grönt (för DsRed härstamning tracing) och Arl13b i rött (för cilier) EF) immunofluorescens. Utvidgningen av inramade området (E), utan Hoechst (F). GN) Den DsRed positiv cell genomgår division (IM). Den OLIG2-GFP uttrycks i endast en dotter (J, N). Inspelningen avbildades med en hastighet av en ram var 10 min. Bar är 5 pm (AD), 50 pm (F), 25 pm (GN).
Figur 5. Räkning av DsRed positiv cell med flimmerhår och Shh utseende. A) Antal DsRed celler som genomgår division och flimmerhår lokalisering. Symbol * menar med levande avbildning flimmerhår formation var synkront. B) Antal DsRed och OLIG2-GFP-positiva celler som genomgår division och Shh signalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vårt ex vivo-system ger oss möjlighet att direkt observera enstaka celldelningar i utvecklingsländerna neuroepitelet i realtid. Som ett exempel har vi undersökt celldelningar i musen embryonala neuralrörsdefekter och övervakas antingen cilium formation eller Shh svar. Vi bekräftade vårt bildbehandling resultat (n = 24) var i överensstämmelse med resultaten från fasta sektioner (n = 178) som anger vår teknik ger fysiologiskt relevanta data.
Vår teknik bygger på Cre induktion att vara begränsad till en underuppsättning av celler så att dosen av tamoxifen måste vara exakta. Vi arbetade ut doseringen för märkning enskilda celler. Vi tror att det skulle vara lätt att märka små kloner av celler med en liten ökning av dosen baserat på den initiala analysen av CAGGcreER linjen, som visade en dosberoende respons till tamoxifen 6. Dessutom embryot odlingsbetingelser är kritiska, eftersom onormal utveckling sker om villkoren är avstängda.Vi bekräftade att utvecklingen gått normalt under de odlingsbetingelser som vi använt, som är kända för att arbeta för minst 36 tim 11.
De inducerbara Cre och Cre reporter linjer vi använder är allmänt tillgänglig så kan lätt erhållas göra denna teknik ganska anpassningsbar till forskare med en mängd olika frågor. Den verkliga kraften i vår teknik är att genetiskt märka enstaka celler, kan vår metod kan användas för att förhöra enda cell beteende i de många befintliga och framtida mutantmusen linjer. Detta kommer att vara avgörande för att förstå vad som verkligen går fel i många av dessa rader som direkt observation av celler inom däggdjursembryo under utveckling inte har utförligt undersökts. Vår incorporaton av genetiskt kodade fluorescerande reportrar att upptäcka ljusstyrka med låg laser makt ger en verklig fördel för en sådan observation. Det är lätt att föreställa sig fluorescerande taggade proteiner som markerar specifika cellulära organeller eller andra transcriptional reportrar att integreras i framtiden.
Vi var intresserade av den relativa tidpunkten för primär cilie bildning och Shh svar på dottern celler av en dela cell. Däremot uttryckte transgen linje som möjligt för oss att övervaka Shh respons OLIG2-eGFP hela cytoplasman, hindrar oss från att se markören på den primära cilie, Sstr3-GFP i samma cell. Därmed skulle vi ha stor nytta av antingen en nukleär begränsad OLIG2-EGFP eller en spektralt distinkt Sstr3 fluorescerande protein fusion.
Förutom att använda riktade och transgen linje, visade vi att vår teknik kan anpassas med hjälp av virala konstruktioner samt att infektera neuroepitelet i kulturen ger användbara uppgifter. Detta kommer att vara användbart för utredarna att ge en snabbare metod än generering av en genetiskt modifierad mus linje. Dessutom kan tillvägagångssätt validera genereringen av en sådan linje, ja, våra data argumenterar en trans-framkallande linje som uttrycker Sstr3-GFP kommer att vara till stor nytta för området.
Vår metod ger verktyg med vilka fält kan mer direkt övervaka cellens beteende. Kopplat till de rika resurser av mus mutanter räknar vi denna metod vara särskilt kraftfull i att undersöka en rad cellulära beteenden i situ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta forskningsprojekt stöddes av en Arra Supplement, 5 R01 NS056380. Ytterligare stöd gavs genom viral vektor Kärna och Mikroskopi Kärna av Emory Neuroscience NINDS Core Facilities bidrag, P30NS055077. Vi tackar Emory transgen mus och genmålinriktning Kärna för härledning musen linje från GENSAT, Greg Pazour för stabila SSTR3-GFP IMCD3 cellinje, och Bradley Yoder för Sstr3-GFP lentiviral konstruera. Monoklonala antikroppar erhölls från utvecklingsstudier Hybridoma Bank, utvecklades under ledning av NICHDEN och underhålls av University of Iowa, Institutionen för Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. Alla animaliska förfaranden godkändes av IACUC och Biosäkerhetskommittén vid Emory University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
| Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
| CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
| Newborn calf serum | Lonza | 14-416F | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Rat Serum SD male | Harlan Bioproducts | 4520 | |
| 1M Hepes | BioWhittaker | 17-737E | |
| L-Glutamine | GIBCO | 21041-025 | |
| Light mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Sstr3-GFP lentivirus | Emory Viral Core | ||
| Micro-knife, size 0.025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
| 35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish | MatTek | P35GC-0-10-C | |
| 100% Petroleum Jelly | Kroger | FL9958c | |
| A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope | Nikon | ||
| NIS Elements software | Nikon | ||
| Imaris 3D software | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Parafolmaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffer | Lab made | ||
| Rat monoclonal anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
| Rabbit anti-Arl13b serum | NeuroMab | ||
| mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
| Rabbit anti-Olig2 | Chemicon | AB9610 | |
| Mouse monoclonals Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
| Mouse monoclonalsShh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
| Mouse monoclonals Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
| Rabbit polyclonal Ki67 | Abcam | AB15580 | |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
| Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| H–chst | Fisher | AC22989 | |
| TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36934 |
References
- Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate. Cell. 73, 673-686 (1993).
- Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube. Cell. 81, 747-756 (1995).
- Briscoe, J. A. Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube. Cell. 101, 435-445 (2000).
- Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).
- Vintersten, K. Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals. Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).
- Hayashi, S., McMahon, A. P. Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse. Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).
- Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
- Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).
- Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture. Genesis. 34, 228-235 (2002).
- Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response. Cilia. 1 (6), In Press (2012).
- Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).
