Summary
En metod att intranasalt administrera läkemedel till vakna möss i syfte att rikta hjärnan beskrivs. Denna metod möjliggör upprepad dosering under långa perioder med intranasal administrering av läkemedel utan bedövning, och nos-mot-hjärna leverans med minimal systemisk exponering.
Abstract
Intranasal administrering är en metod för att leverera terapeutiska medel till det centrala nervsystemet (CNS). Det är icke-invasiv och tillåter stora molekyler som inte korsar blod-hjärnbarriären tillgång till CNS. Läkemedel direkt riktade till CNS med intranasalt leverans, minska systemisk exponering och därmed oönskade systemiska biverkningar 1. Leverans från näsan till CNS inträffar inom några minuter längs både lukt-och trigeminus nervbanor via en extracellulär rutt och kräver inte läkemedel att binda till någon receptor eller axonal transport 2. Intranasal leverans är ett uppmärksammat metod och används för närvarande i kliniska prövningar 3.
Intranasal tillförsel av läkemedel i djurmodeller medger första utvärdering av farmakokinetiska fördelning och effektivitet. Med möss, är det möjligt att administrera läkemedel att vakna (icke-bedövade) djur regelbundet med hjälp av en specialiststabiliserats intranasalt grepp. Awake leverans är bra därför att det möjliggör en långsiktig kronisk dosering utan bedövning, det tar mindre tid än med anestesi och kan läras och utföras av många människor så att team av tekniker kan dosen stort antal möss i korta perioder. Effekten av terapeutika administreras intranasalt på detta sätt till möss har visats i ett antal studier inklusive insulin i diabetiska musmodeller 4-6 och deferoxamin i Alzheimers musmodeller. 7,8
Den intranasala grepp för möss kan läras, men är inte lätt och kräver övning, skicklighet, och en exakt grepp för att effektivt leverera läkemedel till hjärnan och undvika dränering till lungan och magen. Möss är fastspända för hand med en modifierad nackskinnet i den icke-dominanta handen med halsen hålls parallellt med golvet, medan läkemedlet avges med en pipett med den dominanta handen. Det tar vanligtvis 3-4 veckor acclimating hantering före mösskan hållas med detta grepp utan stress. Vi har förberett den här JUPITER videon att göra detta intranasal leverans teknik mer tillgänglig.
Protocol
1. Acklimatisering till Hantering intranasal dosering att vakna möss
Inledning
Möss måste acklimatiserad att hantera under en period av 2-4 veckor före uppkomsten av intranasalt dosering. Acklimatisering till hantering är viktig, eftersom det bidrar till en korrekt kroppsställning för maximal effektivitet vaken intranasal läkemedel. Dessutom, kan möss som inte har blivit riktigt vana vid detta förfarande har en allvarlig ångest reaktion efter dosering. Möss ska tillbringa ca 2-3 dagar på varje nio steg innan du fortsätter till nästa steg, beroende på djurets komfort hantering. Musens stressnivån bör användas som ett mått på framsteg. Detta innebär att övervaka musens rörelser, mängden / miktionsfrekvens, defekation, skakningar och bitande. Om en mus har en hög stress, stanna på det steget innan du fortsätter med nästa tills svaret reduceras. Ett prov acclimation schedule kan ses i tabell 1. Acklimatisering av mössen skulle gå igenom följande en gång per dag steg. Utför dessa steg mer än en gång per dag, i ett försök att påskynda acklimatisering, rekommenderas inte.
- Placera musen i handflatan under en period av 2-3 minuter, inte mer än en fot ovanför buren toppen som djur ofta hoppa under detta inledande steg. Om musen försöker krypa ur handen och upp en arm, att lyfta musen genom svansroten och sätt tillbaka den i en hand.
- Placera musen i handflatan under tre minuter och klappa djuren försiktigt. Pet musen riktat från huvudet till svansen, samtidigt som djuret att röra sig fritt.
- Placera musen i handflatan under tre minuter medan massera bakom öronen (lätt nyper ihop huden på baksidan av halsen med tummen och pekfinger).
- Parkera / lift musen i nackskinnet av halsen under 30 sekunder, låter musen vila på buren toppen för 30 sekunder innan upprepa lastrummet igen.
- Håll musen med hjälp av intranasal grepp, som beskrivs i avsnitt 2, men inte vända djuret (komplett upp till steg 2,4). Håll djuret som denna under en period av 30 sekunder och släpp tillbaka till buren toppen. Upprepa en andra gång efter en minuts viloperiod.
- Håll musen med intranasala grepp som beskrivs i avsnitt 2, inklusive vända djuret så att dess ventrala sidan är vänd uppåt mot taket. Kontrollera att djurets hals är parallell med golvet. Håll denna position i 30 sekunder. Upprepa detta en andra gång efter en minuts viloperiod. Vissa möss kommer att motstå den intranasala grepp mer än andra, speciellt när den används för första gången med inversion vid detta steg i acklimatisering. Om musen befriar sig från greppet, placera musen tillbaka på buren topp och re-grepp. Upprepa nytt grepp om det behövs, Men övervaka spänningsnivån hos musen och returnera den till buren vid behov. En annan faktor som kan spela en roll i att förlora greppet vid denna punkt i acklimatisering processen är oerfarenhet av djurskötare med intranasalt leverans tekniken.
- Håll musen med intranasala grepp, invertera, kort placera en pipett med en tom spets över varje näsborre, och håll djuren positionen i 30 sekunder. Upprepa detta efter en minuts viloperiod.
- Håll musen med intranasala grepp, vänd den och intranasalt administrera 6 pl saltlösning i den vänstra och högra Nare som beskrivs i avsnitt 3 (genom steg 3,7).
- Håll musen med intranasala grepp, invertera den och intranasalt administrera 6 pl saltlösning i den vänstra och högra Nare två gånger placera djuret tillbaka på buren toppen i mellan, som beskrivs i avsnitt 3.
2. Den Intranasal Grip att immobilisera Awake möss
- Placera musen on buren toppen.
- Med tummen och pekfingret på din dominanta hand, håll musen i svansen. Använda mitt, ring och pinky fingrar, lätt stift den nedre delen av kroppen till buren toppen (Figur 1A). Låt musen ta tag staplarna som du lätt sträcka musen ut och bättre tag i nackskinnet.
- Använda tummen och långfingret på din icke-dominanta handen, klämma musen ordentligt på nackskinnet (överflödig hud) bakom nacke och axlar. Dra upp den lösa huden att ett tält av hud över skulderbladen (Figur 1B). Ta så mycket hud som möjligt, men var noga med att inte dra upp muskler som detta kommer att orsaka obehag för musen. Iakttag försiktighet så att inte för mycket tryck till djurets bröstkorg eller ryggrad. Högt tryck eller dragning av huden kan leda till inhibering av andning i vissa fall.
- Snabbt placera pekfingret på din icke-dominanta handen på musen huvud somnära näsan som möjligt och dra tillbaka på huden (figur 1C, 1D). Samtidigt, dra tummen och långfingret mot huvudet för optimal placering. Helst ska musen inte kunna röra huvudet vertikalt eller horisontellt.
- Under upprätthållande av greppet på nackskinnet, vrid musen på rygg. Musens rygg ska vara i handflatan. Stadigt hålla musens svans (nära basen) mot handflatan med din senaste två fingrar (ring och Pinky) för att stabilisera musen, eller så kan Tummar över underkroppen (Figur 1E, 1F).
- Vid denna punkt vara säker på att musens hals och haka är plana och parallella med golvet. Hakan ska vara nära en 180 graders vinkel med halsen så mycket som möjligt för att hjälpa till med intranasal leverans. Små förändringar i vinkel kan orsaka läkemedlet att hamna i fel plats. Kontrollera att musen kan andas genom att titta på buken. Musen should inte kunna röra, men bör vara bekväma och inte i någon smärta. Om du ser musens hals och haka gör ett "V", så måste du åter grepp.
3. Intranasal tillförsel av läkemedel att vakna möss
Inledning
Använda den intranasala grepp är varje mus hindras två gånger och hålls med sin hals parallellt med golvet medan en volym av 20-30 pl vätska administreras. Denna volym är säker och effektiv för små stora möss, vi brukar använda 24 pl, och som beskrivs i detta protokoll. Den vaken intranasala metoden kan användas i möss i alla åldrar, till exempel i nyfödda möss för utvecklande neurovetenskaplig forskning. I nyfödda möss, bör en mindre total volym (8 pl) och droppstorlek (1 pl) kan användas för att inrymma den mindre volym av näshålan. Läkemedel är normalt levereras till två möss åt gången, omväxlande viloperioder för att göra den mest effektiva användningen av tid och hålla oN schema. Set-up kommer att vara lite olika beroende på om du dosering grupp hålls möss eller individuellt hållna möss. Med individuellt hållna mössen, är det bra att placera alla dina material i mellan burarna för att förhindra möss från att korsa över till andra buren upp. Med hålls i grupp möss, dos från buren bara. Det är viktigt att varje mus i en grupp som hålls bur får samma intranasala behandlingen som en potential för korskontaminering av två olika behandlingar finns på grund av narkotika utdrivande i luften eller med hudkontakt. Det rekommenderas starkt att en dos ark tryckas i förväg, för att påminna tekniker för behandling uppdrag att registrera alla anteckningar missade droppar, att notera allmänna hälsan hos varje djur etc.
Steg
- Ställ in burar där de borde vara för dosering, och inrätta en dosering station (Figur 2).
- Ta mus från bur och hålla på bur topp under dosering.
- Plocka upp musen med den intranasala grepp som beskrivs i avsnitt 2.
- Använda din dominanta hand, ladda pipetten med 6 pl läkemedel eller fordon. Placera spetsen av den fyllda pipetten nära musens vänstra näsborre, vanligtvis vid en 45 graders vinkel (figur 1G, 1H). Om du har en viskös lösning du kan behöva öka din vinkel till 90 grader, eftersom läkemedlet kan köra upp på sidan av pipettspetsen istället för att göra en droppe. Om mycket viskös kan torka pipettspetsen med en vävnad innan utvisa vätska hjälp. Långsamt mata ut läkemedlet för att bilda en liten droppe med ungefär hälften av volymen (3 pl).
- Droppen bör placeras tillräckligt nära musens näsborre så att musen kan inhalera droppen. Omedelbart efter musen andas denna lilla droppe, mata resten av läkemedlet i pipettspetsen att bilda en annan liten droppe för musen att andas genom samma näsborre om 2-3 sek senare. Var noga med att titta på munnen. Om det jags vätska i munnen, gjorde släpp inte göra det helt i näsan och det bör noteras.
- Håll musen i detta läge 15 sekunder. Det rekommenderas starkt att en timer kan användas för att standardisera detta 15 sek håll.
- Upprepa steg från 3,3 till 3,6 för höger näsborre. Om några droppar fnös ut bör detta droppe bytas ut och noteras.
- Placera musen tillbaka på toppen av sin bur i 2 min. Upprepa hela processen börjar 2 minuter. efter leverans av den första droppen. Detta ger mus fyra droppar 6 il vardera totalt 24 pl lösning. Ett prov schema för dosering en eller två möss samtidigt kan ses i tabell 2.
- Efter att musen har mottagit alla droppar, tillbaka musen till sin bur.
4. Allmänna djurhantering Tekniker för Acklimatisering och Intranasal tillförsel av läkemedel att vakna möss
Efter varje acklimatisering eller intranasalt doseringstillfället bör möss vara gena behandla, till exempel en Cheerio eller skalade solrosfrön som positiv förstärkning. Behandlar ges som en belöning och för att distrahera dem från repor näsan, vilket kan orsaka skador på sig själva. När du arbetar med grupp hålls möss bör nog behandlar tappas för varje mus. Innan han återvände djur till sina burar vara säker på att återställa bon till sina ursprungliga tillstånd för att minska stress. Vid dosering grupp hålls djur måste handskar bytas mellan dosering av burar för att inte överföra doft från bur koloni till bur koloni, eftersom de kommer att bli aggressiva mot varandra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det finns flera sätt att bestämma effektiviteten för läkemedelstillförsel. Den första är att intranasalt administrera ett färgämne, såsom tusch eller metylenblått och att visualisera färgen efter avlivning av djuret i luktepitel och efter hjärnan avlägsnats in CNS genom cribrosa plattan. Det andra är att mäta läkemedlet levereras antingen med hjälp av en radio-märkt etikett eller med hjälp av ELISA detektion av den omärkta molekylen. Ett bra exempel på läkemedelsdistribution i CNS efter administrering att vakna möss kan hittas i Hanson et al. 2012 7. Vi förväntar luktloben och trigeminusnerven att innehålla en hög koncentration av den levererade läkemedlet. Vid 30 min efter intranasal administrering av 3,65 pmol deferoxamin var koncentrationerna i trigeminusnerven och luktnerven 29 M och 13 nM respektive. Läkemedelskoncentrationer kommer att framgå i alla regioner i hjärnan (i detta exempel en ringdee av 0,6 M till 4,1 M mättes) med högre koncentrationer i områden som får bidrag från lukt och trigeminala nerver. Till exempel kommer rostral regioner av hjärnbarken innehålla högre koncentrationer än kaudal cortex och pons innehåller högre koncentrationer än mellanhjärnan eller märgen. I ryggmärgen en fallande koncentrationsgradient från livmoderhalscancer till ländryggraden observeras i allmänhet (i detta exempel en gradient av 1,5 pM till 2,0 pM). Intranasal administrering resulterar också i höga koncentrationer av läkemedel som når hjärnhinnorna och cervikala lymfkörtlar. Det tredje sättet att visa effekten av leveransen är att mäta en beteende eller biokemisk respons på det administrerade läkemedlet. Till exempel resulterade intranasal deferoxamin behandling av transgena Alzheimers möss i förbättrad prestanda i en rumslig minne uppgift 7 och fosforylering av glykogensyntaskinas 3 beta 9.
| Dag | Åtgärd | |
| 1 | M | Håll i ~ 2-3 min |
| 2 | Tu | Håll i ~ 2-3 min |
| 3 | W | Håll och pet ~ 2-3 min |
| 4 | Th | Håll och pet ~ 2-3 min |
| 5 | F | Lätt nypa eller nackskinnet |
| 6 | M | Lätt nypa eller nackskinnet |
| 7 | Tu | Scruff och lyft |
| 8 | W | Scruff och lyft |
| 9 | Th | Intranasal Grip |
| 10 | F | Intranasal Grip |
| 11 | M </ Td> | Intranasal (IN) Grip och Invert |
| 12 | Tu | Intranasal (IN) Grip och Invert |
| 13 | W | I Grip, Invert, placera pipettspetsen nära näsan |
| 14 | Th | I Grip, Invert, placera pipettspetsen nära näsan |
| 15 | F | I Grip, Invert, leverera 1 v koksaltlösning för varje Nare |
| 16 | M | I Grip, Invert, leverera 1 v koksaltlösning för varje Nare |
| 17 | Tu | I Grip, Invert, leverera 2 v koksaltlösning för varje Nare |
| 18 | W | I Grip, Invert, leverera 2 v koksaltlösning för varje Nare |
Tabell 1. Prov Schema för Acklimatisering till Hantering av intranasal dosering att vakna möss.
* Pipetten laddas en gång med 6 pl, men administreras till musen som 2 x 3 il droppar.
Tabell 2. Prov Tidslinje för dosering en eller två möss.
Figur 1. Bilder på olika stadier och vinklar för att hålla en mus för vaken intranasal leverans av läkemedel. 1a) Håll musen ordentligt på buren toppen med den dominerande handen lämnar axlarna utsätts för gripa huden. 1B) Använd tummen och långfingretav den icke-dominanta handen att greppa och dra upp huden precis bakom skulderbladen. 1C) Använd pekfingret för att dra huden tillbaka från mellan ögonen mot tummen och långfingret (framifrån). 1D) Samma som 1C (sidan vy). 1E) Håll musen upp och ner med hjälp av ringfingret och / eller Pinky för att säkra basen av svansen till handflatan. Halsen av mus ska vara vågrät. 1F) Samma som E, från andra sidan. 1G) Administrera läkemedel med en 20 ul pipett och gel lastning pipettspetsen. 1H) Samma som 1G, närbild.
Figur 2. Ett foto av en komplett dosering station för 2 individuellt hållna möss. Inkluderat är de två mus burar med tillräckligt avstånd mellan att hålla mössen separat, en pipettTor med tips, en behållare för använda spetsar, en timer, dosering ark, en post-dosering behandla (som solrosfrön eller Cheerios), sanitära våtservetter, en P20 (eller P10) pipetten, och läkemedlet som skall levereras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod visar hur möss kan ges regelbundna doser av intranasal läkemedel som riktar hjärnan utan användning av anestesi. Intranasal läkemedel kan levereras till stora grupper av möss för förlängda tidsperioder med minimal ansträngning. En enda grupp med upp till 20 möss kan intranasalt behandlas av en enda person på mindre än en timme. Ett stort utbud av molekyler, allt från små järnkelatterapier till tillväxtfaktorer till mesenkymala stamceller, har visat sig snabbt rikta CNS och har visat effekt i gnagare modeller. Föreslagna mekanismer för direkt leverans från näsan till hjärnan inkluderar extracellulära transporter längs lukt och trigeminala nerver och bulk flödet i perivaskulära utrymmena 1,10. Intranasal leverans till CNS är en särskilt användbar teknik eftersom det inte bara är snabb, men det riktar CNS minska systemisk exponering. Till exempel resulterade intranasal administration av deferoxamin till råttor i 3-19 gånger högre concentrations i hjärnan regioner med 28 gånger lägre koncentrationer i blodet 11. I ett annat exempel, förbättrar intranasalt administrerat insulin minne hos Alzheimer-patienter inom 15 minuter utan att ändra plasmanivåerna av insulin eller glukos 12. En ytterligare fördel är den icke-invasivt av intranasal tillförsel tekniken.
Det finns flera begränsningar för denna metod. Först, är läkemedelstillförsel begränsad till ca 20-30 pl i en enda administrering, så löslighet av det terapeutiska kommer att spela en roll vid bestämning dosgränserna. Dessutom är läkemedelsformuleringen viktiga som faktorer som pH och salthalt kan påverka leveransen. Stora avvikelser från naturliga förhållanden, såsom extremt pH och salthalt, kan skada luftvägarna och lukt epitel hos möss. 13,14 Vidare kan intranasal dosering unanesthetized möss vara svåra att bemästra, och kan ta flera veckor av utbildning för intranasal "doserare "kunna Minimize "head-frihetsgrader" och uppnå optimal intranasal dosering av läkemedel. Med felaktig dosering teknik, kan läkemedlet rinna in i lungorna eller magen, vilket kan införa variabilitet i läkemedel når hjärnan. Tecken på att detta har skett är andningssvårigheter eller visualisering av vätska i munnen efter administrering. Om möjligt är det lämpligt att begränsa nya intranasala "doserare" till leverera saltlösning / fordon för att kontrollera grupper under flera veckor eller månader innan de godkänns att dosera läkemedel av expert utbildare. Slutligen är denna vakna intranasal metod begränsad till möss, som vakna råttor och större djur är inte lika lätt gripas, och kan vara alltför stressad när hålls upp och ner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka HealthPartners Institutional Animal Care och användning kommittén vid Regionkommitténs sjukhuset.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P20 pipettor set at 6 μl | |||
| Gel loading pipette tips | |||
| Timer | |||
| Waste receptacle for tips | |||
| Dosing sheet for notes | |||
| Pen | |||
| Drug and vehicle | |||
| Container to hold drug vials | |||
| Animals to be dosed | |||
| Spare gloves | |||
| Paper towels to wipe urine | |||
| Table 3. Materials Needed | |||
References
- Dhuria, S. V., Hanson, L. R., Frey, W. H. 2nd Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations. J. Pharm Sci. 99, 1654-1673 (2010).
- Thorne, R. G., Pronk, G. J., Padmanabhan, V., Frey, W. H. 2nd Delivery of insulin-like growth factor-I to the rat brain and spinal cord along olfactory and trigeminal pathways following intranasal administration. Neuroscience. , 127-481 (2004).
- Benedict, C., et al. Intranasal insulin as a therapeutic option in the treatment of cognitive impairments. Exp. Gerontol. 46, 112-115 (2011).
- Francis, G. J., et al. Intranasal insulin prevents cognitive decline, cerebral atrophy and white matter changes in murine type I diabetic encephalopathy. Brain. 131, 3311-3334 (2008).
- Francis, G., et al. Intranasal insulin ameliorates experimental diabetic neuropathy. Diabetes. 58, 934-945 (2009).
- Marks, D. R., Tucker, K., Cavallin, M. A., Mast, T. G., Fadool, D. A. Awake intranasal insulin delivery modifies protein complexes and alters memory, anxiety, and olfactory behaviors. J. Neurosci. 29, 6734-6751 (2009).
- Hanson, L., et al. Intranasal delivery of deferoxamine reduces spatial memory loss in APP/PS1 mice. Drug Delivery and Translational Research. 2, 160-168 (2012).
- Danielyan, L., et al. Protective effects of intranasal losartan in the APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer disease. Rejuvenation Research. 13, 195-201 (2010).
- Fine, J. M., et al. Intranasal deferoxamine improves performance in radial arm water maze, stabilizes HIF-1alpha, and phosphorylates GSK3beta in P301L tau transgenic mice. Exp. Brain Res. 219, 381-390 (2012).
- Lochhead, J. J., Thorne, R. G. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system. Adv. Drug Deliv. Rev. 64 (11), 614-628 (2012).
- Hanson, L. R., et al. Intranasal deferoxamine provides increased brain exposure and significant protection in rat ischemic stroke. J. Pharmacol. Exp Ther. 330, 679-686 (2009).
- Reger, M. A., et al. Effects of intranasal insulin on cognition in memory-impaired older adults: modulation by APOE genotype. Neurobiol. Aging. 27, 451-458 (2006).
- Kim, C. H., Song, H. yun, M, E. unA. hn, Lee, Y., G, J., Yoon, J. H. Effect of hypo-, iso- and hypertonic saline irrigation on secretory mucins and morphology of cultured human nasal epithelial cells. Acta Otolaryngol. 125, 1296-1300 (2005).
- Greiff, L., Andersson, M., Wollmer, P., Persson, C. G. Hypertonic saline increases secretory and exudative responsiveness of human nasal airway in vivo. Eur. Respir. J. 21, 308-312 (2003).
