Summary
Beskrevet er en to-stegs etiketteringsprosessen hjelp β-glucosyltransferase (β-GT) for å overføre en azid-glukose til 5-HMC, etterfulgt av klikk kjemi å overføre en biotin linker for enkel og tetthet uavhengig berikelse. Denne effektive og spesifikke merking metoden muliggjør berikelse av 5-HMC med ekstremt lav bakgrunn og høy gjennomstrømning epigenomic kartlegging via neste generasjons sekvensering.
Abstract
5-methylcytosine (5-mC) utgjør ~ 2-8% av de totale cytosines i humant genomisk DNA og påvirker et bredt spekter av biologiske funksjoner, inkludert genekspresjon, vedlikehold av genom integritet, foreldrenes imprinting, X-kromosom inaktivering, regulering av utvikling, aldring og kreft en. Nylig, ble tilstedeværelsen av et oksydert 5-MC, 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC), oppdaget i pattedyrceller, spesielt i embryonale stamceller (ES-celler) og neuronale celler 2-4. 5-HMC genereres ved oksidasjon av 5-mC katalysert av TET family jern (II) / α-ketoglutarat-avhengige 2 dioxygenases, 3. 5-HMC er foreslått å være involvert i vedlikehold av embryonale stamceller (MES) celle, normal hematopoiesis og maligniteter, og zygote utvikling 2, 5-10. For bedre å forstå funksjonen av 5-HMC, er en pålitelig og grei sekvensering system viktig. Tradisjonell bisulfite sekvensering kan ikke skille 5-HMC fra 5-mC 11 12.
Her beskriver vi en grei totrinns prosedyre for selektiv kjemisk merking av 5-HMC. I det første trinnet merking, er 5-HMC i genomisk DNA merket med en 6-azide-glukose katalysert av β-GT, en glucosyltransferase fra T4 bakteriofag, på en måte som overfører 6-azide-glukose til 5-HMC fra modifisert cofaktor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). I det andre trinn, biotinylation, en disulfid biotin linkerarm festet til azid-gruppen ved klikk kjemi. Begge trinnene er meget spesifikke og effektive, fører til fullstendig merking uansett overflod av 5-HMC i genomisk regioner og gi ekstremt lav bakgrunn. Etter biotinylation av 5-HMC, de 5-HMC-holdige DNA-fragmenter blir deretter selektivt fangetbruker streptavidin perler i en tetthet-uavhengig måte. De resulterende 5-HMC-beriket DNA fragmenter kan bli brukt for nedstrøms analyser, inkludert neste generasjons sekvensering.
Vår selektiv merking og fangst protokollen confers høy følsomhet, gjelder enhver kilde til genomisk DNA med variable / diverse 5-HMC abundances. Selv om hovedformålet med denne protokollen er dens nedstrøms søknaden (ie., Neste generasjons sekvensering å kartlegge 5-HMC distribusjon i genomet), er den kompatibel med single-molekyl, real-time SMRT (DNA) sekvensering, som er stand til å levere ett-grunnoppløsningen sekvensering av 5-HMC.
Protocol
1. Genomisk DNA fragmentering
Fragment genomisk DNA ved hjelp av sonikering i et ønsket størrelsesområde egnet for genom-wide sekvensering plattform. (Vi vanligvis sonicate til ~ 300 bp). Verifiser størrelsesfordelingen av den fragmenterte genomisk DNA på 1% agarosegel (figur 1).
2. DNA Forberedelse
Bestem utgangsmaterialene DNA beløp basert på overflod av 5-HMC i genomisk DNA. Siden 5-HMC-nivåene varierer betydelig i forskjellige vevstyper, starter DNA beløpene avhenger 5-HMC nivåer av prøvene. Se tabell 1 for eksempler.
3. β-GT katalysert reaksjon (glukose Transfer Reaction)
- Bland ved pipettering av blandingen som beskrevet i tabell 2 og inkuber i en 37 ° C vannbad i 1 time.
- Etter inkubering, rydde opp reaksjonen med QIAquick nukleotid fjerning Kit, ved anvendelse av 10 ug DNA prkolonnen. Eluere med 30 pl vann per kolonne og kombinere.
4. Biotinylation Reaction (Klikk kjemi)
- Legg DBCO-SS-PEG3-Biotin konjugat arbeidsløsning (1 mM) i eluerte DNA-løsningen (fra trinn 3) til en endelig konsentrasjon på 150 uM (dvs. 5 ul arbeidsoppløsning pr 30 ul DNA-løsningen).
- Bland ved pipettering og inkuber i en 37 ° C vannbad i 2 timer.
- Rydde opp i reaksjon med QIAquick nukleotid fjerning Kit. Den ideelle total elueringsvolum er 100 ul.
- Kvantifisere gjenvunnet DNA mengde med mikroliter skala spektrofotometer (f.eks., NanoDrop).
5. Capture av 5-HMC-holdig DNA
- Vask 50 ul Dynabeads MYONE Streptavidin C1 3 ganger med 1 ml 1X B & W buffer i henhold til produsentens instruksjoner. Separer perler med en magnetisk stativ.
- Legg likt volum 2X hvitt buffer til den gjenopprettede biotinylert DNA (100 ul) til de vaskede perlene.
- Inkuber i 15 minutter ved romtemperatur med forsiktig rotasjon på en rotator.
- Separer perler med en magnetisk stativ og vaske perlene 3 ganger med 1 ml 1X hvitt buffer.
- Eluer DNA ved inkubering perlene i 100 mikroliter tilberedes 50 mM DTT i 2 timer ved romtemperatur med forsiktig rotasjon på en rotator.
- Separer perler med en magnetisk stativ. Aspirer eluent og lastes på en Micro Bio-Spin 6 Kolonne ifølge fremstillingen instruksjon for å fjerne DTT. Target DNA er i løsningen nå.
- Rense eluerte DNA fra forrige trinn med Qiagen MinElute PCR Purification Kit og eluer DNA i 10 ul av EB-buffer. Kvantifisere DNA ved bruk Qubit fluorometer eller NanoDrop hvis konsentrasjonen er høyere enn 20 ng / ul. DNA er klar for nedstrøms genom-wide sekvensering biblioteket forberedelse.
6. Representant Resultater
Hvis kvaliteten of genomisk DNA er høy, typisk utvinning utbytter etter β-GT og biotinylation reaksjoner er ~ 60-70%. Imidlertid utløsertasten effektivitet variere kraftig med ulike vevstyper avhengig 5-HMC nivåer av prøvene. Vanligvis, er fange effektivitet for hjernen genomisk DNA ~ 4-9%, og i noen ekstreme tilfeller kan effektiviteten nå opp til 12%. For ES celler, er den gjennomsnittlige fangst virkningsgrad ~ 2-4%, i motsetning til ~ 0,5% for nevrale stamceller. Den beste effektivitet sett så langt var for genomisk DNA fra kreftceller. Alle beriket DNA er klar for standard neste generasjons bibliotek forberedelse protokoller. I tillegg kan DNA fanges også brukes som templat for real-time PCR å detektere berikelse av noen fragmenter i forhold til inngangen DNA dersom de relaterte primere er tilgjengelige.
Figur 1. Sonikert humane genomiske DNA-fragmenter i1% agarosegel. 10 ug genomisk DNA isolert fra humane iPS celler i 120 pl TE-buffer ble 1X sonikert med en sonikering enhet (Covaris). Etter sonikering, ble 2 ul av den sonikert DNA lastet på 1% agarosegel ved hjelp av 100 bp av DNA-markør å sammenligne størrelsen på sonikert DNA fragmenter.
| Komponent | Volum | Endelig konsentrasjon |
| Vann | _ Ul | |
| 10 X β-GT reaksjonsbuffer | 2 ul | 1 X |
| Opp til 10 mikrogram genomisk DNA | _ Ul | Inntil 500 ng / pl |
| UDP-6-N 3-Glc (3 mM) | 0,67 ul | 100 pM |
| β-GT (40 mikrometer) | 1 ul | 2 pM |
| Totalt volum | 20 pl |
i) For vev genomisk DNA (høy 5-HMC innhold> 0,1%)
| Komponent | Volum | Endelig konsentrasjon |
| Vann | _ Ul | |
| 10 X β-GT reaksjonsbuffer | 10 pl | 1 X |
| Opptil 20 pg genomisk DNA | _ Ul | Inntil 500 ng / pl |
| UDP-6-N3-Glc (3 mM) | 1,33 ul | 100 pM |
| β-GT (40 mikrometer) | 2 ul | 2 pM |
| Totalt volum | 40 pl |
ii) For stamcelleforskningen genomisk DNA (median 5-HMC innhold ~ 0,05%)
| Komponent | Volum | Endelig konsentrasjon |
| Vann | _ Ul | |
| 10 X β-GT reaksjonsbuffer | 10 pl | 1 X |
| Opp til 50 ug genomisk DNA | _ Ul | Inntil 500 ng / pl |
| UDP-6-N3-Glc (3 mM) | 3,33 ul | 100 pM |
| β-GT (40 mikrometer) | 5 pl | 2 pM |
| Totalt volum | 100 ul |
iii) For kreftcelle genomisk DNA (lav 5-HMC innholdet ~ 0,01%)
Tabell 1. Eksempler mengder innspill DNA og merking reaksjoner hjelp av prøver med forskjellige 5-HMC nivåer ved selektiv kjemisk merking metoden.
| Eksempel | 5-HMC nivå | Starter DNA (pg) | Restitusjon etter merking (inngang til perler) (mikrogram) | Recovery avkastning | Rullegardin DNA (ng) | Rullegardin gi |
| Voksen mus lillehjernen | 0,4% | 10 | 7.5 | 75% | 236 | 3,1% |
| Postnatal dag 7 mus lillehjernen | 0,1% | 11 | 9 | 82% | 140 | 1,6% |
| Mus ES cell E14 | 0,05% | 60 | 42 | 70% | 350 | 0,8% |
Tabell 2. Representative resultater fra mus hjernen vev og ES celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) er et nylig identifisert epigenetic modifikasjon tilstede i betydelige mengder i visse pattedyr celletyper. Metoden som presenteres her er for å bestemme genom-wide distribusjon av 5-HMC. Vi bruker T4 bakteriofag β-glucosyltransferase å overføre en konstruert glukose moiety inneholdende en azide gruppe på hydroksylgruppen av 5-HMC. Azidet gruppen kan være kjemisk modifisert med biotin for deteksjon, affinitet berikelse, og sekvensering av 5-HMC-holdige DNA-fragmenter i pattedyr genomer. Denne protokollen har fordeler fremfor 5-HMC antistoff-baserte hydroxymethylated DNA immunoutfelling (hMeDIP-Seq) 13-15, selv om hMeDIP er enkel, har den en sterk bias mot høytetthets 5-HMC regioner og vanligvis gir inkonsekvente resultater fra uavhengige trekk -downs. Vår metode ville ikke innføre et slikt bias.
Det er imidlertid to mulige bekymringer i form av merking vår og fange megThOD. Den første bekymring kunne spesifisiteten av merking og fangst. Siden en fersk rapport indikerte at 5-hydroxymethyluracil (5-HMU) kan også tjene som et substrat av β-GT, kan falske positive signaler bli innført, noe som fører til beriket fragmenter som er uspesifikke til 5-HMC-slektskap 16. Denne bekymringen kan være ubegrunnet, men siden svært aktive 5-hydroxymethyluracil-DNA glycosylases stadig fjerne denne DNA-skader, noe som resulterer i hovedsak undetectable 5-HMU i pattedyr genom 17,18. Den andre bekymringen er effektiviteten av merking og fangst. Siden 5-HMC-nivåene varierer betydelig i forskjellige vev og celler, som strekker seg fra 0,5% i hjernevev til 0,05% i MES celler og 0,01% i kreftceller, er det viktig at våre metoder være gjeldende for alle disse vev i form av nedstrøms anvendelser av merket og fanget genomisk DNA. Vår erfaring viser at metodene som er beskrevet her er faktisk sensitiv og spesifikknok til å analysere alle disse vev for det formål enten kvantifisering-basert sammenligning av 5-HMC nivåer blant vev eller for nedstrøms applikasjoner, slik som dyp sekvensering for å kartlegge fordelingen av 5-HMC i genomet 19-21.
Nøkkelen til vår metode er bruken av en egnet mengde av start genom DNA. Dersom genomisk DNA-konsentrasjon er for lav, vil den merking effektivitet og spesifisitet reduseres tilsvarende. Basert på vår erfaring, selv om overflod av 5-HMC er høy nok i DNA fra hjernevev, dersom konsentrasjonen er lavere enn 25 ng / pl i 20 pl reaksjon, merkingen og fangst effektivitet, samt spesifisitet, vil bli betydelig redusert. For lav-overflod DNA-prøvene, i tillegg til konsentrasjonen krav, er den totale mengde DNA viktig å få høy og spesifikk fangst effektivitet. Dermed trenger selv en bare 25 ng 5-HMC-beriket DNA fragmenter for nedstrøms stAndard bibliotek generasjon protokoller ansatt neste generasjons sekvensering plattformer, bør utgangs mengden av genomisk DNA fra hjernevev ikke være mindre enn 2 ug (og ideelt utgangspunkt beløp er 5-10 ug). Gjennom prøving og feiling, har vi optimalisert start mengden av genomisk DNA fra forskjellige vev med variabel 5-HMC abundances å få høy effektivitet og merking spesifisitet, som beskrevet i Tabell 2.
Oppsummert er vår metode kvalifisert til nettopp merke genomisk 5-HMC og spesielt fange 5-HMC-holdige fragmenter, noe som gjør det til en vellykket protokoll i form av sensitivitet og spesifisitet for nedstrøms neste generasjons sekvensering analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet i en del av National Institutes of Health (GM071440 til CH og NS051630/MH076090/MH078972 til PJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Promega | V4221 | |
| 0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | V4231 | |
| 1M Trizma base (Tris) pH7.5 | Invitrogen | 15567-027) | |
| HEPES 1M, pH7.4 | Invitrogen | 15630 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) 1M | Ambion | AM9530G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337-100 | |
| DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate | Click Chemistry Tools | A112P3 | |
| 1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure | Invitrogen | 15508-013 | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Micro Bio-Spin 6 Column | Bio-Rad | 732-6222 | |
| Dynabeads MyOne | Invitrogen | 650-01 | |
| Streptavidin C1 | |||
| Qiagen MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| UDP-6-N3-glucose | Active Motif | 55013 | |
| Enzyme | |||
| β-glucosyltransferase (β-GT) | New England Biolab | M0357 | |
| Equipment | |||
| Sonication device | Covaris | ||
| Desktop centrifuge | |||
| Water bath | Fisher Scientific | ||
| Gel running apparatus | Bio-Rad | ||
| NanoDrop1000 | Thermo Scientific | ||
| Labquake Tube Shaker | Barnstead | ||
| Labquake Tube Shaker | Thermolyne | ||
| Magnetic Separation Stand | Promega | Z5342 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20). | |||
References
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. , Suppl 33. 245-254 (2003).
- Ito, S. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466, 1129-1133 (2010).
- Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
- Ko, M. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
- Koh, K. P. Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).
- Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).
- Wossidlo, M. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nat. Commun. 2, 241 (2011).
- Gu, T. P. The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes. Nature. 477, 606-610 (2011).
- Dawlaty, M. M. Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development. Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).
- Huang, Y. The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing. PLoS One. 5, e8888 (2010).
- Song, C. X. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).
- Pastor, W. A. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473, 394-397 (2011).
- Matarese, F., Pau, C. arrillo-deS. anta, E,, Stunnenberg, H. G. 5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block. Mol. Syst. Biol. 7, 562 (2011).
- Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, 181 (2010).
- Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. Biochemical characterization of recombinant β-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes. Biochemistry. , (2012).
- Rusmintratip, V., Sowers, L. C. An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).
- Globisch, D. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367 (2010).
- Yildirim, O. Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells. Cell. 147, 1498-1510 (2011).
- Szulwach, K. E. Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells. PLoS Genet. 7, e1002154 (2011).
- Szulwach, K. E. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).
