Summary
ووصف هو عملية وضع العلامات على مرحلتين باستخدام β-ناقلة الغلوكوزيل (β-GT) لنقل أزيد من الغلوكوز لمؤسسة حمد الطبية-5، تليها الكيمياء اضغط هنا لرابط نقل البيوتين لتخصيب سهلة وكثافة مستقلة. هذه الطريقة فعالة ووضع العلامات المحددة تمكن من مؤسسة حمد الطبية تخصيب-5 مع خلفية منخفضة للغاية وعالية الإنتاجية عن طريق رسم الخرائط epigenomic الجيل القادم التسلسل.
Abstract
5-ميثيل سيتوزين (5-MC) ~ يشكل 2-8٪ من إجمالي cytosines في الحمض النووي الجيني الإنسان ويؤثر على مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية، بما في ذلك التعبير الجيني، وصيانة سلامة الجينوم، يطبع الوالدين، تعطيل كروموسوم X-، وتنظيم التنمية، والشيخوخة، والسرطان 1. مؤخرا، تم اكتشاف وجود MC-5 أكسدة، 5-hydroxymethylcytosine (5-مؤسسة حمد الطبية)، في خلايا الثدييات، وخاصة في الخلايا الجنينية (ES) والخلايا العصبية الجذعية 2-4. يتم إنشاء مؤسسة حمد الطبية من قبل 5-5-أكسدة MC يحفزه TET الأسرة الحديد (II) / α-كيتوغلوتارات التي تعتمد على dioxygenases 2، 3. ويقترح 5-مؤسسة حمد الطبية للمشاركة في الحفاظ على الخلايا الجنينية (MES) الجذعية، تكون الدم العادي والأورام الخبيثة، واقحة التنمية 2، 5-10. من أجل فهم أفضل وظيفة مؤسسة حمد الطبية-5، وهو نظام التسلسل موثوق بها ومباشرة أمر ضروري. يمكن التسلسل بيسلفيت التقليدية لا يميز مؤسسة حمد الطبية 5-5-MC من 11 12.
نحن هنا وصف بسيط من خطوتين الداخلي لوضع العلامات الكيميائية الانتقائي لمؤسسة حمد الطبية-5. في خطوة وضع العلامات الأولى، هو المسمى في مؤسسة حمد الطبية 5-DNA الجيني مع حفز-6-أزيد من الجلوكوز GT-β، وهو من ناقلة الغلوكوزيل عاثية T4، في الطريقة التي ينقل 6 أزيد-الجلوكوز لمؤسسة حمد الطبية-5 من معدلة العامل المساعد، UDP-6-N3-GLC (6-N3UDPG). في biotinylation الثانية، الخطوة، تم إرفاق رابط ثاني كبريتيد البيوتين إلى مجموعة من الكيمياء أزيد فوق. كل الخطوات هي محددة للغاية وفعالة، مما يؤدي إلى استكمال وضع العلامات بغض النظر عن وفرة من مؤسسة حمد الطبية في المناطق-5 الجينومية وإعطاء خلفية منخفضة للغاية. بعد biotinylation من مؤسسة حمد الطبية-5، ثم يتم شظايا الحمض النووي 5-مؤسسة حمد الطبية المحتوية على انتقائي القبضباستخدام الخرز streptavidin بطريقة الكثافة مستقلة. يمكن استخدام الناتج مؤسسة حمد الطبية 5-التخصيب شظايا الحمض النووي لتحاليل المصب، بما في ذلك الجيل القادم التسلسل.
وضع العلامات لدينا انتقائية وبروتوكول القبض يضفي حساسية عالية، تنطبق على أي مصدر من الحمض النووي الجيني مع الكميات المتوفرة من مؤسسة حمد الطبية 5-متغير / متنوعة. على الرغم من أن الغرض الرئيسي من هذا البروتوكول هو تطبيقه المصب (أي.، الجيل التالي من التسلسل لرسم توزيع 5-مؤسسة حمد الطبية في الجينوم)، وهو متوافق مع جزيء واحد، في الوقت الحقيقي SMRT (DNA) التسلسل، وهو قادرة على تقديم واحدة من قاعدة التسلسل قرار مؤسسة حمد الطبية-5.
Protocol
1. الجينومية DNA تجزئة
جزء الحمض النووي الجيني باستخدام صوتنة إلى مجموعة مناسبة الحجم المطلوب لمنصة تسلسل الجينوم على نطاق. (ونحن عادة يصوتن لشركة بريتيش بتروليوم 300 ~.) تحقق من حجم توزيع الحمض النووي الجيني مجزأة على 1٪ الاغاروز هلام (الشكل 1).
2. إعداد DNA
تحديد المبالغ بدءا DNA يعتمد على وفرة من مؤسسة حمد الطبية-5 في الحمض النووي الجيني. منذ 5-مؤسسة حمد الطبية مستويات تتفاوت تفاوتا كبيرا في أنواع الأنسجة المختلفة، بدءا كميات DNA تعتمد على مستويات 5-مؤسسة حمد الطبية من العينات. يرجى الرجوع إلى الجدول رقم 1 للحصول على أمثلة.
3. β-GT حفز رد الفعل (الجلوكوز نقل رد فعل)
- مزيج من pipetting الخليط على النحو المفصل في الجدول 2 واحتضان في حمام مائي 37 ° C لمدة 1 ساعة.
- بعد الحضانة، وتنظيف التفاعل مع كيت QIAquick إزالة النكليوتيد، وذلك باستخدام 10 ميكروغرام من الحمض النووي فيالعمود. أزل مع 30 ميكرولتر المياه في عمود والجمع.
4. رد الفعل Biotinylation (انقر الكيمياء)
- إضافة DBCO-SS-PEG3-البيوتين حل المتقارن العمل (1 ملم) في الحل DNA مزال (من الخطوة 3) إلى تركيز النهائي من 150 ميكرومتر (أي، 5 ميكرولتر من حل العمل بنسبة 30 ميكرولتر حل DNA).
- مزيج من pipetting واحتضان في حمام مائي 37 ° C لمدة 2 ساعة.
- تنظيف التفاعل مع كيت QIAquick إزالة النوكليوتيدات. المثل الأعلى هو مجموع حجم شطف 100 ميكرولتر.
- قياس كمية الحمض النووي استرداد باستخدام مقياس الطيف ميكروليتر (على سبيل المثال، NanoDrop).
5. القبض على 5-DNA التي تحتوي على مؤسسة حمد الطبية
- يغسل 50 ميكرولتر من Streptavidin Dynabeads C1 MyOne 3 مرات مع 1 مل من 1X B & W العازلة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. فصل حبات مع موقف المغناطيسي.
- إضافة حجم مساو من 2X B & W عازلة لD والمعقدة البيروكسيديز تعافىNA (100 UL) إلى الخرز غسلها.
- احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لطيف مع التناوب على محور دوار.
- فصل حبات مع موقف المغناطيسي وغسل حبات 3 مرات مع 1 مل من 1X B & W العازلة.
- أزل الحمض النووي عن طريق احتضان حبات في 100 ميكرولتر من DTT الطازجة 50 مم لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة لطيف مع التناوب على محور دوار.
- فصل حبات مع موقف المغناطيسي. نضح في وشاطف تحميل على عمود 6 مايكرو الحيوية سبين وفقا لتعليمات تصنيع لإزالة DTT. والهدف هو DNA في حل الآن.
- تنقية DNA مزال من الخطوة السابقة من MinElute QIAGEN كيت تنقية DNA PCR وأزل في 10 ميكرولتر من العازلة EB. تحديد DNA باستخدام مقياس التألق و qubit، أو إذا NanoDrop تركيز أعلى من 20 نانوغرام / أيار. الحمض النووي جاهز للالمصب تسلسل الجينوم على نطاق إعداد المكتبة.
6. ممثل النتائج
إذا يا جودةو الحمض النووي الجيني عالية، والمحاصيل الانتعاش بعد نموذجية GT-β وردود الفعل هي biotinylation ~ 60-70٪. ومع ذلك، فإن كفاءة التقاط تتفاوت تفاوتا كبيرا مع أنواع الأنسجة المختلفة اعتمادا على مستويات 5-مؤسسة حمد الطبية من العينات. عادة، وكفاءة لالتقاط الحمض النووي الجيني الدماغ ~ 4-9٪، وفي بعض الحالات القصوى، وكفاءة قد تصل إلى 12٪. لخلايا ES، وكفاءة التقاط متوسط ~ 2-4٪، وعلى النقيض من 0.5٪ ~ للخلايا الجذعية العصبية. أقل كفاءة رأيناه حتى الآن كان لمن الحمض النووي الجيني الخلايا السرطانية. جميع DNA المخصب جاهز للمعيار الجيل المقبل من إعداد بروتوكولات المكتبة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن القبض على DNA أن تستخدم قالب في الوقت الحقيقي PCR للكشف عن تخصيب بعض شظايا مقارنة الحمض النووي المدخلات، وإذا كان الاشعال ذات الصلة المتاحة.
الشكل 1. Sonicated الحمض النووي الجيني الإنسان شظايا فيوsonicated 1٪ الاغاروز هلام. 10 ميكروغرام من الحمض النووي الجيني معزولة عن خلايا الجذع الإنسان في 120 ميكرولتر من 1X العازلة TE باستخدام جهاز صوتنة (Covaris). بعد صوتنة، تم تحميل 2 ميكرولتر من الحمض النووي على جل الاغاروز sonicated 1٪ باستخدام 100 علامة بي بي DNA لمقارنة أحجام شظايا الحمض النووي sonicated.
| عنصر | حجم | تركيز النهائي |
| ماء | ميكرولتر _ | |
| 10 X العازلة رد فعل β-GT | 2 ميكرولتر | 1 X |
| تصل إلى 10 ميكروغرام الحمض النووي الجيني | ميكرولتر _ | ما يصل إلى 500 نانوغرام / ميكرولتر |
| UDP-6-3-N GLC (3 ملم) | 0،67 ميكروليتر | 100 ميكرومتر |
| β-GT (40 ميكرومتر) | 1 ميكرولتر | 2 ميكرومتر |
| اجمالى حجم التداول | 20 ميكرولتر |
ط) للأنسجة الحمض النووي الجيني (الأعلى 5-مؤسسة حمد الطبية المحتوى> 0.1٪)
| عنصر | حجم | تركيز النهائي |
| ماء | ميكرولتر _ | |
| 10 X العازلة رد فعل β-GT | 10 ميكرولتر | 1 X |
| ما يصل الى 20 ميكروغرام الحمض النووي الجيني | ميكرولتر _ | ما يصل إلى 500 نانوغرام / ميكرولتر |
| UDP-6-N3-GLC (3 ملم) | 1،33 ميكروليتر | 100 ميكرومتر |
| β-GT (40 ميكرومتر) | 2 ميكرولتر | 2 ميكرومتر |
| اجمالى حجم التداول | 40 ميكرولتر |
الثاني) للحصول على الخلايا الجذعية الجينية DNA (متوسط 5-مؤسسة حمد الطبية محتوى ~ 0.05٪)
| عنصر | حجم | تركيز النهائي |
| ماء | ميكرولتر _ | |
| 10 X العازلة رد فعل β-GT | 10 ميكرولتر | 1 X |
| تصل إلى 50 ميكروغرام الحمض النووي الجيني | ميكرولتر _ | ما يصل إلى 500 نانوغرام / ميكرولتر |
| UDP-6-N3-GLC (3 ملم) | 3،33 ميكروليتر | 100 ميكرومتر |
| β-GT (40 ميكرومتر) | 5 ميكرولتر | 2 ميكرومتر |
| اجمالى حجم التداول | 100 ميكرولتر |
ثالثا) بالنسبة لسرطان الخلية الحمض النووي الجيني (الأقل 5-مؤسسة حمد الطبية محتوى ~ 0.01٪)
الجدول 1. أمثلة على كميات من المدخلات وردود الفعل DNA وضع العلامات باستخدام عينات مع مستويات مختلفة 5-مؤسسة حمد الطبية من خلال طريقة وضع العلامات الكيميائية انتقائية.
| عينة | 5-مستوى مؤسسة حمد الطبية | بدءا DNA (ميكروغرام) | الانتعاش بعد وضع العلامات (المدخلات إلى الخرز) (ميكروغرام) | الانتعاش العائد | المنسدلة DNA (NG) | المنسدلة تسفر |
| الكبار الماوس المخيخ | 0.4٪ | 10 | 7.5 | 75٪ | 236 | 3.1٪ |
| بعد الولادة المخيخ يوم 7 الماوس | 0.1٪ | 11 | 9 | 82٪ | 140 | 1.6٪ |
| ES الماوس الخلية E14 | 0.05٪ | 60 | 42 | 70٪ | 350 | 0.8٪ |
الجدول 2. نتائج ممثلة من أنسجة وخلايا مخ الفأر ES.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
5-hydroxymethylcytosine (5-مؤسسة حمد الطبية) هي التي تم تحديدها مؤخرا الحاضر التعديل جينية في كميات كبيرة في بعض أنواع خلايا الثدييات. طريقة المقدمة هنا هو لتحديد توزيع الجينوم على نطاق مؤسسة حمد الطبية-5. نستخدم عاثية T4-β ناقلة الغلوكوزيل لنقل الجلوكوز إلى شاردة الهندسة يحتوي على مجموعة أزيد على مجموعة الهيدروكسيل من مؤسسة حمد الطبية-5. يمكن أن يكون فريق أزيد معدل كيميائيا مع البيوتين للكشف، والإثراء تقارب، وتسلسل الحمض النووي شظايا 5-مؤسسة حمد الطبية التي تحتوي على الجينوم في الثدييات. هذا البروتوكول له ميزات أكثر من 5-مؤسسة حمد الطبية الأجسام المضادة على أساس مناعي DNA hydroxymethylated (hMeDIP-يليها) 13-15، على الرغم من أن hMeDIP بسيط، لديه ميل قوي نحو الكثافة العالية مؤسسة حمد الطبية 5-المناطق وعادة يعطي نتائج غير متناسقة من سحب مستقلة هبوطا. وليس لدينا طريقة إدخال التحيز.
هناك، ومع ذلك، شاغلين ممكن من حيث وضع العلامات لدينا والتقاط البياناتثود. يمكن أن يكون الشاغل الأول لخصوصية وضع العلامات والالتقاط. منذ تقرير صدر مؤخرا إلى أن 5-hydroxymethyluracil (5-hmU) يمكن أيضا أن تكون بمثابة ركيزة من GT-β، قد قدم إشارات إيجابية كاذبة، مما يؤدي إلى شظايا اليورانيوم التي هي غير محددة ل5-HMC-الصلة 16. قد يكون هذا القلق لا أساس لها، على الرغم من نشطة للغاية منذ 5-DNA-hydroxymethyluracil glycosylases تقوم بإزالة باستمرار هذا الحمض النووي من التلف، مما أدى إلى اكتشافها أساسا hmU-5 في الجينوم الثدييات 17،18. القلق الثاني هو وضع العلامات كفاءة والتقاط. منذ 5-مؤسسة حمد الطبية مستويات تتفاوت تفاوتا كبيرا في الأنسجة والخلايا المختلفة، بدءا من 0.5٪ في أنسجة الدماغ على 0.05٪ في الخلايا زارة التربية والعلم و0.01٪ في خلايا السرطان، فإنه من الضروري أن طرقنا أن تنطبق على جميع هذه الأنسجة من حيث المصب تطبيقات الحمض النووي للجينوم وصفت والقبض عليه. تجربتنا تبين أن الأساليب المذكورة هنا هي في الواقع الحساسة والمحددةبما يكفي لتحليل جميع هذه الأنسجة لغرض المقارنة إما على أساس القياس الكمي من مؤسسة حمد الطبية 5-المستويات بين الأنسجة أو للتطبيقات المصب، مثل التسلسل العميق لرسم خريطة للتوزيع مؤسسة حمد الطبية-5 في الجينوم 19-21.
المفتاح لدينا وسيلة هو استخدام مبلغ مناسب من بدء DNA الجيني. إذا كان تركيز الحمض النووي الجيني منخفض جدا، ووضع العلامات كفاءة ونوعية خفض فقا لذلك. استنادا إلى تجربتنا، على الرغم من وفرة مؤسسة حمد الطبية-5 مرتفع بما يكفي في الحمض النووي من أنسجة المخ، إذا كان تركيز أقل من 25 نانوغرام / ميكرولتر في 20 ميكرولتر من رد فعل، ووضع العلامات والكفاءة القبض، فضلا عن خصوصية و، وسيتم خفض بشكل ملحوظ. لعينات من الحمض النووي منخفضة وفرة، بالإضافة إلى شرط التركيز، والمبلغ الإجمالي للDNA أمر ضروري للحصول على ارتفاع كفاءة والتقاط محددة. وهكذا، على الرغم من أن يحتاج المرء سوى 25 نانوغرام من الحمض النووي شظايا مؤسسة حمد الطبية 5-التخصيب لسانت المصبandard البروتوكولات التي تستخدمها مكتبة الجيل منصات الجيل القادم التسلسل، ينبغي أن يبدأ من كمية الحمض النووي الجيني من أنسجة المخ لا يكون أقل من 2 ميكروجرام (والمبلغ هو انطلاق مثالية ميكروغرام 5-10). من خلال التجربة والخطأ، ونحن الأمثل المبلغ ابتداء من الحمض النووي الجيني من الأنسجة المختلفة مع الكميات المتوفرة من مؤسسة حمد الطبية 5-المتغير للحصول على كفاءة عالية وخصوصية وضع العلامات، كما هو مفصل في الجدول 2.
وباختصار، هو مؤهل لدينا طريقة لتسمية بدقة 5-الجينومية مؤسسة حمد الطبية وتحديدا التقاط شظايا 5-مؤسسة حمد الطبية المحتوية على، مما يجعل من بروتوكول ناجحة من حيث الحساسية والنوعية لفحوصات المصب التسلسل من الجيل التالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة في جزء من المعاهد الوطنية للصحة (CH GM071440 لوNS051630/MH076090/MH078972 إلى PJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Promega | V4221 | |
| 0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | V4231 | |
| 1M Trizma base (Tris) pH7.5 | Invitrogen | 15567-027) | |
| HEPES 1M, pH7.4 | Invitrogen | 15630 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) 1M | Ambion | AM9530G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337-100 | |
| DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate | Click Chemistry Tools | A112P3 | |
| 1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure | Invitrogen | 15508-013 | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Micro Bio-Spin 6 Column | Bio-Rad | 732-6222 | |
| Dynabeads MyOne | Invitrogen | 650-01 | |
| Streptavidin C1 | |||
| Qiagen MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| UDP-6-N3-glucose | Active Motif | 55013 | |
| Enzyme | |||
| β-glucosyltransferase (β-GT) | New England Biolab | M0357 | |
| Equipment | |||
| Sonication device | Covaris | ||
| Desktop centrifuge | |||
| Water bath | Fisher Scientific | ||
| Gel running apparatus | Bio-Rad | ||
| NanoDrop1000 | Thermo Scientific | ||
| Labquake Tube Shaker | Barnstead | ||
| Labquake Tube Shaker | Thermolyne | ||
| Magnetic Separation Stand | Promega | Z5342 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20). | |||
References
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. , Suppl 33. 245-254 (2003).
- Ito, S. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466, 1129-1133 (2010).
- Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
- Ko, M. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
- Koh, K. P. Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).
- Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).
- Wossidlo, M. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nat. Commun. 2, 241 (2011).
- Gu, T. P. The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes. Nature. 477, 606-610 (2011).
- Dawlaty, M. M. Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development. Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).
- Huang, Y. The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing. PLoS One. 5, e8888 (2010).
- Song, C. X. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).
- Pastor, W. A. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473, 394-397 (2011).
- Matarese, F., Pau, C. arrillo-deS. anta, E,, Stunnenberg, H. G. 5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block. Mol. Syst. Biol. 7, 562 (2011).
- Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, 181 (2010).
- Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. Biochemical characterization of recombinant β-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes. Biochemistry. , (2012).
- Rusmintratip, V., Sowers, L. C. An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).
- Globisch, D. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367 (2010).
- Yildirim, O. Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells. Cell. 147, 1498-1510 (2011).
- Szulwach, K. E. Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells. PLoS Genet. 7, e1002154 (2011).
- Szulwach, K. E. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).
