Summary
Fremgangsmåde til intranasal administration af lægemidler til vågne mus med henblik på målretning hjernen er beskrevet. Denne metode giver mulighed for gentagne doser over lange perioder med intranasal administration af lægemiddel uden bedøvelse, og næse-til-hjerne levering med minimal systemisk eksponering.
Abstract
Intranasal indgivelse er en metode til afgivelse af terapeutika til det centrale nervesystem (CNS). Den er ikke-invasiv og tillader store molekyler, der ikke krydser blod-hjerne-barrieren adgang til CNS. Narkotika er direkte målrettet til CNS med intranasal levering, reduktion af systemisk eksponering og dermed uønskede systemiske bivirkninger 1. Levering fra næsen på centralnervesystemet finder sted inden for minutter langs både de olfaktoriske og trigeminal neurale veje via et ekstracellulært rute og kræver ikke lægemidlet til at binde til en receptor eller axonal transport 2. Intranasal levering er en meget opreklameret metode og er i øjeblikket anvendes i humane kliniske undersøgelser 3.
Intranasal levering af lægemidler i dyremodeller giver mulighed for initial vurdering af farmakokinetiske fordeling og effekt. Med mus, er det muligt at administrere lægemidler til vågen (ikke-bedøvet) dyr med regelmæssige mellemrum under anvendelse af en specialiseretEgenproduktionen intranasal greb. Awake levering er gavnligt, fordi det giver mulighed for langsigtet kronisk dosering uden bedøvelse, det tager kortere tid end med anæstesi, og kan læres og udføres af mange mennesker, så hold af teknikere kan dosere et stort antal mus i korte perioder. Effektiviteten af terapeutiske midler indgivet intranasalt på denne måde til mus er blevet påvist i en række undersøgelser, herunder insulin i diabetiske musemodeller 4-6 og deferoxamin i Alzheimers musemodeller. 7,8
Den intranasale greb for mus kan læres, men er ikke let og kræver øvelse, dygtighed, og en præcis greb til effektivt at afgive lægemiddel til hjernen og undgå afløb til lunge og mave. Mus fastholdes i hånden under anvendelse af en modificeret Scruff i de ikke-dominerende hånd med halsen holdes parallelt med gulvet, medens lægemiddel afgives med en pipette med den dominerende hånd. Det tager normalt 3-4 uger akklimering til håndtering før muskan holdes med dette greb uden stress respons. Vi har udarbejdet denne Jové video at gøre denne intranasal levering teknik mere tilgængelige.
Protocol
1. Akklimatisering til Håndtering til intranasal administration til Awake mus
Indledning
Mus skal akklimatiseres til håndtering i en periode af to-fire uger før starten af intranasal administration. Akklimatisering til håndtering er vigtigt, da det hjælper med at sikre en korrekt kropsstilling for maksimal effektivitet i vågen intranasal drug delivery. Desuden kan mus, som ikke er blevet ordentligt vant til denne proces har en alvorlig angst reaktion efter dosering. Mus skal bruge omkring 2-3 dage på hver af ni trin før den udvikler sig til det næste trin, afhængigt af dyrets komfort til håndtering. Musens stressniveau bør anvendes som et mål for fremskridt. Det betyder, at overvågning af musens bevægelser, mængden / hyppig vandladning, afføring, rysten, og bider. Hvis en mus har en høj stress reaktion, ophold på trinnet før den udvikler sig til den næste indtil responsen er reduceret. En prøve akklimatisering schedule kan ses i tabel 1. Akklimatisering af musene bør udvikles gennem følgende gang om dagen trin. Udførelse af disse trin mere end én gang dagligt, i et forsøg på at fremskynde akklimatisering, kan ikke anbefales.
- Placer musen i håndfladen for en periode på to til tre minutter, ikke mere end den ene fod over buret top, da dyrene ofte springe i løbet af denne indledende trin. Hvis musen forsøger at kravle ud af hånden og op ens arm, løfter simpelthen musen ved haleroden og læg den tilbage i den ene hånd.
- Placer musen i håndfladen i tre minutter og kæle med dyret forsigtigt. Pet musen retningsbestemt fra hoved til hale, samtidig med at dyret at bevæge sig frit.
- Placer musen i håndfladen i tre minutter, mens masserer bag ørerne (let knibe sammen huden på nakken ved hjælp af tommel-og pegefinger).
- Hold / lift musen ved kraven af sin hals i 30 sekunder, lade muse hvile på buret toppen i 30 sekunder før gentagelse af lastrummet igen.
- Hold musen med det intranasal greb, som er beskrevet i afsnit 2, men ikke invertere dyr (komplet op til trin 2,4). Holde dyret på denne måde i et tidsrum på 30 sekunder og frigiver tilbage til buret toppen. Gentag en anden gang efter et minuts pause.
- Hold musen med intranasal greb som beskrevet i afsnit 2, herunder invertere dyret, så dens ventrale side vender op mod loftet. Sørge for, at dyrets hals er parallelt med gulvet. Hold denne stilling i 30 sek. Gentag dette en anden gang efter et minuts pause. Nogle mus vil modstå intranasal greb mere end andre, især når de anvendes for første gang med inversion ved dette trin i akklimatisering. Hvis musen frigør sig fra grebet, sætte musen tilbage på buret top og re-greb. Gentag re-grip hvis det er nødvendigt, Men overvåge stressniveau af muse og returnere den til buret om nødvendigt. En anden faktor, der kan spille en rolle i at miste grebet på dette tidspunkt i akklimatisering processen er uerfaren de animalske handlere med intranasal levering teknik.
- Hold musen med intranasal greb, vendes, kortvarigt placere en pipette med en tom spids over hver næsebor, og hold dyr position i 30 sek. Gentag dette efter et minuts pause.
- Hold musen med intranasal greb, vend det, og intranasalt administrere 6 gl saltvand i venstre og højre nare som beskrevet i afsnit 3 (gennem trin 3,7).
- Holde musen med den intranasale greb, vendes den, og intranasalt administrere 6 pi saltvand i venstre og højre nare to gange anbringe dyret tilbage på buret top i mellem, som beskrevet i afsnit 3.
2. Den Intranasal Grip at immobilisere Awake mus
- Placer musen on buret toppen.
- Med tommel-og pegefingeren på din dominerende hånd, holde musen i halen. Ved hjælp af den midterste, ring, og lillefingeren, let pin den nedre del af legemet til buret top (figur 1A). Lad musen fat på stængerne, som du let strække musen ud og bedre fat i kraven.
- Brug tommel-og langfinger på din ikke-dominerende hånd klemmes musen fast på kraven (overskydende hud) bag nakke og skuldre. Trække op i den løse hud for at gøre et telt af huden over skulderbladene (figur 1B). Tag så meget af huden som muligt, men pas på ikke at trække op muskel, da dette vil medføre ubehag til musen. Udvise forsigtighed for ikke at anvende for meget tryk til dyrets brystkasse eller rygsøjlen. Højt tryk eller træk på huden kan føre til inhibering af respiration i nogle tilfælde.
- Hurtigt placere pegefingeren på din ikke-dominerende hånd på musen hoved somtæt på næsen som muligt og trække sig tilbage på huden (figur 1C, 1D). Samtidig at skubbe tommelfinger og langfinger mod hovedet for optimal position. Ideelt set bør mus ikke kunne bevæge sit hoved lodret eller vandret.
- Under opretholdelse af greb om kraven, vend herefter musen på ryggen. Musens ryg bør være i din hule hånd. Hold fast i musens hale (nær basen) mod din håndflade med dine sidste to fingre (ring og pinky) for at stabilisere musen, eller du kan indpakke dine fingre hen over nederste del af kroppen (Figur 1E, 1F).
- På dette tidspunkt sikre, at musens hals og hage er flade og parallelle med gulvet. Hagen bør være tæt på en 180 graders vinkel med halsen så meget som muligt for at hjælpe med intranasal indgivelse. Små ændringer i vinklen kan bevirker, at lægemidlet ende i den forkerte side. Sørg for, at musen er i stand til at trække vejret ved at se maven. Musen should ikke kunne bevæge sig, men skal være bekvemt og ikke på nogen smerte. Hvis du ser musens hals og hage lave en "V", så er du nødt til at re-greb.
3. Intranasal afgivelse af lægemiddel til Awake mus
Indledning
Ved hjælp af intranasale greb, er hver mus tilbageholdt to gange og opbevares med deres hals parallelt med gulvet, mens et volumen på 20-30 ul af væske administreres. Denne mængde er sikkert og effektivt for små store mus, vi bruger typisk 24 pi, og der er beskrevet i denne protokol. Den vågen intranasale fremgangsmåde kan anvendes i mus i alle aldre, fx i nyfødte mus til udviklingsmæssig neurovidenskabelig forskning. I nyfødte mus, bør en mindre samlet volumen (8 ul) og dråbestørrelse (1 pi) anvendes til at rumme den mindre volumen af næsehulen. Drug typisk leveres til to mus ad gangen, skiftevis hvileperioder for at gøre den mest effektive udnyttelse af tid og holde on tidsplan. Set-up vil være lidt anderledes, afhængigt af om du dosering opstaldet i grupper mus eller individuelt opstaldede mus. Med de individuelt opstaldede mus, er det nyttigt at placere alle dine materialer i mellem burene for at forhindre mus i at krydse over til den anden bur top. Med anbringes i grupper mus, dosis fra det bur alene. Det er vigtigt, at hver mus i en gruppe-opstaldet bur modtager det samme intranasal behandling, som potentialet for krydskontaminering af to forskellige behandlinger eksisterer på grund af medikament udvise i luften eller med hudkontakt. Det anbefales stærkt, at en dosering ark udskrives på forhånd, for at minde teknikere behandling opgaver, at registrere eventuelle noter af ubesvarede dråber, at notere generelle sundhed af hvert dyr, etc.
Steps
- Opsæt bure, hvor de burde være til dosering, og oprette en dosering station (Figur 2).
- Fjern musen fra bur og holde på bur top under dosering.
- Saml musen ved hjælp af intranasal greb beskrevet i afsnit 2.
- Brug din dominerende hånd, pipetteaggregatet belastning med 6 pi lægemiddel eller køretøj. Anbring spidsen af den fyldte pipetteaggregatet nær musens venstre næsebor, sædvanligvis ved en 45 graders vinkel (figur 1G, 1H). Hvis du har en viskos opløsning kan det være nødvendigt at øge din vinkel til 90 grader, fordi stoffet kan løbe op på siden af pipettespidsen stedet for at lave en dråbe. Hvis meget viskøs, kan tørre pipettespidsen med en serviet, før udvisning væske hjælpe. Langsomt skubbe lægemidlet til dannelse af en lille dråbe med omkring halvdelen af volumenet (3 pi).
- Dråben skal placeres tæt nok på musens næsebor, således at mus kan inhalere dråben. Umiddelbart efter musen inhalerer denne lille dråbe, skubbe resten af medikamentet i pipettespidsen til dannelse af en anden lille dråbe for musen til at inhalere gennem samme næsebor omkring 2-3 sekunder senere. Vær sikker på at se munden. Hvis der is væske i munden, har faldet ikke gøre det helt ind i næsen, og det bør bemærkes.
- Holde musen i denne stilling i 15 sek. Det anbefales stærkt, at en timer skal bruges til at standardisere denne 15 sek hold.
- Gentag trin fra 3,3 til 3,6 for højre næsebor. Hvis nogen dråber prustede ud, bør denne drop udskiftes og noteret.
- Placer musen tilbage på toppen af sit bur i 2 min. Gentages hele processen starter 2 min. efter levering af den første dråbe. Dette giver musen fire dråber 6 pi hver på i alt 24 ml af opløsningen. En prøve tidsplan for dosering en eller to mus på én gang kan ses i tabel 2.
- Når musen har modtaget alle dråber, returnere musen til sit bur.
4. Generelle håndtering af dyr Teknikker til Akklimatisering og Intranasal afgivelse af lægemiddel til Awake Mus
Efter hver akklimatisering eller intranasal administration session, bør mus være giverna behandle, såsom en Cheerio eller skrællet solsikkefrø som positiv forstærkning. Treats er givet som en belønning, og at distrahere dem fra at skrabe deres næser, hvilket kan forårsage skade på sig selv. Når man arbejder med opstaldet i grupper mus, bør nok godbidder være faldet for hver mus. Før vi vender tilbage dyrene til deres bure være sikker på at genoprette reder til deres oprindelige stater for at reducere stress. Ved dosering opstaldet i grupper dyr, skal handsker ændres mellem dosering af bure for ikke at overføre duft fra bur koloni til bur koloni, da de vil blive aggressive over for hinanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Der er flere måder at bestemme effektiviteten af medicinafgivelse. Den første er at intranasalt administrere et farvestof, såsom tusch eller methylenblåt for at visualisere farvestof efter aflivning af dyret i den olfaktoriske epitel og efter at hjernen er fjernet, ind i CNS gennem cribriform plade. Den anden er at måle medikament leveret enten ved anvendelse af en radio-mærket tag eller ved anvendelse af ELISA-detektion af umærket molekyle. Et godt eksempel på lægemiddelfordeling i CNS efter administration til vågne mus kan findes i Hanson et al. 2012 7. Vi forventer lugtekolben og trigeminusnerven at indeholde en høj koncentration af det leverede medikament. Ved 30 min efter intranasal indgivelse af 3,65 umol deferoxamin var koncentrationerne i trigeminusnerven og lugtenerven 29 uM og 13 uM hhv. Lægemiddelkoncentrationer vil være indlysende i alle regioner af hjernen (i dette eksempel en ringedee på 0,6 uM til 4,1 uM blev målt) med højere koncentrationer i områder, der modtager input fra olfaktoriske og trigeminal nerver. For eksempel vil rostralt områder af cortex indeholder højere koncentrationer end caudale cortex og pons vil indeholde højere koncentrationer end midterhjernen eller medulla. I rygmarven en faldende koncentration gradient fra cervical til lumbal er normalt observeret (i dette eksempel en gradient på 1,5 uM til 2,0 uM). Intranasal indgivelse resulterer også i høje koncentrationer af lægemidlet når frem meninges og cervikale lymfeknuder. Den tredje måde at påvise effekt af levering er at måle en adfærdsmæssig eller biokemisk reaktion på det indgivne lægemiddel. For eksempel resulterede intranasal deferoxamin behandling af transgene Alzheimers mus i forbedret ydeevne i en rumlig hukommelse opgave 7 og phosphorylering af glycogensynthasekinase 3 beta 9.
| Dag | Aktion | |
| 1 | M | Hold for ~ 2-3 min |
| 2 | Tu | Hold for ~ 2-3 min |
| 3 | W | Hold og kæledyr ~ 2-3 min |
| 4 | Th | Hold og kæledyr ~ 2-3 min |
| 5 | F | Let knivspids eller Scruff |
| 6 | M | Let knivspids eller Scruff |
| 7 | Tu | Scruff og lift |
| 8 | W | Scruff og lift |
| 9 | Th | Intranasal Grip |
| 10 | F | Intranasal Grip |
| 11 | M </ Td> | Intranasal (IN) Greb og Invert |
| 12 | Tu | Intranasal (IN) Greb og Invert |
| 13 | W | I Grip, Inverter, placere pipettespids nær næse |
| 14 | Th | I Grip, Inverter, placere pipettespids nær næse |
| 15 | F | I Grip, Inverter, levere 1 omg saltvand til hver nare |
| 16 | M | I Grip, Inverter, levere 1 omg saltvand til hver nare |
| 17 | Tu | I Grip, Inverter, levere 2 omg saltvand til hver nare |
| 18 | W | I Grip, Inverter, levere 2 omg saltvand til hver nare |
Tabel 1. Prøve Tidsplan for Akklimatisering til Håndtering til intranasal administration til Awake mus.
* Den pipette belastes en gang med 6 pi, men administreret til mus som 2 x 3 ul dråber.
Tabel 2. Prøve Tidslinje for Dosering En eller to mus.
Figur 1. Billeder af forskellige stadier og vinkler af at holde en mus til vågen intranasal afgivelse af medicin. 1A) Hold musen ned på buret top med den dominerende hånd forlader skuldrene udsat at gribe huden. 1B) Brug tommel-og langfingeraf den ikke-dominerende hånd til at gribe og trække op hud lige bag skulderbladene. 1C) Brug pegefingeren til at trække huden tilbage fra mellem øjnene mod tommelfingeren og langfingeren (set forfra). 1D) Samme som 1C (side visning). 1E) Hold musen på hovedet ved hjælp af ringfingeren og / eller pinky at sikre haleroden til håndfladen. Halsen på mus skal være vandret. 1F) Samme som E, fra den anden side. 1G) Indgiv stof med en 20 pi pipette og gel loading pipettespids. 1H) Samme som 1G, nærbillede.
Figur 2. Et billede af en komplet dosering station for 2 individuelt opstaldede mus. Inkluderet er de to mus bure med tilstrækkelig afstand mellem for at holde musene adskilt, en pipettetor med tips, en beholder til brugte tips, en timer, dosering ark, en post-dosering treat (som solsikkefrø eller Cheerios), sanitære servietter, en P20 (eller P10) pipetter, og det lægemiddel, der skal leveres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne fremgangsmåde viser, hvordan mus kan gives regelmæssige doser af intranasal medikament til at målrette hjernen uden brug af anæstesi. Intranasal lægemiddel kan leveres til store grupper af mus i længere tidsrum med minimal anstrengelse. En enkelt gruppe på op til 20 mus kan intranasalt behandles af en enkelt person på mindre end en time. En bred vifte af molekyler, lige fra små jernkelatorerer på vækstfaktorer til mesenkymale stamceller, har vist sig hurtigt at målrette CNS og har udvist virkningsfuldhed i gnavere modeller. Foreslåede mekanismer for direkte leverance fra næsen til hjernen omfatter ekstracellulære transport langs de olfaktoriske og trigeminal nerver og bulk flow inden for de perivaskulære rum 1,10. Intranasal indgivelse til CNS er en særdeles nyttig teknik, fordi det ikke kun er hurtig, men det er rettet mod CNS reducere systemiske eksponering. For eksempel resulterede intranasal indgivelse af deferoxamin til rotter i 3-19 gange højere koncentrations i hjerneregioner med 28 gange lavere koncentrationer i blodet 11. I et andet eksempel forbedrer intranasalt administreret insulin hukommelse i Alzheimers patienter inden for 15 minutter uden at ændre plasmaniveauerne af insulin eller glucose 12. En yderligere fordel er den ikke-invasiv, for intranasal indgivelse teknikken.
Der er flere begrænsninger forbundet med denne fremgangsmåde. For det første er lægemiddelafgivelse begrænset til omkring 20-30 gl i en enkelt administration, så opløseligheden af det terapeutiske vil spille en rolle ved bestemmelse dosisgrænserne. Også lægemiddelformuleringen er vigtig, da faktorer som pH og saltindhold kan påvirke leveringen. Store afvigelser fra naturlige forhold, såsom ekstrem pH-værdi og saltindhold, kan beskadige luftvejene og olfaktoriske epitel hos mus. 13,14 Endvidere kan intranasal administration af ikke-bedøvede mus være svært at mestre, og kan tage flere ugers træning til intranasal "dosers "at kunne minimize "head-vrikke værelse" og opnå optimal intranasal administration af lægemiddel. Med forkert dosering teknik, kan lægemidlet løbe ind i lungen eller maven, hvilket kan introducere variabilitet i lægemiddel til hjernen. Tegn på, at dette har fundet sted, åndedrætsbesvær eller visualisering af væske i munden efter administration. Hvis det er muligt, er det tilrådeligt at begrænse nye intranasale "dosers" til at levere saltvand / køretøj til at styre grupper i flere uger eller måneder, før de er godkendt til dosis narkotika af ekspert undervisere. Endelig er dette vågen intranasal metode begrænset til mus, som vågne rotter og større dyr ikke er så let at gribes, og kan alt understreges, når den holdes nedad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke HealthPartners Institutionel Animal Care og brug Udvalg på Regionsudvalgets Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P20 pipettor set at 6 μl | |||
| Gel loading pipette tips | |||
| Timer | |||
| Waste receptacle for tips | |||
| Dosing sheet for notes | |||
| Pen | |||
| Drug and vehicle | |||
| Container to hold drug vials | |||
| Animals to be dosed | |||
| Spare gloves | |||
| Paper towels to wipe urine | |||
| Table 3. Materials Needed | |||
References
- Dhuria, S. V., Hanson, L. R., Frey, W. H. 2nd Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations. J. Pharm Sci. 99, 1654-1673 (2010).
- Thorne, R. G., Pronk, G. J., Padmanabhan, V., Frey, W. H. 2nd Delivery of insulin-like growth factor-I to the rat brain and spinal cord along olfactory and trigeminal pathways following intranasal administration. Neuroscience. , 127-481 (2004).
- Benedict, C., et al. Intranasal insulin as a therapeutic option in the treatment of cognitive impairments. Exp. Gerontol. 46, 112-115 (2011).
- Francis, G. J., et al. Intranasal insulin prevents cognitive decline, cerebral atrophy and white matter changes in murine type I diabetic encephalopathy. Brain. 131, 3311-3334 (2008).
- Francis, G., et al. Intranasal insulin ameliorates experimental diabetic neuropathy. Diabetes. 58, 934-945 (2009).
- Marks, D. R., Tucker, K., Cavallin, M. A., Mast, T. G., Fadool, D. A. Awake intranasal insulin delivery modifies protein complexes and alters memory, anxiety, and olfactory behaviors. J. Neurosci. 29, 6734-6751 (2009).
- Hanson, L., et al. Intranasal delivery of deferoxamine reduces spatial memory loss in APP/PS1 mice. Drug Delivery and Translational Research. 2, 160-168 (2012).
- Danielyan, L., et al. Protective effects of intranasal losartan in the APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer disease. Rejuvenation Research. 13, 195-201 (2010).
- Fine, J. M., et al. Intranasal deferoxamine improves performance in radial arm water maze, stabilizes HIF-1alpha, and phosphorylates GSK3beta in P301L tau transgenic mice. Exp. Brain Res. 219, 381-390 (2012).
- Lochhead, J. J., Thorne, R. G. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system. Adv. Drug Deliv. Rev. 64 (11), 614-628 (2012).
- Hanson, L. R., et al. Intranasal deferoxamine provides increased brain exposure and significant protection in rat ischemic stroke. J. Pharmacol. Exp Ther. 330, 679-686 (2009).
- Reger, M. A., et al. Effects of intranasal insulin on cognition in memory-impaired older adults: modulation by APOE genotype. Neurobiol. Aging. 27, 451-458 (2006).
- Kim, C. H., Song, H. yun, M, E. unA. hn, Lee, Y., G, J., Yoon, J. H. Effect of hypo-, iso- and hypertonic saline irrigation on secretory mucins and morphology of cultured human nasal epithelial cells. Acta Otolaryngol. 125, 1296-1300 (2005).
- Greiff, L., Andersson, M., Wollmer, P., Persson, C. G. Hypertonic saline increases secretory and exudative responsiveness of human nasal airway in vivo. Eur. Respir. J. 21, 308-312 (2003).
