Summary
Décrit un procédé de marquage en deux étapes à l'aide β-glucosyltransférase (β-GT) pour transférer un azide-glucose à 5-HMC, suivie par click chemistry pour transférer un segment de liaison de biotine pour l'enrichissement facile et indépendante de la densité. Cette méthode d'étiquetage efficace et spécifique permet l'enrichissement de la 5-HMC avec un fond extrêmement faible et la cartographie épigénomique à haut débit via séquençage de prochaine génération.
Abstract
5-méthylcytosine (5-mC) constitue ~ 2-8% des cytosines total dans l'ADN génomique humain et affecte une large gamme de fonctions biologiques, y compris l'expression des gènes, le maintien de l'intégrité du génome, empreinte parentale, inactivation du chromosome X, la réglementation des développement, le vieillissement et le cancer 1. Récemment, la présence d'un 5-mC oxydé, 5-hydroxyméthylcytosine (5-HMC), a été découvert dans les cellules de mammifères, en particulier dans les cellules souches embryonnaires (ES) et de cellules neuronales 2-4. 5-HMC est généré par l'oxydation du 5-mC catalysée par TET famille du fer (II) / α-cétoglutarate en fonction de dioxygénases 2, 3. 5-HMC est proposé de participer à l'entretien de souches embryonnaires (MES) cellulaire, hématopoïèse normale et les tumeurs malignes et le développement du zygote 2, 5-10. Afin de mieux comprendre la fonction de la 5-HMC, un système de séquençage fiable et simple est essentielle. Séquençage bisulfite traditionnelle ne peut pas distinguer 5-5-console HMC à partir MC 11 12.
Nous décrivons ici une simple procédure en deux étapes pour l'étiquetage chimique sélective de la 5-HMC. Dans la première étape de marquage, le 5-HMC dans l'ADN génomique est marqué avec un azide catalysée 6-β-glucose par-GT, une glucosyltransférase du bactériophage T4, d'une manière qui transfère le 6-azide-glucose à 5-HMC de l' modifié cofacteur, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). Dans l'étape, biotinylation seconde, une liaison disulfure biotine est fixé au groupe azide par click chemistry. Ces deux étapes sont très spécifiques et efficace, conduisant à compléter l'étiquetage quelle que soit l'abondance de la 5-HMC dans des régions génomiques et en donnant de fond extrêmement faible. Après biotinylation de 5-HMC, les fragments d'ADN 5-HMC contenant sont ensuite sélectivement capturéen utilisant des billes de streptavidine d'une manière indépendante de la densité. Les résultantes 5-HMC-enrichis fragments d'ADN peuvent être utilisés pour les analyses en aval, y compris séquençage de prochaine génération.
Notre marquage sélectif et le protocole de capture confère une sensibilité élevée, applicable à toute source d'ADN génomique avec des variables / 5 diversifiée HMC abondance. Bien que le but principal de ce protocole est son application en aval (., Séquençage de prochaine génération de cartographier la distribution 5-HMC dans le génome), il est compatible avec une seule molécule, en temps réel SMRT (ADN) séquençage, qui est capable de fournir séquençage résolution d'une seule base de 5-HMC.
Protocol
1. La fragmentation ADN génomique
Fragment d'ADN génomique en utilisant sonication à une gamme de taille souhaitée adapté à la plate-forme de séquençage du génome entier. (En général, nous soniquer à ~ 300 pb.) Vérifier la distribution de la taille de l'ADN génomique fragmenté sur gel d'agarose 1% (Figure 1).
2. Préparation de l'ADN
Déterminer les quantités d'ADN à partir basées sur l'abondance de la 5-HMC dans l'ADN génomique. Depuis le 5-HMC niveaux varient considérablement dans différents types de tissus, des quantités d'ADN à partir dépendre des niveaux de 5-HMC des échantillons. S'il vous plaît se référer au tableau 1 pour des exemples.
3. β-GT réaction catalysée (Réaction de transfert de glucose)
- Mélanger à la pipette le mélange comme indiqué dans le tableau 2 et incuber dans un bain à 37 ° C de l'eau pendant 1 heure.
- Après incubation, nettoyer la réaction avec QIAquick suppression de nucléotides, utilisant 10 pg d'ADN parcolonne. Éluer avec 30 pl d'eau par colonne et se combinent.
4. La réaction de biotinylation (Cliquez Chimie)
- Ajouter DBCO-SS-biotine conjugué Peg3-solution de travail (1 mM) dans la solution d'ADN élué (à partir de l'étape 3) à une concentration finale de 150 uM (soit 5 ul de solution de travail pour 30 solution d'ADN ul).
- Mélanger à la pipette et incuber dans un bain à 37 ° C de l'eau pendant 2 heures.
- Nettoyer la réaction avec QIAquick suppression de nucléotides. Le volume d'élution idéal totale est de 100 ul.
- Quantifier la quantité d'ADN récupéré à l'aide spectrophotomètre échelle du microlitre (p. ex., NanoDrop).
5. La capture de 5-HMC ADN contenant
- Lavez 50 pi de Dynabeads MyOne C1 streptavidine 3 fois avec 1 ml de B & W 1X tampon conformément aux instructions du fabricant. Séparer les billes avec un support magnétique.
- Ajouter un volume égal de tampon 2X B & W pour le récupéré D biotinyléNA (100 ul) pour les billes lavées.
- Incuber pendant 15 min à température ambiante avec une légère rotation sur un rotateur.
- Séparer les billes avec un support magnétique et laver les billes 3 fois avec 1 ml de tampon 1X B & W.
- Éluer l'ADN par incubation des billes dans 100 ul de fraîchement préparée DTT 50 mM pendant 2 h à température ambiante avec une légère rotation sur un rotateur.
- Séparer les billes avec un support magnétique. Aspirer l'éluant et la charge sur un Micro Bio-Spin 6 Colonne selon les instructions de fabrication pour enlever la TNT. L'ADN cible est présent dans la solution.
- Purifier l'ADN élue de l'étape précédente par Qiagen PCR Purification Kit MinElute et éluer l'ADN dans 10 pl de tampon EB. Quantifier l'ADN en utilisant fluorimètre qubit, ou NanoDrop si la concentration est supérieure à 20 ng / ul. L'ADN est prêt pour aval du génome entier de préparation bibliothèque séquençage.
6. Les résultats représentatifs
Si le joint de la qualitéf ADN génomique est élevée, les rendements de récupération typiques après la β-GT et les réactions sont biotinylation ~ 60-70%. Cependant, l'efficacité de captage varient considérablement en fonction des types de tissus différents en fonction des niveaux de 5-HMC des échantillons. En règle générale, l'efficacité de captage de l'ADN génomique du cerveau est d'environ 4-9%, et dans certains cas extrêmes, le rendement peut atteindre jusqu'à 12%. Pour les cellules ES, l'efficacité de captage moyenne est d'environ 2-4%, contrairement à ~ 0,5% pour les cellules souches neurales. La faible efficacité vu jusque là est pour l'ADN génomique à partir de cellules cancéreuses. Tout l'ADN enrichi est prêt pour la prochaine génération de standards protocoles de préparation de la bibliothèque. En outre, l'ADN capturée peut également être utilisé comme matrice pour la PCR en temps réel pour détecter l'enrichissement de quelques fragments d'ADN par rapport à l'entrée, si les amorces liées sont disponibles.
Figure 1. Soniquées homme fragments d'ADN génomique dans1% gel d'agarose. 10 pg d'ADN génomique isolé à partir de cellules iPS humaines dans 120 ul de tampon TE 1X a été soniquée à l'aide d'un dispositif de sonication (Covaris). Après sonication, 2 pl de l'ADN soniqué a été chargé sur un gel d'agarose 1% en utilisant 100 pb de l'ADN marqueur pour comparer les tailles des fragments d'ADN soniqué.
| Composant | Volume | Concentration finale |
| Eau | _ Pl | |
| Tampon de 10 X Réaction β-GT | 2 pl | X 1 |
| Jusqu'à 10 mg d'ADN génomique | _ Pl | Jusqu'à 500 ng / pl |
| UDP-6-N 3-Glc (3 mM) | 0,67 ul | 100 pM |
| β-GT (40 uM) | 1 pl | 2 uM |
| Le volume total | 20 pi |
i) Pour l'ADN génomique des tissus (haute teneur en 5-HMC> 0,1%)
| Composant | Volume | Concentration finale |
| Eau | _ Pl | |
| Tampon de 10 X Réaction β-GT | 10 pl | X 1 |
| Jusqu'à 20 mg d'ADN génomique | _ Pl | Jusqu'à 500 ng / pl |
| UDP-6-N3-Glc (3 mM) | Ul 1,33 | 100 pM |
| β-GT (40 uM) | 2 pl | 2 uM |
| Le volume total | 40 pi |
ii) Pour l'ADN génomique de cellules souches (médiane 5-HMC contenu ~ 0,05%)
| Composant | Volume | Concentration finale |
| Eau | _ Pl | |
| Tampon de 10 X Réaction β-GT | 10 pl | X 1 |
| Jusqu'à 50 mg d'ADN génomique | _ Pl | Jusqu'à 500 ng / pl |
| UDP-6-N3-Glc (3 mM) | 3,33 ul | 100 pM |
| β-GT (40 uM) | 5 pl | 2 uM |
| Le volume total | 100 pi |
iii) Pour l'ADN génomique des cellules cancéreuses (faible teneur en 5-HMC ~ 0,01%)
Tableau 1. Exemples de quantités d'ADN d'entrée et de réactions de marquage utilisant des échantillons avec différents niveaux de 5-HMC par la méthode de marquage chimique sélective.
| Échantillon | 5-HMC niveau | ADN de départ (pg) | La récupération après l'étiquetage (entrée à billes) (pg) | Rendement de récupération | Pull-down ADN (ng) | Pull-down rendement |
| Cervelet de souris adulte | 0,4% | 10 | 7,5 | 75% | 236 | 3,1% |
| Postnatal du cervelet de souris 7 jours | 0,1% | 11 | 9 | 82% | 140 | 1,6% |
| Souris cellules ES E14 | 0,05% | 60 | 42 | 70% | 350 | 0,8% |
Tableau 2. Résultats représentatifs à partir de tissus de cerveau de souris et des cellules ES.
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Discussion
5-hydroxyméthylcytosine (5-HMC) est une modification présente récemment identifié épigénétique en quantités importantes dans certains types de cellules de mammifères. La méthode présentée ici est de déterminer la distribution du génome entier de 5-HMC. Nous utilisons bactériophage T4 β-glucosyltransférase de transférer une fraction de glucose ouvragée contenant un groupe azide sur le groupe hydroxyle de 5-HMC. Le groupe azide peut être modifié chimiquement avec de la biotine pour la détection, l'enrichissement d'affinité, et le séquençage de fragments d'ADN 5-HMC contenant des génomes de mammifères. Ce protocole a des avantages sur 5 HMC à base d'anticorps immunoprécipitation ADN hydroxyméthylé (hMeDIP-Seq) 13-15, bien que le hMeDIP est simple, il a une forte tendance à haute densité 5-HMC régions et donne généralement des résultats incohérents de traction indépendante de valeur. Notre méthode ne serait pas introduire de biais par exemple.
Il ya, cependant, deux préoccupations possibles en termes de notre étiquetage et me capturerDThO. La première préoccupation pourrait être la spécificité de l'étiquetage et de capture. Depuis un récent rapport indique que le 5-hydroxyméthyluracile (5-HMU) peut également servir de substrat de β-GT, de faux signaux positifs pourraient être introduites, conduisant à des fragments enrichis qui sont non spécifiques à la 5-HMC-parenté 16. Cette préoccupation pourrait être sans fondement, mais, depuis très actives 5-hydroxyméthyluracile-ADN glycosylases sont constamment suppression de cette altération de l'ADN, ce qui entraîne essentiellement indétectable 5-HMU chez les mammifères génome 17,18. La deuxième préoccupation est l'efficacité de l'étiquetage et de la capture. Depuis le 5-HMC niveaux varient considérablement dans les différents tissus et de cellules, allant de 0,5% dans les tissus cérébraux à 0,05% dans les cellules MES et de 0,01% dans les cellules cancéreuses, il est essentiel que nos méthodes sont applicables à tous ces tissus en fonction de la aval applications de l'ADN génomique marqués et capturés. Notre expérience montre que les méthodes décrites ici sont en effet sensibles et spécifiquessuffisant pour analyser l'ensemble de ces tissus à des fins de comparaison, soit à base de quantification de 5-HMC niveaux entre les tissus ou pour des applications en aval, telles que le séquençage de profondeur pour cartographier la distribution de la 5-HMC 19-21 dans le génome.
La clé de notre méthode est l'utilisation d'une quantité appropriée de commencer l'ADN génomique. Si la concentration de l'ADN génomique est trop faible, l'efficacité du marquage et de la spécificité diminuera en conséquence. Basé sur notre expérience, même si l'abondance de la 5-HMC est suffisamment élevée dans l'ADN à partir de tissus du cerveau, si la concentration est inférieure à 25 ng / ul dans 20 ul de la réaction, l'étiquetage et l'efficacité de capture, ainsi que la spécificité, sera considérablement réduite. Pour les échantillons d'ADN de faible abondance, en plus de l'exigence de concentration, la quantité totale d'ADN est essentiel pour se défoncer et l'efficacité de capture spécifique. Ainsi, bien que l'on n'a besoin que de 25 ng de fragments d'ADN 5-HMC-enrichis pour la st avalAndard protocoles de génération de bibliothèque utilisées par les plates-formes de séquençage de nouvelle génération, le montant de départ de l'ADN génomique à partir de tissus cérébraux ne doit pas être inférieure à 2 ug (ainsi que le montant de départ idéal est ug 5-10). Par essais et erreurs, nous avons optimisé le montant de départ de l'ADN génomique à partir de différents tissus avec des variables 5-HMC abondance pour obtenir une efficacité d'étiquetage et une spécificité élevées, comme détaillé dans le tableau 2.
En résumé, notre méthode est qualifiée pour étiqueter précisément génomique 5-HMC et plus particulièrement capturer les fragments 5-HMC contenant, ce qui en fait un protocole efficace en termes de sensibilité et de spécificité pour des essais en aval de séquençage de prochaine génération.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Cette étude a été financée en partie par le National Institutes of Health (GM071440 au CH et NS051630/MH076090/MH078972 à PJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Promega | V4221 | |
| 0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | V4231 | |
| 1M Trizma base (Tris) pH7.5 | Invitrogen | 15567-027) | |
| HEPES 1M, pH7.4 | Invitrogen | 15630 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) 1M | Ambion | AM9530G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337-100 | |
| DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate | Click Chemistry Tools | A112P3 | |
| 1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure | Invitrogen | 15508-013 | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Micro Bio-Spin 6 Column | Bio-Rad | 732-6222 | |
| Dynabeads MyOne | Invitrogen | 650-01 | |
| Streptavidin C1 | |||
| Qiagen MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| UDP-6-N3-glucose | Active Motif | 55013 | |
| Enzyme | |||
| β-glucosyltransferase (β-GT) | New England Biolab | M0357 | |
| Equipment | |||
| Sonication device | Covaris | ||
| Desktop centrifuge | |||
| Water bath | Fisher Scientific | ||
| Gel running apparatus | Bio-Rad | ||
| NanoDrop1000 | Thermo Scientific | ||
| Labquake Tube Shaker | Barnstead | ||
| Labquake Tube Shaker | Thermolyne | ||
| Magnetic Separation Stand | Promega | Z5342 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20). | |||
References
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