Summary
Beskrives en totrins-mærkning ved anvendelse β-glucosyltransferase (β-GT) for at overføre et azid-glucose til 5-HMC, efterfulgt af klik kemi til at overføre en biotin linker til nem og densitet-uafhængig berigelse. Denne effektive og specifikke mærkning metode gør det muligt berigelse af 5-HMC med ekstremt lav baggrund og højkapacitetsidentifikation epigenomic kortlægning via næste generation sekventering.
Abstract
5-methylcytosin (5-Mc) udgør ~ 2-8% af de samlede cytosiner i human genomisk DNA og påvirker en lang række biologiske funktioner, herunder genekspression, vedligeholdelse af genom integritet, parentale prægning, X-kromosom inaktivering, regulering af udvikling, aldring og kræft 1. For nylig blev tilstedeværelsen af en oxideret 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC), fundet i mammale celler, især i embryostamceller (ES) celler og neuronale celler 2-4. 5-HMC genereres ved oxidationen af 5-mC katalyseret af TET familien jern (II) / α-ketoglutarat-afhængig dioxygenases 2, 3. 5-HMC foreslås at være involveret i vedligeholdelse af embryonale stamceller (MES) celle, normal hæmatopoiese og maligniteter, og zygote udvikling 2, 5-10. For bedre at forstå funktionen af 5-HMC, en pålidelig og enkel sekventering er afgørende. Traditionel bisulfit sekventering kan ikke skelne 5-HMC fra 5-MC 11 12.
Her beskriver vi en simpel totrinsprocedure til selektiv kemisk mærkning af 5-HMC. I det første mærkning trin 5-HMC i genomisk DNA mærket med en 6-azid-glucose katalyseret af β-GT, en glucosyltransferase fra T4-bakteriofag på en måde, som overfører 6-azid-glucose til 5-HMC fra modificeret cofaktor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). I det andet trin, biotinylering, er en disulfid biotin-linker bundet til azidgruppen af klik kemi. Begge trin er særdeles specifikke og effektive, hvilket fører til fuldstændig mærkning uanset forekomsten af 5-HMC i genomiske regioner og give yderst lav baggrund. Efter biotinylering af 5-HMC, de 5-HMC-holdige DNA-fragmenter derefter selektivt fangetved hjælp af streptavidin-perler i en densitet-uafhængig måde. De resulterende 5-HMC-berigede DNA-fragmenter kan anvendes til efterfølgende analyser, herunder næste generation sekventering.
Vores selektiv mærkning og capture-protokol giver høj følsomhed, der gælder for enhver kilde til genomisk DNA med variable / diverse 5-HMC overflod. Selvom hovedformålet med denne protokol er dens downstream anvendelse (dvs.., Næste generation sekventering at kortlægge 5-HMC distribution i genomet), det er foreneligt med enkelt-molekyle, real-time SMRT (DNA) sekventering, der er kan levere single-base opløsning sekventering af 5-HMC.
Protocol
1. Genomisk DNA Fragmentation
Fragment genomisk DNA ved anvendelse af lydbehandling til et ønsket størrelsesområde egnet til genomet hele sekventering platform. (Vi normalt lydbehandling for at ~ 300 bp.) Kontroller størrelsesfordelingen af den fragmenterede genomiske DNA på 1% agarosegel (figur 1).
2. DNA-forberedelse
Bestemme de udgangsmaterialer DNA beløb baseret på forekomsten af 5-HMC i genomisk DNA. Siden 5-HMC niveauer varierer betydeligt i de forskellige vævstyper, startende DNA beløbene afhænger af 5-HMC niveauer af prøverne. Der henvises til tabel 1 for eksempler.
3. β-GT katalyserede reaktion (glucose Transferreaktion)
- Blandes ved pipettering af blandingen som beskrevet i tabel 2 og inkuber i et 37 ° C vandbad i 1 time.
- Efter inkubation rense reaktionen med QIAquick Nucleotide Removal Kit, ved anvendelse af 10 ug DNA prkolonne. Eluering med 30 ul vand pr kolonne og kombinere.
4. Biotinylering Reaktion (klik kemi)
- Tilføj DBCO-SS-PEG3-biotinkonjugat arbejdsopløsning (1 mM) i den eluerede DNA-opløsning (fra trin 3) til en slutkoncentration på 150 uM (dvs. 5 ul af arbejdsopløsning pr 30 pi DNA-opløsning).
- Der blandes ved pipettering og inkuberes i et 37 ° C vandbad i 2 timer.
- Ryd op reaktionen med QIAquick Nucleotide Removal Kit. Den ideelle samlede elueringsvolumen 100 ul.
- Kvantificere den genvundne DNA beløb hjælp mikroliter skala spektrofotometer (f.eks., NanoDrop).
5. Opsamling af 5-HMC-holdigt DNA
- Vask 50 pi Dynabeads MyOne Streptavidin C1 3 gange med 1 ml 1X B & W buffer i overensstemmelse med producentens anvisninger. Adskille perlerne med en magnetisk stativ.
- Tilsættes lige så stort volumen 2X B & W buffer til det genvundne biotinylerede DNA (100 ul) til de vaskede perler.
- Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur under forsigtig rotation på en rotator.
- Adskille perlerne med en magnetisk stativ og vaske perlerne 3 gange med 1 ml 1X B & W buffer.
- Eluering af DNA ved inkubering af perlerne i 100 gl frisk fremstillet 50 mM DTT i 2 timer ved stuetemperatur under forsigtig rotation på en rotator.
- Adskille perlerne med en magnetisk stativ. Aspirer eluent og belastningen på et Micro Bio-Spin 6 Column ifølge fremstilling instruktion om at fjerne DTT. Mål-DNA'et er i opløsningen nu.
- Oprense eluerede DNA fra det foregående trin af Qiagen MinElute PCR Purification Kit, og der elueres DNA i 10 pi EB buffer. Kvantificere DNA under anvendelse qubit Fluorometer eller NanoDrop når koncentrationen er højere end 20 ng / ul. DNA'et er klar til nedstrøms genomet hele sekventering bibliotek præparat.
6. Repræsentative resultater
Hvis kvaliteten of genomiske DNA er høj, typisk udvindingsudbytter efter β-GT og biotinyleringsbetingelserne reaktioner er ~ 60-70%. Imidlertid indfangningseffektiviteten variere betydeligt med forskellige vævstyper afhængigt af de 5-HMC niveauer af prøverne. Typisk indfangningseffektiviteten for hjernen genomisk DNA er ~ 4-9%, og i nogle ekstreme tilfælde kan effektiviteten på op til 12%. For ES-celler, er den gennemsnitlige indfangningseffektivitet ~ 2-4%, i modsætning til -0,5% for neurale stamceller. Den laveste set effektivitet indtil nu var for genomisk DNA fra cancerceller. Alle beriget DNA er klar til standard næste generation bibliotek forberedelse protokoller. Desuden kan det indfangede DNA også anvendt som template til realtids-PCR til påvisning af berigelse af nogle fragmenter i forhold til input-DNA, hvis de tilhørende primere er tilgængelige.
Figur 1. Sonikerede humane genomiske DNA-fragmenter i1% agarosegel. 10 ug af genomisk DNA isoleret fra humane iPS celler i 120 ul 1X TE-puffer blev sonikeret under anvendelse af en sonication enhed (Covaris). Efter lydbehandling blev 2 pi af den sonikerede DNA fyldt på 1% agarosegel under anvendelse af 100 bp DNA-markør for at sammenligne størrelserne af de sonikerede DNA-fragmenter.
| Component | Volumen | Slutkoncentration |
| Vand | _ Pi | |
| 10 X β-GT Reaction Buffer | 2 ul | 1 X |
| Op til 10 ug genomisk DNA | _ Pi | Op til 500 ng / ul |
| UDP-6-N 3-Glc (3 mM) | 0,67 gl | 100 uM |
| β-GT (40 uM) | 1 pi | 2 uM |
| Totalvolumen | 20 pi |
i) For væv genomisk DNA (høj 5-HMC indhold> 0,1%)
| Component | Volumen | Slutkoncentration |
| Vand | _ Pi | |
| 10 X β-GT Reaction Buffer | 10 ul | 1 X |
| Op til 20 ug genomisk DNA | _ Pi | Op til 500 ng / ul |
| UDP-6-N3-Glc (3 mM) | 1,33 gl | 100 uM |
| β-GT (40 uM) | 2 ul | 2 uM |
| Totalvolumen | 40 ul |
ii) For stamcelle genomisk DNA (median 5-HMC indhold ~ 0,05%)
| Component | Volumen | Slutkoncentration |
| Vand | _ Pi | |
| 10 X β-GT Reaction Buffer | 10 ul | 1 X |
| Op til 50 ug genomisk DNA | _ Pi | Op til 500 ng / ul |
| UDP-6-N3-Glc (3 mM) | 3,33 gl | 100 uM |
| β-GT (40 uM) | 5 pi | 2 uM |
| Totalvolumen | 100 pi |
iii) For cancercelle genomisk DNA (lav 5-HMC indhold ~ 0,01%)
Tabel 1. Eksempler på mængder af input DNA og mærkning reaktioner ved hjælp af prøverne med forskellige 5-HMC niveauer ved den selektive kemiske mærkning metode.
| Prøve | 5-HMC-niveau | Udgangs-DNA (ug) | Recovery efter mærkning (input til perler) (ug) | Udvindingsudbytte | Pull-down DNA (ng) | Pull-down give |
| Voksen mus cerebellum | 0,4% | 10 | 7,5 | 75% | 236 | 3,1% |
| Postnatal dag 7 mus cerebellum | 0,1% | 11 | 9 | 82% | 140 | 1,6% |
| Muse ES-celle E14 | 0,05% | 60 | 42 | 70% | 350 | 0,8% |
Tabel 2. Repræsentative resultater fra muse-hjernevæv og ES-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) er en nylig identificeret epigenetisk modifikation til stede i væsentlige mængder i visse mammale celletyper. Metoden, der præsenteres her, er til bestemmelse af genom-dækkende udbredelse af 5-HMC. Vi anvender T4 bakteriofag β-glucosyltransferase at overføre en manipuleret glucosedel indeholder en azidgruppe på hydroxylgruppen i 5-HMC. Af azidgruppen kan modificeres kemisk med biotin til påvisning, affinitetsberigelse, og sekventering af 5-HMC-holdige DNA-fragmenter i mammale genomer. Denne protokol har fordele i forhold 5-HMC antistofbaseret hydroxymethyleret DNA immunpræcipitering (hMeDIP-Seq) 13-15, selv om hMeDIP er enkel, det har en stærk bias i retning af high-density 5-HMC regioner og normalt giver afvigende resultater fra uafhængig pull -downs. Vores metode vil ikke indføre en sådan bias.
Der er dog to mulige problemer med hensyn til vores mærkning og fange migThOD. Den første bekymring kunne være specificitet mærkning og opsamling. Da en nylig rapport angivet, at 5-hydroxymethyluracil (5-HMU) også kan tjene som et substrat for β-GT, kan falsk-positive signaler indføres, hvilket fører til berigede fragmenter, som er ikke-specifik for 5-HMC-beslægtethed 16. Denne bekymring kan være ubegrundet, selv om, da meget aktive 5-hydroxymethyluracil-DNA glycosylaser konstant fjerne denne DNA-skader, hvilket resulterer i væsentlige målbart 5-HMU i pattedyrs genom 17,18. Den anden bekymring er effektiviteten af mærkning og opsamling. Da 5-HMC-niveauer varierer betydeligt i forskellige væv og celler, der spænder fra 0,5% i hjernevæv til 0,05% i MES-celler og 0,01% i cancerceller, er det vigtigt, at vore metoder finde anvendelse på alle disse væv med hensyn til den nedstrøms anvendelser af mærket og fanget genomisk DNA. Vores erfaring viser, at de her beskrevne metoder er faktisk følsom og specifiknok til at analysere alle disse væv med henblik på enten kvantificering-baseret sammenligning af 5-HMC niveauer blandt de væv eller til efterfølgende anvendelser, såsom dyb sekventering at kortlægge fordelingen af 5-HMC i genomet 19-21.
Nøglen til vores metode er anvendelsen af en passende mængde udgangsmateriale genomisk DNA. Hvis det genomiske DNA koncentrationen er for lav, vil mærkning effektivitet og specificitet falde tilsvarende. Baseret på vores erfaring, selv om forekomsten af 5-HMC er høj nok i DNA fra hjernevæv, hvis koncentrationen er mindre end 25 ng / pi i 20 ul reaktion, mærkning og separation effektivitet, såvel som specificiteten, vil blive væsentligt reduceret. Ved lav tæthed DNA-prøver, ud over fusionen kravet den totale mængde af DNA er nødvendigt for at få høj og specifik indfangning effektivitet. Selv behøver man blot 25 ng af 5-HMC-berigede DNA-fragmenter til den nedstrøms standard bibliotek generation protokoller ansat af næste generation sekventering platforme, bør startbeløbet af genomisk DNA fra hjernevæv ikke være mindre end 2 ug (og den ideelle grundbeløb er 5-10 ug). Gennem trial and error, har vi optimeret grundbeløbet af genomisk DNA fra forskellige væv med variable 5-HMC mængderne for at få høj mærkning effektivitet og specificitet, som beskrevet i tabel 2.
Kort sagt er vores metode kvalificeret til netop mærke genomisk 5-HMC og specifikt fange 5-HMC-holdige fragmenter, hvilket gør det en succesfuld protokol i form af følsomhed og specificitet for downstream næste generation sekventering assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet delvist af National Institutes of Health (GM071440 til CH og NS051630/MH076090/MH078972 til PJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Promega | V4221 | |
| 0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | V4231 | |
| 1M Trizma base (Tris) pH7.5 | Invitrogen | 15567-027) | |
| HEPES 1M, pH7.4 | Invitrogen | 15630 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) 1M | Ambion | AM9530G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337-100 | |
| DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate | Click Chemistry Tools | A112P3 | |
| 1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure | Invitrogen | 15508-013 | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Micro Bio-Spin 6 Column | Bio-Rad | 732-6222 | |
| Dynabeads MyOne | Invitrogen | 650-01 | |
| Streptavidin C1 | |||
| Qiagen MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| UDP-6-N3-glucose | Active Motif | 55013 | |
| Enzyme | |||
| β-glucosyltransferase (β-GT) | New England Biolab | M0357 | |
| Equipment | |||
| Sonication device | Covaris | ||
| Desktop centrifuge | |||
| Water bath | Fisher Scientific | ||
| Gel running apparatus | Bio-Rad | ||
| NanoDrop1000 | Thermo Scientific | ||
| Labquake Tube Shaker | Barnstead | ||
| Labquake Tube Shaker | Thermolyne | ||
| Magnetic Separation Stand | Promega | Z5342 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20). | |||
References
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. , Suppl 33. 245-254 (2003).
- Ito, S. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466, 1129-1133 (2010).
- Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
- Ko, M. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
- Koh, K. P. Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).
- Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).
- Wossidlo, M. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nat. Commun. 2, 241 (2011).
- Gu, T. P. The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes. Nature. 477, 606-610 (2011).
- Dawlaty, M. M. Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development. Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).
- Huang, Y. The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing. PLoS One. 5, e8888 (2010).
- Song, C. X. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).
- Pastor, W. A. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473, 394-397 (2011).
- Matarese, F., Pau, C. arrillo-deS. anta, E,, Stunnenberg, H. G. 5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block. Mol. Syst. Biol. 7, 562 (2011).
- Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, 181 (2010).
- Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. Biochemical characterization of recombinant β-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes. Biochemistry. , (2012).
- Rusmintratip, V., Sowers, L. C. An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).
- Globisch, D. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367 (2010).
- Yildirim, O. Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells. Cell. 147, 1498-1510 (2011).
- Szulwach, K. E. Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells. PLoS Genet. 7, e1002154 (2011).
- Szulwach, K. E. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).
