Summary
वर्णित एक दो कदम लेबलिंग β glucosyltransferase (β-GT) प्रक्रिया का उपयोग कर 5-HMC एक azide ग्लूकोज हस्तांतरण, रसायन शास्त्र क्लिक द्वारा पीछा करने के लिए आसान और घनत्व स्वतंत्र संवर्धन के लिए एक बायोटिन linker हस्तांतरण. यह कुशल और विशिष्ट लेबलिंग विधि अत्यंत कम पृष्ठभूमि और उच्च throughput epigenomic मानचित्रण के साथ अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के माध्यम से 5 HMC के संवर्धन के लिए सक्षम बनाता है.
Protocol
1. जीनोमिक डीएनए विखंडन
Fragment जीनोमिक इच्छित आकार सीमा sonication का उपयोग डीएनए अनुक्रमण जीनोम चौड़ा मंच के लिए अनुकूल है. (हम आमतौर पर ~ 300 बीपी sonicate.) 1% agarose जेल (1 चित्रा) पर खंडित जीनोमिक डीएनए के आकार के वितरण को जांचें.
2. डीएनए तैयारी
शुरू डीएनए जीनोमिक डीएनए में 5 HMC की बहुतायत के आधार पर मात्रा का निर्धारण करते हैं. 5-HMC स्तर के बाद से विभिन्न प्रकार के ऊतकों में काफी भिन्नता है, शुरू डीएनए मात्रा में नमूनों की 5 HMC स्तर पर निर्भर करते हैं. उदाहरण के लिए 1 टेबल देखें.
3. β-GT उत्प्रेरित रिएक्शन (ग्लूकोज स्थानांतरण रिएक्शन)
- एक 37 ° सी 1 घंटे के लिए पानी में स्नान 2 टेबल और सेते में विस्तृत रूप मिश्रण pipetting द्वारा मिक्स.
- ऊष्मायन के बाद, QIAquick Nucleotide हटाने किट के साथ प्रतिक्रिया साफ, डीएनए की 10 ग्राम का उपयोग प्रतिस्तंभ. स्तंभ प्रति 30 μl पानी के साथ Elute और गठबंधन.
4. Biotinylation रिएक्शन (क्लिक करें रसायन विज्ञान)
- Eluted डीएनए 150 सुक्ष्ममापी की एक अंतिम एकाग्रता (यानी, 30 μl डीएनए समाधान प्रति समाधान काम करने के 5 μl) समाधान (3 कदम से) में DBCO एसएस PEG3 - बायोटिन संयुग्म काम समाधान (1 मिमी) जोड़ें.
- और 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी में स्नान pipetting सेते द्वारा मिक्स.
- साफ QIAquick Nucleotide हटाने किट के साथ प्रतिक्रिया. आदर्श कुल क्षालन मात्रा 100 μl है.
- यों बरामद डीएनए microliter पैमाने स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (जैसे, NanoDrop) का उपयोग कर राशि.
5. 5-HMC युक्त डीएनए का कब्जा
- 1X बी और निर्माता के निर्देशों के अनुसार डब्ल्यू बफर के 1 मिलीलीटर के साथ 50 Dynabeads MyOne streptavidin C1 μl 3 बार से धो लें. एक चुंबकीय स्टैंड के साथ मोती अलग करें.
- बरामद biotinylated डी 2X B & W बफर के बराबर मात्रा में जोड़ेंNA धोया मोतियों के लिए (100 उल).
- एक अंग को घुमानेवाली पेशी पर कोमल रोटेशन के साथ कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
- एक चुंबकीय स्टैंड के साथ मोती अलग और मोती 1X B & W बफर के 1 मिलीलीटर के साथ 3 बार धो लो.
- हौसले से तैयार एक अंग को घुमानेवाली पेशी पर कोमल रोटेशन के साथ कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए 50 मिमी डीटीटी के 100 μl में मोती incubating द्वारा डीएनए Elute.
- एक चुंबकीय स्टैंड के साथ मोती अलग करें. निर्माण के लिए डीटीटी हटाने अनुदेश के अनुसार और एक माइक्रो जैव स्पिन 6 स्तंभ पर eluent लोड Aspirate. डीएनए लक्ष्य समाधान में अब है.
- Qiagen MinElute पीसीआर शोधन और EB बफर के 10 μl में elute डीएनए किट द्वारा पिछले चरण से eluted डीएनए शुद्ध. डीएनए यों Qubit fluorometer, या NanoDrop का उपयोग अगर एकाग्रता 20 एनजी / उल की तुलना में अधिक है. डीएनए अनुप्रवाह अनुक्रमण जीनोम चौड़ा पुस्तकालय तैयारी के लिए तैयार है.
6. प्रतिनिधि परिणाम
यदि गुणवत्ता ओच जीनोमिक डीएनए उच्च है, β-GT और biotinylation प्रतिक्रियाओं के बाद ठेठ वसूली पैदावार ~ 60-70% है. हालांकि क्षमता पर कब्जा अलग ऊतक नमूनों की पाँच HMC के स्तर पर निर्भर करता है प्रकार के साथ काफी भिन्नता है. आमतौर पर, मस्तिष्क जीनोमिक डीएनए के लिए क्षमता पर कब्जा ~ 4-9% है, और कुछ गंभीर मामलों में, दक्षता, 12% तक पहुंच सकता है. ES कोशिकाओं के लिए, औसत क्षमता पर कब्जा ~ 2-4% ~ तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के लिए 0.5% के विपरीत है. अब तक सबसे कम देखा दक्षता कैंसर कोशिकाओं से जीनोमिक डीएनए के लिए था. सभी समृद्ध डीएनए मानक अगली पीढ़ी के पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल के लिए तैयार है. इसके अलावा, कब्जा कर लिया डीएनए भी इनपुट डीएनए की तुलना में कुछ टुकड़े के संवर्धन, पता लगाने के लिए अगर संबंधित प्राइमरों उपलब्ध हैं वास्तविक समय पीसीआर के लिए टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
चित्रा 1. Sonicated मानव जीनोमिक में डीएनए टुकड़े1% agarose जेल जीनोमिक 1X ते बफर के 120 μl में मानव आईपीएस कोशिकाओं से अलग डीएनए के 10 ग्राम एक sonication डिवाइस (Covaris) का उपयोग sonicated किया गया था. Sonication के बाद, sonicated डीएनए के 2 μl 1% agarose जेल पर लादा गया था 100 बीपी डीएनए मार्कर का उपयोग sonicated डीएनए टुकड़े के आकार की तुलना करने के लिए.
| घटक | खंड | अंतिम एकाग्रता |
| पानी | Μl _ | |
| 10 एक्स रिएक्शन β-GT बफर | 2 μl | 1 एक्स |
| 10 ग्राम जीनोमिक डीएनए | Μl _ | को 500 एनजी / μl |
| UDP-6-N 3 GLC (3 मिमी) | 0.67 μl | 100 सुक्ष्ममापी |
| β जी.टी. (40 सुक्ष्ममापी) | 1 μl | 2 सुक्ष्ममापी |
| कुल मात्रा | 20 μl |
ऊतक जीनोमिक (डीएनए उच्च 5-HMC कन्टेन्ट पर 0.1%> i))
| घटक | खंड | अंतिम एकाग्रता |
| पानी | Μl _ | |
| 10 एक्स रिएक्शन β-GT बफर | 10 μl | 1 एक्स |
| 20 ग्राम जीनोमिक डीएनए | Μl _ | को 500 एनजी / μl |
| UDP-6 N3 GLC (3 मिमी) | 1.33 μl | 100 सुक्ष्ममापी |
| β जी.टी. (40 सुक्ष्ममापी) | 2 μl | 2 सुक्ष्ममापी |
| कुल मात्रा | 40 μl |
ii) स्टेम सेल जीनोमिक डीएनए (5 HMC मंझला सामग्री ~ 0.05%)
| घटक | खंड | अंतिम एकाग्रता |
| पानी | Μl _ | |
| 10 एक्स रिएक्शन β-GT बफर | 10 μl | 1 एक्स |
| 50 ग्राम जीनोमिक डीएनए | Μl _ | को 500 एनजी / μl |
| UDP-6 N3 GLC (3 मिमी) | 3.33 μl | 100 सुक्ष्ममापी |
| β जी.टी. (40 सुक्ष्ममापी) | 5 μl | 2 सुक्ष्ममापी |
| कुल मात्रा | 100 μl |
iii) कैंसर सेल (जीनोमिक डीएनए कम सामग्री 5-HMC ~ 0.01%)
1 तालिका इनपुट डीएनए और लेबलिंग 5-HMC चयनात्मक लेबलिंग रासायनिक विधि द्वारा विभिन्न स्तरों के साथ नमूने प्रतिक्रियाओं का प्रयोग की मात्रा के उदाहरण.
| नमूना | 5 HMC स्तर | शुरू डीएनए (छ) | लेबलिंग के बाद वसूली (मोती के इनपुट) (छ) | रिकवरी उपज | पुल से नीचे डीएनए (एनजी) | पुल से नीचे उपज |
| वयस्क माउस सेरिबैलम | 0.4% | 10 | 7.5 | 75% | 236 | 3.1% |
| प्रसव के बाद दिन 7 माउस सेरिबैलम | 0.1% | 11 | 9 | 82% | 140 | 1.6% |
| माउस ES सेल E14 | 0,05% | 60 | 42 | 70% | 350 | 0.8% |
तालिका 2 माउस मस्तिष्क के ऊतकों और ES कोशिकाओं से प्रतिनिधि का परिणाम है.
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Discussion
5 hydroxymethylcytosine (5 HMC) एक हाल ही में पहचाना कुछ स्तनधारी प्रकार की कोशिकाओं में पर्याप्त मात्रा में मौजूद epigenetic संशोधन है. यहाँ प्रस्तुत विधि 5-HMC जीनोम चौड़ा वितरण का निर्धारण करने के लिए है. हम टी -4 जीवाणुभोजी β glucosyltransferase का उपयोग करने के लिए एक इंजीनियर ग्लूकोज 5-HMC हाइड्रॉक्सिल समूह पर एक azide समूह युक्त आधा भाग हस्तांतरण. azide समूह रासायनिक पता लगाने, आत्मीयता संवर्धन, 5-HMC युक्त स्तनधारी जीनोम में डीएनए टुकड़े और अनुक्रमण के लिए बायोटिन के साथ संशोधित किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल 5-HMC एंटीबॉडी आधारित hydroxymethylated डीएनए (hMeDIP SEQ) immunoprecipitation 13-15 से अधिक लाभ है, हालांकि hMeDIP सरल है, यह उच्च घनत्व 5-HMC क्षेत्रों की ओर एक मजबूत पूर्वाग्रह है और आमतौर पर स्वतंत्र पुल से असंगत परिणाम देता है चढ़ाव. हमारे विधि इस तरह के पूर्वाग्रह नहीं शुरू होगा.
वहाँ रहे हैं, तथापि, हमारे लेबलिंग के मामले में दो संभव चिंताओं और मुझे पर कब्जाthod. पहली चिंता लेबलिंग और कब्जा की विशिष्टता हो सकता है. चूंकि हाल ही में एक रिपोर्ट में संकेत दिया है कि 5 hydroxymethyluracil (5 HMU) भी β जी.टी. के एक सब्सट्रेट के रूप में सेवा कर सकते हैं, झूठी सकारात्मक संकेतों समृद्ध टुकड़े कि 16 5-HMC-संबद्धता nonspecific हैं अग्रणी शुरू की है, हो सकता है. यह चिंता निराधार है, हालांकि हो सकता है, के बाद से अत्यधिक सक्रिय 5-hydroxymethyluracil डीएनए glycosylases लगातार इस डीएनए की क्षति, स्तनधारी जीनोम 17,18 में अनिवार्य रूप से undetectable 5 HMU में जिसके परिणामस्वरूप हटा रहे हैं. दूसरी चिंता लेबलिंग की दक्षता और कब्जा है. 5-HMC स्तर के बाद से विभिन्न ऊतकों और कोशिकाओं में काफी भिन्नता है, मस्तिष्क के ऊतकों में 0.5% से एमईएस कोशिकाओं में कैंसर की कोशिकाओं में 0.05% और 0.01% से लेकर, यह जरूरी है कि हमारे तरीके बहाव के मामले में इन सभी ऊतकों को लागू हो लेबल और कब्जा कर लिया जीनोमिक डीएनए के अनुप्रयोगों. हमारे अनुभव से पता चलता है कि यहाँ वर्णित तरीकों वास्तव में संवेदनशील और विशिष्ट हैंपर्याप्त 5-HMC स्तर के ऊतकों के बीच या गहरे तक 19-21 जीनोम में 5-HMC वितरण नक्शा अनुक्रमण जैसे बहाव अनुप्रयोगों के लिए या तो मात्रा का ठहराव आधारित तुलना के प्रयोजन के लिए इन सभी ऊतकों का विश्लेषण.
हमारे विधि की कुंजी जीनोमिक डीएनए शुरू करने का एक उचित राशि का उपयोग है. यदि जीनोमिक डीएनए एकाग्रता बहुत कम है, लेबलिंग दक्षता और विशिष्टता के हिसाब से कम हो जाएगा. हमारे अनुभव के आधार पर, भले ही 5 HMC की बहुतायत के मस्तिष्क के ऊतकों से डीएनए में काफी अधिक है, अगर एकाग्रता 25 एनजी / 20 μl प्रतिक्रिया की, लेबलिंग और क्षमता पर कब्जा है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विशिष्टता में μl, की तुलना में कम है काफी कम हो जाएगी. कम बहुतायत डीएनए नमूने के लिए, एकाग्रता की आवश्यकता के अलावा, डीएनए की कुल राशि उच्च और विशिष्ट क्षमता पर कब्जा पाने के लिए आवश्यक है. इस प्रकार, हालांकि एक सेंट के लिए नीचे 5-HMC-समृद्ध डीएनए टुकड़े का केवल 25 एनजी की जरूरतandard पुस्तकालय पीढ़ी अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्लेटफार्मों द्वारा नियोजित प्रोटोकॉल, जीनोमिक डीएनए के मस्तिष्क के ऊतकों से शुरू राशि 2 ग्राम (और आदर्श प्रारंभिक राशि 5-10 ग्राम) से कम नहीं होना चाहिए. परीक्षण और त्रुटि के माध्यम से, हम चर 5-HMC abundances के साथ विभिन्न ऊतकों से जीनोमिक डीएनए के शुरू राशि के लिए अनुकूलित किया है उच्च लेबलिंग क्षमता और विशिष्टता प्राप्त है, के रूप में 2 तालिका में विस्तृत.
संक्षेप में, हमारे विधि ठीक 5 HMC जीनोमिक लेबल के लिए योग्य है और विशेष रूप से 5-HMC युक्त टुकड़े पर कब्जा, यह बहाव के अगली पीढ़ी के अनुक्रमण assays के लिए संवेदनशीलता और विशिष्टता के मामले में एक सफल प्रोटोकॉल बना.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस अध्ययन के हिस्से में स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (GM071440 से CH और NS051630/MH076090/MH078972 तक पी.जे. करने के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Promega | V4221 | |
| 0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | V4231 | |
| 1M Trizma base (Tris) pH7.5 | Invitrogen | 15567-027) | |
| HEPES 1M, pH7.4 | Invitrogen | 15630 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) 1M | Ambion | AM9530G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337-100 | |
| DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate | Click Chemistry Tools | A112P3 | |
| 1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure | Invitrogen | 15508-013 | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Micro Bio-Spin 6 Column | Bio-Rad | 732-6222 | |
| Dynabeads MyOne | Invitrogen | 650-01 | |
| Streptavidin C1 | |||
| Qiagen MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| UDP-6-N3-glucose | Active Motif | 55013 | |
| Enzyme | |||
| β-glucosyltransferase (β-GT) | New England Biolab | M0357 | |
| Equipment | |||
| Sonication device | Covaris | ||
| Desktop centrifuge | |||
| Water bath | Fisher Scientific | ||
| Gel running apparatus | Bio-Rad | ||
| NanoDrop1000 | Thermo Scientific | ||
| Labquake Tube Shaker | Barnstead | ||
| Labquake Tube Shaker | Thermolyne | ||
| Magnetic Separation Stand | Promega | Z5342 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20). | |||
References
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