Summary
鼻腔内に脳を標的とすることの目的のために目を覚ましたマウスに薬を投与するための方法が記載されている。このメソッドは長い麻酔なしで薬物の鼻腔内投与を使用してピリオド、最小限の全身暴露と鼻から脳への配信をオーバー投与リピートが可能になります。
Abstract
鼻腔内投与は中枢神経系（CNS）に治療薬を送達する方法である。これは、非侵襲的であり、CNSへの血液脳関門へのアクセスを交差しない大きな分子を可能にします。薬が直接全身曝露を減らすこと、鼻腔内送達による中枢神経系を標的とするため、不要な全身性の副作用1アール 。鼻からCNSへの配達は細胞外の経路を介して嗅覚と三叉神経経路の両方に沿って数分以内に発生し、任意の受容体や軸索輸送2に結合する薬剤を必要としません。鼻腔内送達は広く公表の方法であり、現在3ヒト臨床試験で使用されています。
動物モデルにおける薬物の鼻腔内送達は、薬物動態学的分布と有効性の初期評価を可能にする。マウスで、それはステーキを使用して、定期的に目を覚まして（非麻酔）動物に薬を投与することが可能である鼻腔内グリップをlized。それは麻酔なし長期慢性投与を可能にするため、目が覚めて配達は有益ですが、それは麻酔よりも時間がかかり、技術者のチームが短期間でマウスの用量の大きい数字ができるように、多くの人々が学び、実行することができます。マウスにこの方法で鼻腔内投与の治療薬の有効性は、糖尿病モデルマウスのアルツハイマーマウスモデルで4-6とデフェロキサミンのインスリンを含む多くの研究で実証されている。7,8
マウスに対する鼻腔内グリップは学んだが、容易ではなく、訓練、技能、そして効果的に脳に薬物を送達し、肺と胃に排水を避けるために正確なグリップを必要とすることができます。マウスは首を持つ非利き手で修正された首筋を使って手で拘束されている薬剤は利き手を使用ピペッターで配信されている間、床と平行に開催しました。これは、通常はマウスの前処理に慣れの3-4週間を要するストレス応答せずに、このグリップで保持することができる。我々は、この鼻腔内送達技術をよりアクセシブルにするために、このJoveのビデオを用意しました。
Protocol
1。目がさめているマウスに鼻腔内投与のため取り扱いに順応
はじめに
マウスは、鼻腔内投与の発症前二から四週間の期間のための処理に慣れている必要があります。それは目を覚まし鼻腔薬物送達の最大の効果のための正しい身体の位置を確保することができように取り扱いに馴化は、重要です。また、適切にこのプロセスに慣れていないマウスは、投与後の重度の不安反応を持つことができます。マウスは、取り扱いに動物の快適さに応じて、次のステップに進む前に、9つのステップのそれぞれで約2-3日間費やす必要があります。マウスのストレスレベルは進歩の尺度として使用されるべきである。これは、排尿、排便の量/周波数をマウスの動きを監視して震えて、かむことを意味します。マウスは高いストレス反応を持っている場合、レスポンスが低下するまで次に進む前に、そのステップに留まる。サンプル順応SCHeduleは、 表1に見ることができます。マウスの馴化は、次の一日一回のステップを経て進行する必要があります。一日一回以上の手順を実行して、順化を加速するための試みで、お勧めできません。
- 動物が頻繁にこの入門ステップの間にジャンプのように、ケージの最上部より上にもう1足より、2〜3分の期間の間の手のひらの上にマウスを置きます。マウスは手に負えなくクロールし、自分の腕の上では、単純に、尾の付け根でマウスを持ち上げて、自分の手でそれをバックに配置しようとした場合。
- 3分間の手のひらの上でマウスを置き、優しく動物をペット。動物が自由に動き回ることを可能にしながら、尾、頭と方向性が、マウスをペット。
- 耳（軽く親指とポインタの指を使って首の後ろの皮膚を一緒につまんで）の後ろにマッサージしながら3分間の手のひらの上にマウスを置きます。
- 李/ホールド再びホールドを繰り返す前に、30秒間、ケージの上にマウスの残りをさせる、30秒間その首筋でマウスをフィート
- 2章に記述されて鼻腔内グリップを使用して、マウスボタンを押したまま、しかし（2.4ステップまで完了）動物を反転しない。 30秒の間、このような動物を保持し、ケージの上部に戻って放します。 1分程度の休憩期間後の二度目を繰り返します。
- その腹側を天井に向かって上を向いているので、反転動物を含む、第2節で説明したように鼻グリップを使用して、マウスを押したままにします。動物の首が床と平行であることを確認してください。 30秒のためのこの位置を保持します。これを1分間の休息期間後に二度目を繰り返します。一部のマウスには順応のこの段階での反転を初めて使用する場合は特に、他よりも鼻腔内グリップに抵抗する。マウスはグリップから自分自身を解放した場合、ケージの上部と再グリップの上にマウスを戻す。必要に応じて再グリップを繰り返ししかし、マウスのストレスレベルを監視し、必要に応じてケージに戻します。馴化の過程で、この時点でグリップを失うことで役割を果たすことができるもう一つの要因は、鼻腔内送達技術を持つ動物のハンドラの未経験です。
- 簡単に各鼻孔上空の先端でピペッターを置いて、30秒のために動物の位置を保持し、反転、鼻腔内グリップを使用して、マウスを押したままにします。 1分程度の休憩期間を経て、これを繰り返します。
- 鼻腔内グリップ付きのマウスを持ち、それを反転させます、そして、セクション3（ステップ3.7を介して）で説明したように、左右の鼻腔内に鼻孔に生理食塩水の6μlを管理します。
- それを反転し、鼻腔内グリップを使用して、マウスを押したまま、鼻腔内にセクション3で説明したように二回、間にケージの上に戻って動物を配置し、左右の鼻孔内に生理食塩水の6μlを管理します。
2。アウェイクマウスを固定するために鼻グリップ
- マウスoを置くn個のケージの上。
- あなたの利き手の親指と人差し指で、尾でマウスを押したままにします。あなたの真ん中、リング、小指の指を使って、軽くケージ上部（ 図1A）に本体の下部を固定する。あなたが軽くマウスを伸ばし、より良い首筋をつかむようにバーの上にマウスのグラブをしましょう。
- あなたの非利き手の親指と中指を使って、首と肩の後ろの首筋（余剰皮膚）でしっかりとマウスをつまむ。肩甲骨（ 図1B）の向こう側の皮膚のテントを作るためにたるんだ皮膚を引き上げます。できるだけ皮膚を取るが、これはマウスに不快感の原因となるので筋肉をプルアップしないように注意してください。演習では、なるように、動物の肋骨や脊椎に過度の圧力が加わらないように注意を促している。皮膚の過剰な圧力や引っ張りにはいくつかのケースでは呼吸の抑制につながる可能性があります。
- 早くマウスの頭の上にあなたの非利き手の人差し指を置くできるだけ鼻に近く、皮膚に引き戻す（ 図1C、1D）。同時に、最適な位置のために頭に向かって親指と中指をスライドさせます。理想的には、マウスが垂直方向または水平方向に頭を動かすことができないはずです。
- 首筋のグリップを維持しながら、彼の背中の上にマウスの電源を入れます。マウスの背中には、あなたの手のひらの上でなければなりません。しっかりとマウスを安定させるためにあなたの最後の2本の指（リングと小指）で手のひらに対するマウスの尾を（底部近く）を保持したり、下半身（ 図1E、1F）全体にわたって指をラップすることができる。
- この時点でマウスの首とあごが平らで、床と平行であることを確認してください。あごは首、できるだけ鼻腔内送達を支援するために180度の角度に閉じる必要があります。角度のわずかな変化は、薬が間違ってサイトに行きつくことがあります。マウスは腹部を見て、息ができていることを確認します。マウス笙移動することはできません自民が、どんな痛みで快適になるといけません。あなたは "V"を作るマウスの首とあごが表示された場合は、グリップを再作成する必要があります。
3。目がさめているマウスへの薬物の鼻腔内送達
はじめに
鼻腔内のグリップを使用して、それぞれのマウスは二度抑制と液の20〜30μlのが投与されている間床と平行に自分の首を構えています。このボリュームは、安全かつ小大マウスに有効であり、我々は一般的に24μlを使用し、このプロトコルで説明されている。目を覚まし鼻腔方法が発達神経科学研究のための新生児マウスで例えば、どの年齢のマウスで使用することができます。新生児マウスでは、小さい総量（8μL）と液滴サイズ（1μl）を鼻腔の小さいボリュームを収容するために使用されるべきである。薬は、一般的にほとんどの時間効率的に活用し、oを保つために、休憩時間を交互に、一度に2匹のマウスに配信されますn個のスケジュール。セットアップでは、グループに収容されたマウスまたは個別に飼育したマウスに投与された場合に応じて多少異なるものになります。個別飼育したマウスで、それは他のケージ上部にクロスオーバーからマウスを防ぐために、ケージの間にあなたの材料をすべて配置しておくと便利です。グループに収容されたマウスと、それだけでケージからの線量。それは、グループに収容されケージの各マウスは、同じ鼻腔内治療を受ける二つの異なる治療法の交差汚染の可能性として空気中にまたは皮膚接触による薬物追放のために存在していることが重要です。それは非常にそれぞれの動物の一般的な健康状態等に注意することは、逃した滴の任意のメモを記録し、治療割付けの技術者を思い出させるために、投薬シートを事前に印刷されることをお勧めします
手順
- 彼らは投与のためのものであるべきケージを設定し、投与ステーション（ 図2）を設定します 。
- ケージからマウスを外し、投与中にケージの上に保つ。
- セクション2で説明された鼻腔内グリップを使用してマウスを拾う。
- あなたの利き手を使用して、薬物または車両の6μlのピペッターをロードします。通常は45度の角度（ 図1G、1H）でマウスの左鼻孔、近く埋めピペッターのチップを置きます。あなたは粘性溶液を使用している場合、薬がなく、ドロップを作るのピペットチップのサイドを駆け上がる可能性があるため、90度に角度を大きくする必要があります。非常に粘稠な場合には、液体を排出する前に、組織とピペットチップを拭くことに役立つことがあります。徐々にボリュームの約半分（3μl）を小さな液滴を形成するために薬剤を取り出す。
- マウスは、液滴を吸入することができるように、液滴が十分に近いマウスの鼻孔に配置しなければなりません。マウスがこの小滴を吸入した直後に、後2〜3秒ほど同じ鼻孔から吸入するために、マウスのための別の小さな液滴を形成するために、ピペットチップに薬剤の残りの部分を取り出します。口の中を見てください。もしそこに私口の中でどのような液体、ドロップは鼻の中に完全に間に合わなかった、これは注目すべきである。
- 15秒間、この位置でマウスを押したままにします。それは非常にタイマーがこの15秒のホールドを標準化するために使用することをお勧めします。
- 右の鼻孔は3.6 - 3.3の手順を繰り返します。任意の滴が外鼻を鳴らしている場合は、そのドロップが交換され、注目すべきである。
- 2分のために彼のケージの上に戻ってマウスを置きます。 2分の起動プロセス全体を繰り返します。最初のドロップの出産後。これは、マウス6μlの溶液を24μlを、計4滴を与える。一度に1つまたは2つのマウスを投与するためのサンプルスケジュールは、 表2に見られるようにすることができます。
- マウスはすべてのドロップを受け取った後、そのケージにマウスを返す。
4。馴化と覚醒マウスへの薬物の鼻腔内送達のための一般的な動物の取り扱い技術
各馴化または鼻腔内投与セッションの後、マウスは与えなければならないnaはこのような肯定的な補強としてチェリオまたは剥離ヒマワリ種子として扱う。お菓子は、ご褒美として与えられ、彼らの鼻を掻くからそれらをそらすために、潜在的に自分自身に傷害を引き起こす。グループに収容されたマウスを操作するときは、十分な扱いを各マウスのために廃棄されるべきである。ケージに動物を戻す前に、ストレスを軽減するために、元の状態に巣を復元するようにしてください。グループに収容された動物に投与すると、手袋は、彼らがお互いに向かって積極的になるようになるように、ケージからケージコロニーコロニーに香りを転送しないケージの投与の間で変更する必要があります。
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Representative Results
薬物送達の効力を決定する方法はいくつかあります。第一は、鼻腔内にそのような墨やメチレンブルーなどの色素を投与すると嗅上皮内および脳後の動物の安楽死の後、染料を可視化することである篩板を介して中枢神経系を入力すると、削除されます。第二には、放射性標識タグを使用したり、ラベルの付いていない分子のELISA検出のどちらかを使用して送達される薬物を測定することです。目が覚めてマウスに投与した後、CNSにおける薬物分布の良い例は、ハンソンらで見つけることができます2012年7。我々は、嗅球と三叉神経が送達される薬物を高濃度に含んでいることを期待しています。 3.65マイクロモルデフェロキサミンの鼻腔内投与後30分で、三叉神経や嗅神経における濃度は、それぞれ29μMおよび13μMであった。薬物濃度（この例では鳴った、脳の全ての領域を通じて明らかになるであろう4.1μM〜0.6μMのeは、嗅覚と三叉神経からの入力を受ける地域で高い濃度で）を測定した。たとえば、皮質の吻側領域は中脳や延髄よりも高い濃度で含まれています尾皮質と橋よりも高い濃度を含んでいます。脊髄の腰椎への子宮頸からの降順の濃度勾配は、一般的に（この例では2.0μM〜1.5μMの勾配）が観察されています。鼻腔内投与はまた、髄膜および頸部リンパ節に到達する薬剤の高濃度をもたらす。配信の有効性を実証するための第三の方法は、投与された薬物に対する行動的または生化学的応答を測定することです。例えば、トランスジェニックアルツハイマー病マウスの鼻腔内デフェロキサミン治療は、空間記憶課題7とグリコーゲンシンターゼキナーゼ3ベータ9のリン酸化の改良された性能が得られた。
| 日 | アクション | |
| 1 | M | 〜2-3分間保持 |
| 2 | 火曜日 | 〜2-3分間保持 |
| 3 | W | ホールドやペット〜2-3分 |
| 4 | 木曜日 | ホールドやペット〜2-3分 |
| 5 | F | 軽くピンチや首筋 |
| 6 | M | 軽くピンチや首筋 |
| 7 | 火曜日 | 首筋とリフト |
| 8 | W | 首筋とリフト |
| 9 | 木曜日 | 鼻腔内グリップ |
| 10 | F | 鼻腔内グリップ |
| 11 | M </ TD> | 鼻腔内（IN）のグリップと反転 |
| 12 | 火曜日 | 鼻腔内（IN）のグリップと反転 |
| 13 | W | グリップに、鼻の近くにピペットチップを置いて、反転 |
| 14 | 木曜日 | グリップに、鼻の近くにピペットチップを置いて、反転 |
| 15 | F | グリップに、反転、各鼻孔に生理食塩水1ラウンドを配信 |
| 16 | M | グリップに、反転、各鼻孔に生理食塩水1ラウンドを配信 |
| 17 | 火曜日 | グリップに、反転、各鼻孔に生理食塩水2ラウンドを配信 |
| 18 | W | グリップに、反転、各鼻孔に生理食塩水2ラウンドを配信 |
表1。目がさめているマウスに鼻腔内投与のため取り扱いに順応するためのサンプルスケジュール。
*ピペッターは、6μlで一度ロードされますが、2×3μlのドロップとしてマウスに投与される。
表2。 1つまたは2つのマウスを投与するためのサンプルタイムライン。
図1。薬剤の覚醒鼻腔内送達のためのマウスを保持するのさまざまな段階と角度の写真。1A）皮膚を掴むにさらさ肩を残して利き手でケージの上にしっかりと押し下げ、マウスを押したままにします。1B）は、親指と中指を使って非利き手のちょうど肩甲骨の後ろの皮膚をつかんで引き上げます。1C）は 、親指と中指（正面）に向かって目と目の間から背中の皮膚を引っ張るために人差し指を使用します。1D）1C（側と同じビュー）。1E）は、手のひらの上に尾の付け根を確保するために薬指および/ または小指を使って逆さまにマウスを押したままにします。マウスの首水平でなければならない。1F）反対側から、Eと同じ。1G）は 20μlのピペッターとゲルローディングピペットチップで薬を管理します。1H）を1G、クローズアップビューと同じ。
図2。 2個別飼育マウスのための完全な投与駅の写真は含まれており、マウスは別々に保管する間に十分な距離を有する2つのマウスケージ、ピペットアールヒントとTorを、使用のヒントのための容器、タイマー、投薬シート、投与後の御馳走（ヒマワリの種またはチーリオスなど）、衛生的なワイプ、P20（もしくはP10）のピペッター、及び送達される薬物。
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Discussion
この方法では、マウスを麻酔を使用せずに脳を対象とする鼻腔薬の定期的な投与量を与えることができる方法を示しています。鼻腔薬は最小限の労力で長期間にわたってマウスの大規模なグループに配信することができます。 20匹までの単一のグループは、鼻腔内に1時間未満で一人で治療することができます。小鉄キレートから間葉系幹細胞に成長因子に至るまでの分子の広大な配列は、急速に中枢神経系を標的とすることが実証されているとげっ歯類モデルにおいて有効性を示している。鼻から脳への直接配送の提案されたメカニズムは、嗅覚、三叉神経と血管周囲のスペース1,10内のバルクフローに沿って細胞外輸送を含む。それが急速であるためだけでなく、CNSへの鼻腔内送達は、特に有用な技術であるが、それは全身曝露を削減するCNSをターゲットにしています。例えば、ラットへのデフェロキサミンの鼻腔内投与は、3から19倍conceをもたらし血11の28倍低い濃度で脳領域におけるntrations。別の例では、鼻腔内に投与しインスリンはインスリンやグルコース12の血漿中濃度を変化させずに15分以内にアルツハイマー病患者の記憶が改善されます。さらなる利点は、鼻腔内送達技術の非侵襲性である。
この方法にはいくつかの制限があります。まず、薬物送達は、単回投与で約20〜30μlに限られているので、治療の溶解度は、線量限度を決定する上で役割を果たすことになる。また、製剤は、pHと塩分濃度などの要因が配達に影響を与える可能性が重要である。このような極端なpHと塩分濃度などの自然条件から大きく偏ると、無麻酔マウスの13,14さらに、鼻腔内投与は習得が困難な場合があります。マウスの呼吸器および嗅上皮に損傷を与えることができ、鼻腔"dosersのための訓練の数週間かかる場合があります"ミニムできるようにするには"ヘッド余地"をIZEと薬物の最適鼻腔投与を達成。誤った投薬技術を用いて、薬剤が肺や脳に到達する薬剤の変動を導入することができ、胃に排出することができます。これが発生したことを示す兆候は、投与後の口の中で困難や液体の可視化を呼吸している。可能であれば、それは彼らが専門のトレーナーによる用量薬物に承認される前に数週間または数ヶ月のためにグループを制御するための生理食塩水/車両を提供するための新しい鼻 "dosers"を制限することをお勧めします。最後に、この目を覚まし鼻腔方法は覚醒ラットと大きな動物は同じように簡単に把持し、過度に逆さまに開催されたときに強調することができないので、マウスに限られています。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
著者はHealthPartnersインスティテューアニマルケアに感謝し、地域病院で委員会を使用したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P20 pipettor set at 6 μl | |||
| Gel loading pipette tips | |||
| Timer | |||
| Waste receptacle for tips | |||
| Dosing sheet for notes | |||
| Pen | |||
| Drug and vehicle | |||
| Container to hold drug vials | |||
| Animals to be dosed | |||
| Spare gloves | |||
| Paper towels to wipe urine | |||
| Table 3. Materials Needed | |||
References
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