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Neuroscience

长期的嗅觉适应性的分子读数 doi: 10.3791/4443 Published: December 22, 2012

Summary

在这里,我们描述了一个长期的嗅觉适应性的分子读出

Abstract

在持续的刺激感官的神经元减少其对信号的灵敏度,以适应他们的反应。适应的反应有助于形状的重视和保护细胞过度刺激。 C.适应内的嗅觉电路线虫最早是由Colbert和巴格曼1,2。在这里,作者定义的参数的嗅觉适应的范例,这是他们设计一个隔离的能力,以适应挥发性气味的化学传感器翼细胞C型(AWC)感觉神经元检测缺陷的突变体的遗传筛选。当野生型C.线虫动物暴露于一个有吸引力的AWC-检测到的气味3为30分钟,他们会适应他们的气味的响应,然后将忽略适应中的趋化行为〜1小时测定气味。当野生型C.线虫动物暴露于一个有吸引力的AWC-〜1小时检测到的气味,他们将忽略在交流的适应气味hemotaxis行为分析〜3小时。这两个阶段的嗅觉适应性C.线虫被描述为短期嗅觉适应30分钟后,气味暴露引起的,长期的嗅觉适应60分钟后,气味暴露引起的。 L'Etoile酒店等。后来的工作发现了一种蛋白激酶G(PKG)EGL-4的短期和长期的嗅觉适应性AWC神经元所需要的。 EGL-4蛋白含有核定位序列,有必要为长期的嗅觉适应性反应,但可有可无的短期嗅觉适应性反应的AWC 4。绿色荧光蛋白标记EGL-4,这是可能的可视化本地化的EGL-4在AWC暴露在长时间的气味。使用此功能齐全的GFP标记的EGL-4(GFP :: EGL-4)分子,我们已经能够开发出分子读出长期的嗅觉适应性AWC 5。使用这个米olecular读出的嗅觉适应,我们已经能够进行正向和反向遗传筛选,以确定突变的动物表现出有缺陷的亚细胞定位模式GFP :: EGL-AWC 6,7。在这里,我们描述:1)建造的GFP :: EGL-4表达动物; 2)的协议,用于培养动物长期臭味诱导核易位测定;和3)的得分长期臭味诱导核易位核GFP :: EGL-4状态的事件和恢复(重新过敏)。

Protocol

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1。建设GFP标记EGL-4表达动物

  1. ODR-3基因(使用2678 bp的直接上游的起始密码子)的启动子下克隆的翻译融合GFP :: EGL-4:(对)ODR-3 :: GFP :: EGL-4。在化学传感器的神经元对ODR-3启动子驱动表达:AWA; AWB; AWC,以及在ASH弱。
  2. 进样的质粒(对)ODR-3 :: GFP :: EGL-4成野生型(N2)的动物在50纳克/微升的共注射的标记物,使用标准的种系的转化技术8:(对)OFM-1: :GFP的9(25纳克/微升),和(p)ODR-1 :: 10红色荧光蛋白(25纳克/微升)。 ODR-1启动子驱动器的的AWC和AWB化学传感器神经元对表达的,和OFM-1启动子驱动器中的体腔细胞中的表达。
  3. 主题表达的转基因动物外的阵列详细的步骤1.2中的紫外线(UV)/三甲基(TMP)集成协议11。
  4. 漂白剂的动物12同步,并培养他们对土壤线虫生长培养基(NGM)板OP50 E.大肠杆菌 L4阶段。关闭NGM板清洗L4动物与M9缓冲删除OP50 E.大肠杆菌的细菌。
  5. 删除M9缓冲区和30μg/ ml的TMP解决方案的蠕虫病毒颗粒上的1.5 ml离心管中加50-100μl。在铝箔包裹的1.5 ml离心管,阻挡环境光,在旋转器上,并轻轻搅动15分钟箔纸包裹的1.5 ml离心管中。在一个大的非种子选手NGM板的TMP /蠕虫的解决方案,传输的蠕虫病毒。
  6. NGM板UV 350μJ(X100),使用Stratalinker 2400上公开的蠕虫。然后添加蠕虫的OP50的NGM板,在黑暗中孵育5小时。
  7. 选择50个转基因蠕虫约10种子板(每块板)2-5蠕虫。转让P0的新盘每3天24小时。
  8. 挑选250个克隆F1一nimals(每盘)1只动物。克隆了2-4 F2动物每个F1板的。检查F3动物100%的传输线(P)OFM-1 :: GFP的表达模式荧光显微镜下解剖,以寻找。
  9. 异交的最终集成线(s),与野生型N2动物5倍。我们会参考到最后的集成线路pyIs500,GFP标记的EGL-4分子GFP :: EGL-4。

2。动物的培育和维护核转位分析

  1. 在25°C对标准的10厘米NGM板(见下面的配方)种子OP50 E.培养pyIs500动物大肠杆菌 13( 图1)。
  2. 在白天1,中挑四点五十六L4 pyIs500动物从板培养在25℃下到五个单独的10厘米OP50 E.大肠杆菌接种板和孵育在25℃(即,4-5 L4动物每板)。
  3. 第4天,洗成人p关闭大NGM板使用S-基底缓冲pyIs500动物opulations(见下面的配方)。使用一次性的玻璃吸液管转移的动物,因为它们会粘到塑料吸头的侧。

3。长期气味诱导核易位分析

  1. 洗净pyIs500动物,S-基底去除细菌的3倍。不要离心洗涤;动物之间,而让动物在一个固定的1.5 ml离心管重力沉降。这是至关重要的,以确保所有的细菌被删除,NGM馅饼不受污染,残留的细菌会产生负面影响的易位检测的结果。此外,我们还发现,高压灭菌的1.5 ml离心管,管内壁上,使动物要坚持的两侧,使用非蒸压1.5毫升的离心管中,产生了“粘性”属性。
  2. 虽然动物之间的清洗解决,使吨他适应的解决方案。基底的S-缓冲液中加入100毫升到100毫升的毕业班缸。加入到S-基底适应的气味,并用石蜡膜的带状密封的圆筒。如果执行,苯甲醛适应7.5微升苯甲醛加入到100毫升的S-基底,丁酮适应到100毫升的S-基底中添加11微升2 - butaone。轻轻地反转(不摇)毕业缸S-基底和气味的30倍,创造均匀的乳液。
  3. 在最后一次洗涤S-基底,让动物定居,并删除所有液体。出版商一管“+ ve”的或“适应”和其他管“负”或“unadapt”。然后加入1毫升的适应组合,以适应离心管(+ VE),并添加1毫升的S-基底的不适应控制的离心管中(VE)。尽量保持每个管中在100和200之间的动物数目。一些实践中,它是可以由眼来估计近似的颗粒的动物数量。
  4. 将1.5 ml的微量离心管帽保护到每个管(防止从弹出打开盖子),将管旋转器上的80分钟。我们发现,气味暴露60分钟和80分钟之间产生相似的结果(包括在长期的适应反应)。然而,80分钟曝光提供了更一致的结果,在我们的手中。因此,我们所有的长期适应的检测标准的使用80分钟的气味曝光( 图2)。
  5. 80分钟后,洗净动物在S-基底的3倍。每次洗间的引力使动物能够解决。

4。短期气味引起的核易位检测

  1. 在短期气味适应的情况下,使用相同的协议作为每长期臭味诱导易位测定(步骤3.1-3.4),然而,而不是在适应80分钟气味孵育pyIs500动物,使用30分钟曝光。下面概述的气味诱导核易位测定的定量(步骤5)是相同的长期和短期之三米的风险。

5。评分气味引起的核易位事件

  1. 2%琼脂糖垫含有5 mM叠氮化钠(NaN 3)中,溶解在卫生署2 0琼脂糖凝胶电泳。包含NaN的一个玻璃载玻片上放置一个熔化的琼脂糖下降。立即将另一显微镜载玻片上的第一张幻灯片扁平化的熔化的琼脂糖下降。静置30秒,然后轻轻地梳理出了一台琼脂糖凝胶垫〜1毫米的显微镜玻片上留下一个显微镜幻灯片。
  2. 在最后一次洗涤S-基底,让蠕虫,解决在1.5 ml离心管中,并删除所有的液体。然后,添加动物逐滴几个显微镜载玻片上的琼脂糖凝胶垫。重要的是要保持每张幻灯片的动物的数量在50和100之间。太多的动物每张幻灯片将复杂的得分和蓝色光激发后,通常会创建一个散射光芒。过量的液体可恶人从琼脂糖垫使用小剑擦拭。一个0.5毫米的玻璃盖玻片放置到焊盘上,静置2分钟,以允许为NaN 3的固定的动物。请注意,动物可以从幻灯片中后得分。动物会恢复从南3麻醉〜1小时后,如果转移到M9缓冲下降的种子NGM板。
  3. 在这一点上是非常重要的,每一个实验者设计的关键跟踪滑动试验(+ VE)的幻灯片和幻灯片是控制(VE)的幻灯片,通过幻灯片,另一个人会盲目地得分GFP: EGL-4定位模式。这将控制任何实验者的偏见。
  4. 分数50和100之间的每张幻灯片的动物直立使用荧光显微镜的放大倍数10X,40X和63X的目标和GFP / RFP过滤器。首先,找到动物用明视场照明的10倍。其次,找到AWC神经元关闭brigh,中叔场照明和使用RFP滤波器。 (P)的的ODR-1 ::红色荧光蛋白驱动器表达在AWB和AWC神经元。 AWC神经元与AWB细胞体是小的,圆形的形状( 图2)相比,有独特的椭圆形细胞体。
  5. AWC细胞体一旦被找到,切换到GFP过滤器,并记录本地化的GFP:EGL-4核或胞质。使用反使实验者观察目镜,而得分幻灯片。注意:步骤5.1-5.5至少重复3次以产生统计学显着的数据( 图1-2)在不同的日子。

6。监测GFP标记的EGL-4从长期恢复过程中的气味适应

  1. 步骤3.5后,除pyIs500动物的种群分成多个等份和得分核与细胞质GFP :: EGL-AWC在时间点零(即,80分钟后曝光)和Multiple随后的时间点(图3)。
  2. 传输控制(VE)和实验(+)NGM板使用一次性的玻璃吸液管上的动物。
  3. 让动物恢复不同的时间长度,重新审视定位在每个时间点GFP :: EGL-4英寸AWC在5.1至5.5的步骤。

7。物料

NGM板:1升增加至1 L DDH 2 0:21克细菌的琼脂3克氯化钠(NaCl)的2.5克细菌蛋白胨。高压灭菌媒体。高压灭菌后琼脂,冷却,直到温度显示54°C.添加以下解决方案:25毫升1M磷酸钾缓冲液1毫升1 M的硫酸镁( 硫酸镁 )1毫升1 M氯化钙( 氯化钙 ),1毫升乙醇中的胆固醇(5毫克/毫升股票)。

1 M二元K表2 HPO 4174.2克/摩尔:500毫升:在400毫升DDH 2 O,溶解87.1克DibasiC K 2 HPO 4。音量调节至500 L DDH 2 O。过滤消毒使用的500毫升无菌过滤器单元。

1 M一元KH 2 PO 4136.1克/摩尔:1 L:在800毫升DDH 2 O,溶解136.1克一元KH 2 PO 4。音量调节至1 L DDH 2 O。过滤消毒使用的500毫升无菌过滤器单元。

1 M磷酸钾(K 3 PO 4)缓冲液pH 6.0:1升1升的无菌过滤单元,加入868毫升的1 M一元KH 2 PO 4。允许单位来筛选,再加入132毫升的1 M二元K 2 HPO 4。让单位来过滤所有的液体。取出过滤器单元,并调节pH值至6.0。在室温下储存。

S-基肥:1 L:加入50毫升1M K 3 PO 4缓冲液,pH值约为6.0和20毫升5M NaCl溶液。填写1 LDDH 2 O。高压灭菌解决方案。

M9:对于1升:3克KH 2 PO 4,6克Na 2 HPO 4,5克NaCl,1毫升1M的用MgSO 4,H 2 O的填写DDH 2 0 1 L。高压灭菌消毒。

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Representative Results

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本地化模式的GFP :: EGL-4英寸的AWC长时间气味曝光之前和之后的一个例子示出在图2中。在此之前长时间的气味曝光,GFP :: EGL-4定位于细胞质中的AWC(图2B),80分钟后,气味暴露GFP :: EGL-4定位于细胞核内的AWC(图2D)。在行为层面上,与胞内GFP :: EGL-4 AWC动物被吸引到一个点源的气味( 图2C图形代表的趋化实验结果的不适应动物-注意的趋化指数接近1)。表现出核GFP :: EGL-4中的AWC的动物不会被吸引到一个点源的适应气味( 图2E图表代表从适于动物的趋化实验结果-注意的趋化指数是接近零)。为了产生气味引起的核易位检测统计上显着的数据,实验应该运行至少3次,并在不同的日子。对于趋化测定的详细说明,它可能是有用参阅JOVE文章2490 14。

一旦EGL-4进入细胞核的AWC的神经元,它会导致稳定和长期持久的变化在AWC生理坚持即使EGL-4不再是在细胞核中(图3)。 80分钟后,气味暴露动物会忽略的适应气味( 图3上图,左灯条),与此相适应,坚持120分钟后恢复( 图3上面板,在右侧的光棒)的点光源。 80分钟后,气味暴露GFP:EGL-4在细胞核中观察到的AWC( 图3下部面板,在左侧的光棒)。这种核项目是必要的和足以引起长期适应的AWC 5的 。经过120分钟的恢复,这些动物不再具有核GFP :: EGL-4( 图3下图,右灯条),但仍然会忽略在行为层面的适应气味甲醛的点光源。

图1
图1概述的协议,用于长期臭味诱导核易位测定。首先,表达绿色荧光蛋白的动物:: EGL-4(pyIs500动物)在25°C培养接种OP50 E. NGM板大肠杆菌 。其次,动物暴露于一种气味适应混合(实验组)或S-基底缓冲液(对照组)。第三,动物得分盲目地在AWC和数量的动物表现出细胞质GFP :: EGL-4中的AWC的数量进行计数的动物表现出核GFP :: EGL-4。

图2
图2。 。6与奥哈洛伦许可图2B。在此之前长时间的气味暴露,GFP :: EGL-4定位于细胞质中的AWC。 图2C。在行为层面上,动物与胞内GFP :: EGL-4 AWC被吸引到一个点酸ce的气味。这个图表是从代表产生的不适应动物的趋化实验结果。注意的趋化指数是接近1。 图2D,80分钟后,气味曝光GFP :: EGL-4被定位到细胞核的AWC 图2E的动物表现出核GFP :: EGL-4中的AWC不会被吸引到一个点源的适应的气味。这个图表是从适应动物的趋化实验产生的有代表性的结果。注意的趋化指数是接近于零。

图3
图3。一旦EGL-4进入细胞核的AWC的神经元,它会导致稳定和长期持久的变化在AWC生理坚持即使EGL-4不再在细胞核中。动物的气味(80分钟)被允许恢复从长期的气味曝光,取得了细胞质与核GFP :: EGL-4的国产化。 (上图)80分钟暴露于气味的动物,经过120分钟的恢复仍然适用的行为。 (下面板)120分钟后恢复动物暴露于80分钟气味不再表现出核的GFP :: EGL-4。因此,核EGL-4调用长期稳定持久的生理变化的AWC后,坚持EGL-4不再是在细胞核中。图被修改许可Lee 等人 。5。 图3上面板 。 80 min后的气味暴露动物将忽略的适应气味的点源,与此相适应将坚持即使经过120分钟的恢复图3下部面板 。 80分钟后,气味暴露GFP :: EGL-4在细胞核中的AWC观察。这种核项目是必要的,足以引起长期适应的AWC。 120分钟后恢复,这些动物不再具有核GFP :: EGL-4还忽略了一个点源代码RCE在行为层面的适应气味的甲醛。

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Discussion

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这里描述的气味诱导核项目的GFP标记的EGL-4分子提供了一个强大的分子C.嗅觉适应中读出的线虫 。气味引起的核易位检测很简单,只需要几天的准备时间。 pyIs500,我们已经建立了这些实验动物,表达了标记,这说明了的AWC神经元以及表达GFP标记的EGL-4蛋白。因此,我们认为,实验者可以非常迅速,几乎没有工作经验这一类的神经元(也许是经检查几十动物)后开始感觉很舒服,确定正确的核与细胞质EGL-4细胞和评分。这可能是有用的朱庇特的读者参阅第835介绍了GFP分析C.线虫 15。

为了确保生成的数据是最高质量的,我们建议以下准则:1)所有的得分应该做盲目; 2)培养板包含任何的污染(细菌或真菌)的痕迹可以不被使用; 3)蠕虫病毒,经验丰富的饥饿培养过程中应该从来没有被使用;和4)适应混合必须被制成新鲜上实验当天。

所有的感官系统表现出神经元可塑性的例子。到细胞核的信号传输是一个高度保守的特征的稳定形式的神经元可塑性16。通过开发嗅觉可塑性的分子读出的核易位的PKG在受刺激的神经元中,我们提供了一个平台,快速和详细的解剖内的体内模型神经元的可塑性。使用我们的嗅觉适应的分子读出,我们已开始描述的一些事件,塑造嗅觉适应性C.线虫5,6,7。然而,这仅仅是一个开始,而这一过程中,一个函数的研究GE,性别,感染,或饮食中,我们可能会发现在电路和系统级的神经可塑性的重要主题。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

我们想感谢斯科特·哈密尔顿,奥哈洛伦实验室的成员,仔细阅读这篇稿子。我们也感谢匿名审稿人很好的建议和有见地的意见。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Agar Difco DF0140-07-4 NGM plates
Sodium Chloride Fisher Chemical S671-10 NGM plates
Bacto Peptone Difco DF0118-07-2 NGM plates
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Chemical S375-500 S-Basal buffer and NGM plates
Potassium Phosphate Monobasic Fisher Chemical P285-500 S-Basal buffer and NGM plates
Kimwipes - Small Kimberly-Clark LS2770
Ethanol 100% Gold Shield Chemical Co. 43196-115 diluting odors for chemotaxis assays
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C8106-500G NGM plates
Magnesium Sulphate MP Biomedicals 150136-500G NGM plates
Sodium Azide 99% Fisher Scientific ICN10289180 Anesthetic
Agarose - UltraPure Invitrogen 16500-500 Agarose pads
Benzaldehyde Sigma-Aldrich B1334-100G AWC odor
Butanone, ACS Grade Sigma-Aldrich 360473-500ML AWC odor
Microcentrifuge Tubes - 1.5 ml Colored Denville LS8147
Pasteur Pipet Disposable Glass 5-3/4" Fisher Scientific 13-678-20B
Stratalinker Stratagene Stratalinker 2400 UV integration
Filter Vacuum Bottle - 500 ml Nalgene 09-740-25B

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References

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He, C., Lee, J. I., L'Etoile, N., O'Halloran, D. A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans. J. Vis. Exp. (70), e4443, doi:10.3791/4443 (2012).

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