MATIZ Passaging-tronco embrionárias humanas Cell-linhas com Tripsina

Summary

Neste vídeo mostramos como nosso laboratório rotineiramente passagens MATIZ linhas de células-tronco embrionárias com tripsina.

Abstract

Neste vídeo mostramos como nosso laboratório rotineiramente passagens MATIZ linhas de células-tronco embrionárias com tripsina. Células estaminais embrionárias humanas são artefatos da cultura celular, e tendem a adquirir anormalidades cariotípicas com duplicações populacional. Passaging adequada é essencial para manter uma alimentação saudável, indiferenciado, tons karyotypically normais embrionárias humanas de cultura de células-tronco. Primeiro, uma cultura em expansão é lavado em PBS para remover a mídia residuais e restos celulares, em seguida, as células são cobertas com um volume mínimo de 0,05% quente Tripsina-EDTA. Tripsina é deixado sobre as células por até cinco minutos, e depois as células são delicadamente desalojado com uma pipeta 2 mL sorológicos. A suspensão de células é coletada e misturada com um grande volume de mídia matizes, em seguida, as células são coletadas por centrifugação suave. A mistura de tripsina inativada mídia é removido e as células ressuspendidas em meio pré-aquecido matizes. Uma razão de separação adequada é calculada (geralmente 1:10 – 1:20), e células re-banhado em uma placa 1-2 dia de idade contendo uma monocamada de células irradiadas do mouse alimentador embrionárias fibroblastos. A placa de cultura recém-semeado matizes é deixado em repouso por 48 horas, então a mídia é trocada a cada dia depois disso. É importante não trpsinize para baixo a uma suspensão de células individuais, pois isso aumenta o risco de introdução de anormalidades cariotípicas.

Protocol

Geral Recomendamos descongelamento não mais do que uma amostra em um determinado momento para garantir uma fácil manipulação. O manipulador deve tomar cuidado para não deixar culturas à temperatura ambiente e baixas emissões de CO2 por longos períodos de tempo. Todos os centrifugação de células vivas é feito em 500-600 xg por 5 min à temperatura ambiente. MEFs (células embrionárias de camundongos Feeder) Pré-aquecer media MEF a 37 ° C. R…

Discussion

Neste vídeo demonstramos como nós MATIZ rotineiramente passagem humana linhas de células-tronco embrionárias em nosso laboratório. Divisão eficiente e regular e passaging é essencial para manter uma saudável linha de células estaminais embrionárias humanas. Tripsina passagem mediada é uma vantagem significativa de linhas de células MATIZ, no entanto, é importante não para mais de trypsinize culturas ou ter uma grande proporção de células isoladas durante a re-tecendo.

Materials

HuES media 651.5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6.5 ml GlutaMAXTM 6.5 ml NEAA 6.5 ml 2‐mercaptoethanol 0.5ul KO Serum Replacement 65 ml Plasmanate 65 ml bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml