Summary
Un metodo per somministrare farmaci per via intranasale topi svegli per lo scopo di indirizzare il cervello è descritto. Questo metodo consente di ripetere il dosaggio per lunghi periodi con la somministrazione intranasale del farmaco senza anestesia, e faccia a cervello di consegna con un'esposizione sistemica minima.
Abstract
Somministrazione intranasale è un metodo di fornire agenti terapeutici per il sistema nervoso centrale (CNS). E non è invasivo e permette di molecole di grandi dimensioni che non attraversano il sangue-cervello barriera di accesso al sistema nervoso centrale. I farmaci sono direttamente mirate al sistema nervoso centrale, con la somministrazione intranasale, riducendo l'esposizione sistemica e quindi indesiderati effetti collaterali sistemici 1. Consegna dal naso al SNC verifica in pochi minuti lungo entrambe le vie olfattive e trigemino neurali tramite via extracellulare e non richiede farmaco di legarsi al recettore o qualsiasi trasporto assonale 2. Consegna intranasale è un metodo ampiamente pubblicizzato ed è attualmente utilizzato nel corso degli studi clinici 3.
Consegna intranasale dei farmaci in modelli animali permette per la valutazione iniziale di distribuzione farmacocinetica ed efficacia. Con i topi, è possibile somministrare farmaci per animali svegli (non anestetizzati) su base regolare utilizzando un spelizzati presa intranasale. Consegna Awake è utile perché permette di lungo periodo di somministrazione cronica senza anestesia, ci vuole meno tempo che con l'anestesia, e può essere imparato e fatto da molte persone in modo che squadre di tecnici sono in grado numero grande dose di topi in brevi periodi. Efficacia di terapie somministrate intranasale in questo modo di topi è stata dimostrata in numerosi studi inclusi insulina in modelli murini diabetici 4-6 e deferoxamina in modelli di topo di Alzheimer. 7,8
L'impugnatura intranasale per i topi possono essere apprese, ma non è facile e richiede pratica, abilità, e una presa precisa per fornire in modo efficace farmaco per il cervello ed evitare il drenaggio al polmone e dello stomaco. I topi sono trattenuti a mano usando un scruff modificato nella mano non dominante con il collo tenuto parallelo al pavimento, mentre il farmaco viene fornito con una pipetta con la mano dominante. Di solito ci vogliono 3-4 settimane di acclimatando al trattamento prima di topipuò essere tenuto con questa presa senza risposta allo stress. Abbiamo preparato il video JoVE per rendere questa tecnica di somministrazione intranasale più accessibile.
Protocol
1. L'acclimatazione di Gestione per somministrazione endonasale di Mice Awake
Introduzione
Topi devono essere acclimatati per gestire per un periodo di 2-4 settimane prima dell'inizio della somministrazione endonasale. L'acclimatazione al trattamento è importante, in quanto aiuta a garantire una posizione corretta del corpo per la massima efficacia della somministrazione di farmaci intranasale sveglio. Inoltre, i topi che non sono stati adeguatamente abituati a questo processo può avere una reazione grave ansia dopo la somministrazione. I topi dovrebbe spendere circa 2-3 giorni in ciascuno dei nove passi prima di passare alla fase successiva, a seconda della comodità dell'animale alla movimentazione. Livello di stress del mouse deve essere utilizzato come misura del progresso. Ciò significa che il controllo dei movimenti del topo, la quantità / frequenza della minzione, defecazione, tremante, e mordere. Se il mouse è dotato di una risposta di elevato stress, rimanere su quel passo prima di passare a quello successivo fino a quando la risposta si riduce. Un campione acclimatazione schedule si può vedere nella tabella 1. Acclimatazione dei topi dovrebbe progredire attraverso i seguenti volta al giorno passi. Eseguire le operazioni descritte più di una volta al giorno, nel tentativo di accelerare l'acclimatazione, non è raccomandato.
- Posizionare il mouse nel palmo della mano per un periodo di 2-3 minuti, non più di un piede sopra la parte superiore della gabbia, come animali frequentemente saltate durante questa fase introduttiva. Se il mouse tenta di strisciare fuori dalla mano e il proprio braccio, basta sollevare il mouse dalla base della coda e rimetterlo in mano.
- Posizionare il mouse nel palmo della mano per tre minuti e pet l'animale delicatamente. Pet il mouse direzionale dalla testa alla coda, permettendo all'animale di muoversi liberamente.
- Posizionare il mouse nel palmo della mano per tre minuti mentre massaggia dietro le orecchie (leggermente pizzicare insieme la pelle sulla parte posteriore del collo con il pollice e il dito indice).
- Tenere / lift il mouse dalla collottola per 30 sec, lasciando il resto del mouse sulla parte superiore della gabbia per 30 secondi prima di ripetere la presa di nuovo.
- Tenere il mouse utilizzando il grip intranasale, che è descritta nella sezione 2, ma non invertire l'animale (completare fino al punto 2.4). Tenere l'animale in questo modo per un periodo di 30 secondi e rilasciare torna gabbia. Ripetere una seconda volta dopo un periodo di un minuto di riposo.
- Tenere il mouse con la presa intranasale, come descritto nella sezione 2, tra cui invertendo l'animale per cui il suo lato ventrale è rivolto verso l'alto verso il soffitto. Assicurarsi che il collo dell'animale è parallelo al pavimento. Mantenere questa posizione per 30 secondi. Ripetere questa operazione una seconda volta dopo un periodo di un minuto di riposo. Alcuni topi resistere alla presa intranasale più di altri, in particolare quando viene utilizzato per la prima volta con inversione in questa fase nella acclimatazione. Se il mouse si libera dalla morsa, mettere il mouse indietro sulla parte superiore della gabbia e ri-presa. Ripetere la ri-presa se necessario, Ma monitorare il livello di stress del mouse e riportarlo alla gabbia, se necessario. Un altro fattore che può giocare un ruolo nel perdere l'aderenza a questo punto il processo di acclimatazione è inesperienza dei gestori di animali con la tecnica di somministrazione intranasale.
- Tenere il mouse con la presa intranasale, invertire, brevemente mettere una pipetta con una punta vuoto su ogni narice, e tenere la posizione degli animali per 30 sec. Ripetere questo dopo un minuto di riposo.
- Tenere il mouse con il grip intranasale, è invertito, e intranasale amministrare 6 ml di soluzione fisiologica nel nare a destra ea sinistra, come descritto nella sezione 3 (fino al passo 3.7).
- Tenere il mouse con la presa intranasale, invertito, e intranasale amministrare 6 ml di soluzione fisiologica nel nare a destra ea sinistra due volte ponendo l'animale indietro sulla parte superiore della gabbia in mezzo, come descritto nella sezione 3.
2. Il Grip intranasale a Immobilizzare Mice Awake
- Posizionare l'O del mousen la gabbia superiore.
- Con il pollice e l'indice della mano dominante, tenere premuto il mouse per la coda. Utilizzando il medio, anulare e mignoli, leggermente pin la porzione inferiore del corpo all'inizio gabbia (Figura 1A). Lasciate che il topo afferrare le sbarre, come si allungare leggermente il mouse fuori e meglio prendere la collottola.
- Con il pollice e il medio sul vostro mano non dominante, stringere il mouse saldamente la collottola (eccesso di pelle) dietro il collo e le spalle. Sollevare la pelle flaccida di fare una tenda di pelle tra le scapole (Figura 1B). Prendere la pelle il più possibile, ma attenzione a non tirare il muscolo in quanto ciò causare disagio al mouse. Prestare attenzione al fine di non applicare troppa pressione alla cassa toracica dell'animale o della colonna vertebrale. Pressione eccessiva o tirando la pelle può portare all'inibizione della respirazione in alcuni casi.
- Rapidamente posizionare il dito indice della mano non dominante sulla testa del mouse comevicino al naso possibile e tirare la pelle (Figura 1C, 1D). Allo stesso tempo, far scorrere il pollice e il dito medio verso la testa per la posizione ottimale. Idealmente, il mouse non dovrebbe essere in grado di muovere la testa in verticale o in orizzontale.
- Pur mantenendo la presa sulla collottola, girare il mouse sulla schiena. Indietro Il mouse dovrebbe essere nel palmo della vostra mano. Tenere saldamente la coda del topo (vicino alla base) contro il palmo della mano con le ultime due dita (anulare e mignolo) per stabilizzare il mouse, oppure si può avvolgere le dita attraverso la parte inferiore del corpo (Figura 1E, 1F).
- A questo punto assicurarsi che il collo del topo e del mento sono piane e parallele al pavimento. Il mento deve essere vicino a un angolo di 180 gradi con il collo, per quanto possibile per aiutare con la somministrazione intranasale. Lievi variazioni dell'angolo può causare la droga a finire nel sito sbagliato. Assicurarsi che il mouse è in grado di respirare guardando l'addome. Il mouse should non essere in grado di muoversi, ma deve essere confortevole e non in alcun dolore. Se si vede il collo del mouse e il mento facendo una "V", allora avete bisogno di ri-presa.
3. Consegna intranasale di droga per topi Awake
Introduzione
Utilizzando l'impugnatura intranasale, ciascun topo è trattenuto due volte e tenuto con il collo parallelo al pavimento, mentre un volume di 20-30 ml di liquido viene somministrato. Questo volume è sicuro ed efficace per le piccole-grandi topi, si utilizzano in genere 24 microlitri, e che è descritto in questo protocollo. Il metodo sveglio intranasale può essere utilizzato in topi di qualsiasi età, per esempio in topi neonati per la ricerca evolutiva neuroscienze. In topi neonati, un volume totale inferiore (8 pl) e dimensione delle gocce (1 ml) deve essere utilizzato per accogliere il volume più piccolo della cavità nasale. Droga è in genere consegnato a due mouse alla volta, alternando periodi di riposo di fare un uso più efficiente del tempo e mantenere on programma. Set-up sarà un po 'diverso a seconda se si sta dosaggio topi del gruppo ospitato o topi alloggiati individualmente. Con i topi tenuti in ricoveri individuali, è utile inserire tutti i materiali tra le gabbie per evitare che i topi da attraversare alla cima gabbia altro. Con il gruppo-alloggiato i topi, la dose da quella gabbia solo. È importante che ciascun topo in gabbia alloggiato in gruppo riceve lo stesso trattamento intranasale, come potenziale di contaminazione incrociata dei due diversi trattamenti esiste grazie alla espulsione farmaco in aria o con contatto cutaneo. E 'altamente raccomandato che un foglio di dosaggio da stampare in anticipo, per ricordare i tecnici di incarichi di trattamento, di registrare le note delle gocce perse, da notare la salute generale di ciascun animale, ecc
Passi
- Impostare gabbie dove dovrebbero essere per il dosaggio, e impostare una stazione di dosaggio (Figura 2).
- Rimuovere mouse dalla gabbia e mantenere in cima gabbia durante il dosaggio.
- Prendete il mouse utilizzando il grip intranasale descritto nella sezione 2.
- Con la mano dominante, caricare la pipetta con 6 ml di farmaco o di un veicolo. Posizionare la punta della pipetta riempita vicino narice sinistra del mouse, di solito in un angolo di 45 gradi (Figura 1G, 1H). Se si dispone di una soluzione viscosa, potrebbe essere necessario aumentare il vostro angolo di 90 gradi, perché il farmaco può essere eseguito sul lato della punta della pipetta, invece di fare una goccia. Se molto viscoso, asciugandosi la punta della pipetta con un panno prima di espellere liquido può aiutare. Lentamente espellere il farmaco per formare una gocciolina piccola con circa metà del volume (3 ml).
- La goccia dovrebbe essere collocato sufficientemente vicino alla narice del mouse in modo che il mouse può inalare la goccia. Subito dopo il mouse inala questa piccola goccia, espellere il resto del farmaco nella punta della pipetta per formare un altro piccola goccia per il mouse per inalare attraverso la stessa narice circa 2-3 secondi più tardi. Assicuratevi di guardare la bocca. Se is qualsiasi liquido in bocca, la goccia non ce l'ha fatta completamente nel naso e questo dovrebbe essere notato.
- Tenete il mouse in questa posizione per 15 secondi. E 'altamente raccomandato che un timer da utilizzare per standardizzare questi 15 attesa sec.
- Ripetere i passaggi 3,3-3,6 per la narice destra. Se le gocce sono sbuffò fuori, quella goccia dovrebbe essere sostituito e ha preso atto.
- Posizionare il mouse di nuovo al top della sua gabbia per 2 min. Ripetere l'intero processo di partenza 2 min. dopo la consegna della prima goccia. Questo dà il mouse quattro gocce di 6 microlitri ciascuna totale di 24 microlitri di soluzione. Un esempio di orario per il dosaggio di uno o due topi in una volta può essere visto in Tabella 2.
- Dopo che il mouse ha ricevuto tutte le gocce, riportare il mouse per la sua gabbia.
4. Generali tecniche di gestione degli animali di acclimatazione e consegna intranasale del farmaco a topi Awake
Dopo ogni sessione di acclimatazione o di somministrazione endonasale, topi dovrebbe essere darena trattare, ad esempio un Cheerio o girasole sfogliato come rinforzo positivo. Tratta sono dati come una ricompensa e per distrarli da graffi il naso, potrebbe causare lesioni a se stessi. Quando si lavora con i topi del gruppo ospitato, tratta abbastanza dovrebbe essere eliminato per ogni mouse. Prima di tornare al loro gabbie animali assicurarsi di ripristinare nidi allo stato originale, al fine di ridurre lo stress. Quando dosaggio gruppo animali alloggiati, guanti devono essere sostituiti tra dosaggio di gabbie per non trasferire profumo da colonia a colonia gabbia gabbia, in quanto sarà aggressivo verso l'altra.
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Representative Results
Esistono diversi modi per determinare l'efficacia della somministrazione di farmaci. Il primo è quello di somministrare intranasale un colorante, come inchiostro India o blu di metilene e di visualizzare il colorante dopo eutanasia dell'animale nel epitelio olfattivo e dopo il cervello è rimosso, entrando dal SNC attraverso la lamina cribrosa. Il secondo è quello di misurare il farmaco somministrato mediante utilizzo di un tag radio-marcato o ELISA utilizzando il rilevamento della molecola non marcato. Un buon esempio di distribuzione del farmaco nel SNC dopo somministrazione a topi sveglio può essere trovato in Hanson et al. 2012 7. Ci aspettiamo bulbo olfattivo e nervo trigemino contenere un'alta concentrazione del farmaco erogato. A 30 minuti dopo la somministrazione intranasale di 3,65 mmol deferoxamina, le concentrazioni nel nervo trigemino e nervo olfattivo erano 29 pM e 13 pM rispettivamente. Concentrazioni di farmaco sarà evidente in tutte le regioni del cervello (in questo esempio un squillatoe di 0,6 micron a 4,1 pM è stato misurato) con concentrazioni più elevate nelle zone che beneficiano del contributo dei nervi olfattivi e del trigemino. Ad esempio, le regioni rostrali della corteccia contengono concentrazioni superiori caudale corteccia e il ponte conterrà concentrazioni superiori del mesencefalo e midollo. Nel midollo spinale di un gradiente di concentrazione decrescente da cervicale a colonna lombare è generalmente osservata (in questo esempio un gradiente di 1,5 micron a 2,0 pM). Intranasale amministrazione si traduce anche in alte concentrazioni di farmaco raggiungono le meningi e dei linfonodi cervicali. Il terzo modo per dimostrare l'efficacia di consegna è di misurare una risposta comportamentale o biochimici al farmaco somministrato. Per esempio, il trattamento deferoxamina intranasale di topi transgenici Alzheimer comportato prestazioni migliorate in un compito di memoria spaziale 7 e fosforilazione del glicogeno sintasi chinasi 3 beta 9.
| Giorno | Azione | |
| 1 | M | Mantenete la posizione per 2-3 minuti ~ |
| 2 | Tu | Mantenete la posizione per 2-3 minuti ~ |
| 3 | W | Hold e pet ~ 2-3 min |
| 4 | Th | Hold e pet ~ 2-3 min |
| 5 | F | Leggermente pizzico o scruff |
| 6 | M | Leggermente pizzico o scruff |
| 7 | Tu | Scruff e ascensore |
| 8 | W | Scruff e ascensore |
| 9 | Th | Grip intranasale |
| 10 | F | Grip intranasale |
| 11 | M </ Td> | Intranasale (IN) Grip e Inverti |
| 12 | Tu | Intranasale (IN) Grip e Inverti |
| 13 | W | A Grip, Inverti, posizionare puntale vicino naso |
| 14 | Th | A Grip, Inverti, posizionare puntale vicino naso |
| 15 | F | A Grip, Inverti, consegnare 1 round soluzione fisiologica per ogni Nare |
| 16 | M | A Grip, Inverti, consegnare 1 round soluzione fisiologica per ogni Nare |
| 17 | Tu | A Grip, Inverti, consegnare 2 turni soluzione fisiologica per ogni Nare |
| 18 | W | A Grip, Inverti, consegnare 2 turni soluzione fisiologica per ogni Nare |
Tabella 1. Programma di esempio per l'acclimatazione di Gestione per la somministrazione endonasale a Mouse Awake.
* La pipetta viene caricato una volta con 6 pl, ma somministrato al mouse come 2 x 3 gocce pl.
Tabella 2. Timeline di esempio per il dosaggio di uno o due topi.
Figura 1. Foto di diverse fasi e angoli di possesso di un mouse per sveglio la somministrazione intranasale del farmaco. 1A) Tenete il mouse con forza sulla parte superiore della gabbia con la mano dominante, lasciando le spalle esposte per afferrare la pelle. 1B) con il pollice e il dito mediodella mano non dominante per afferrare e tirare la pelle proprio dietro le scapole. 1C) Usare il dito indice per tirare la pelle indietro tra gli occhi verso il pollice e il dito medio (vista frontale). 1D) Come 1C (lato vista). 1E) Tenete il mouse a testa in giù con il dito anulare e / o mignolo per fissare la base della coda al palmo della mano. Il collo del mouse deve essere orizzontale. 1F) Come E, dall'altro lato. 1G) Somministrare farmaci con una pipetta 20 pl e il caricamento gel punta della pipetta. 1H) Uguale a 1G, vista ravvicinata.
Figura 2. Una foto di una stazione di dosaggio completo per 2 topi tenuti in ricoveri individuali. Sono comprese le due gabbie del mouse con una distanza sufficiente tra per tenere i topi a parte, una pipettator con punte, un contenitore di suggerimenti utilizzati, un timer, foglio di dosaggio, un post-trattamento di dosaggio (come semi di girasole o Cheerios), salviette igieniche, un (o P10) P20 pipetta, e il farmaco da consegnare.
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Discussion
Questo metodo mostra come topi possono essere somministrate dosi regolari di farmaci intranasale di indirizzare il cervello senza l'uso di anestesia. Farmaco intranasale può essere consegnato a grandi gruppi di topi per lunghi periodi di tempo con il minimo sforzo. Un singolo gruppo di 20 topi possono essere intranasale trattata da una sola persona in meno di un'ora. Una vasta gamma di molecole, che vanno da chelanti del ferro piccoli fattori di crescita per le cellule staminali mesenchimali, sono stati dimostrati per indirizzare rapidamente SNC e hanno dimostrato efficacia in modelli di roditori. Meccanismi proposti di consegna diretta dal naso al cervello comprendono il trasporto extracellulare lungo i nervi olfattivi e del trigemino e il flusso di massa all'interno degli spazi perivascolari 1,10. Somministrazione intranasale al SNC è una tecnica particolarmente utile perché non solo è rapida, ma si rivolge il SNC ridurre l'esposizione sistemica. Ad esempio, la somministrazione intranasale di deferoxamina per ratti hanno mostrato una 3-19 volte superiore concentrations nelle regioni cerebrali con 28 volte più basse concentrazioni nel sangue 11. In un altro esempio, l'insulina intranasale migliora la memoria nei malati di Alzheimer entro 15 minuti senza modificare i livelli plasmatici di insulina o di glucosio 12. Un ulteriore vantaggio è la non invasività della tecnica di somministrazione intranasale.
Ci sono diversi limiti di questo metodo. Primo, la somministrazione di farmaci è limitata a circa 20-30 microlitri in un'unica somministrazione, così solubilità del terapeutico avrà un ruolo nella determinazione dei limiti di dose. Inoltre, la formulazione del farmaco è importante come fattori come pH e salinità possono influenzare la consegna. Grandi deviazioni da condizioni naturali, come il pH estremo e salinità, possono danneggiare gli epiteli respiratorio e olfattivo di topi. 13,14 Inoltre, somministrazione endonasale di topi non anestetizzati può essere difficile da padroneggiare, e può richiedere diverse settimane di formazione per intranasali "dosatori "per poter Minimize "testa-wiggle room" e ottenere un ideale di somministrazione endonasale di droga. Con la tecnica di dosaggio errato, il farmaco può drenare nel polmone o dello stomaco, che può introdurre variabilità farmaco che raggiunge il cervello. Segni che questo si è verificato sono difficoltà respiratorie o di visualizzazione di liquido in bocca dopo la somministrazione. Se possibile, si consiglia di limitare nuovi intranasali "dosatori" a fornire soluzione salina / mezzo ai gruppi di controllo per diverse settimane o mesi prima della loro approvazione al farmaco dose di formatori esperti. Infine, questo metodo sveglio intranasale è limitato a topi, ratti come animali più grandi sveglio e non sono facilmente afferrata, e può essere troppo sottolineato quando tenuto capovolto.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Institutional Animal Care HealthPartners e utilizzo Comitato all'ospedale regioni.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P20 pipettor set at 6 μl | |||
| Gel loading pipette tips | |||
| Timer | |||
| Waste receptacle for tips | |||
| Dosing sheet for notes | |||
| Pen | |||
| Drug and vehicle | |||
| Container to hold drug vials | |||
| Animals to be dosed | |||
| Spare gloves | |||
| Paper towels to wipe urine | |||
| Table 3. Materials Needed | |||
References
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