人类胚胎干细胞传代的色调线与胰蛋白酶

Summary

在这个视频中，我们展示了我们的实验室常规通道与胰蛋白酶色调人类胚胎干细胞系。

Abstract

在这个视频中，我们展示了我们的实验室常规通道与胰蛋白酶色调人类胚胎干细胞系。人类胚胎干细胞是细胞培养的产物，并倾向于收购与高人口倍增的异常核型。正确的传代是保持一个健康的，未分化，核型正常的色调的人类胚胎干细胞培养的关键。首先，扩大文化是在PBS洗涤，以去除残留的媒体和的细胞碎片，然后将细胞覆盖一个温暖的0.05％胰蛋白酶EDTA的最小量。胰蛋白酶是留给长达五分钟的细胞，然后细胞被轻轻抛下一个2ML血清吸管。细胞悬液与色调媒体的大量收集和混合，然后收集细胞，轻轻离心。胰蛋白酶灭活媒体混合物被删除，细胞悬浮预热色调媒体。一个适当的分流比计算（一般为1:10至1:20），和细胞到1-2天老照射的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层细胞单层板重新镀金。新种子的色调培养板，左为48小时不受干扰，然后媒体是每天更换其后。重要的是不要trpsinize单细胞悬液，因为这增加了引进核型异常的风险。

Protocol

一般我们建议解冻在一个给定的的时间不超过一个样本，以确保容易处理。处理程序应注意不要长时间留在室温和低二氧化碳的文化。所有活细胞的离心是在室温下5分钟在500-600 XG。 MEFs（小鼠饲养层细胞） 预温MEF的媒体至37 ° C。删除MEF的小瓶从-80 ° C，并立即淹没在37℃水浴试管底部的一半。细胞解冻80％（左小冻结部分）之前，需要大约30-45秒。…

Discussion

在这个视频中，我们证明我们定期通过色调如何在我们的实验室中的人类胚胎干细胞系。高效和定期的分裂和传代是保持一个健康的人类胚胎干细胞系的关键。胰蛋白酶介导的通过是一个色调细胞系的显着优势，但是，重要的是不要过分trypsinize文化或有一个单细胞的过程中再platting大的比重。

Materials

HuES media 651.5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6.5 ml GlutaMAXTM 6.5 ml NEAA 6.5 ml 2‐mercaptoethanol 0.5ul KO Serum Replacement 65 ml Plasmanate 65 ml bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml