Zamrażanie komórek ES człowieka

Summary

Tutaj pokazujemy, jak w naszym laboratorium zawiesza barwy linii ludzkich zarodkowych komórek macierzystych.

Abstract

Tutaj pokazujemy, jak w naszym laboratorium zawiesza barwy linii ludzkich zarodkowych komórek macierzystych. Zdrowa, gwałtownie rozwijającej się kulturze jest przemywano PBS w celu usunięcia resztek mediów, które mogłyby zaspokoić Trypsyna reakcji. Ocieplane 0,05% trypsyny-EDTA dodaje się następnie na pokrycie komórek, a płyta pozostawiono do inkubacji przez 5 min w temperaturze pokojowej. W tym czasie komórki można zaobserwować zaokrąglania, i kolonie podnoszenia z powierzchni płyty. Delikatne powtarzane pipetowania usunie komórek i kolonie z powierzchni płyty. Trypsyny komórki są umieszczane w standardowej rury stożkowej zawierającej ogrzana mediów HES komórki, aby ugasić trypsyny pozostałych, a następnie obrócił. Komórki zawieszano mediów wzrost w stężeniu około miliona komórek w jednym ml mediów, takim stężeniu, że zamrożone porcji wystarcza do wskrzeszenia kultury na talerz 10cm. Po komórek są odpowiednio zawiesza, lodem mediów zamrażania dodaje się równą objętością. Zawiesin komórkowych są dokładnie wymieszać, dzielić na równe objętości do zamrożenia fiolki i mogą powoli zamarznąć na-80C w ciągu 24 godzin. Zamrożone komórki można następnie przeniósł się do fazy gazowej ciekłego azotu do długotrwałego przechowywania, lub pozostać w temperaturze -80 do około sześciu miesięcy.

Protocol

1. Zdrowa, gwałtownie rozwijającej się kulturze jest przemywano PBS w celu usunięcia resztek mediów, które mogłyby zaspokoić Trypsyna reakcji.
2. Ocieplane 0,05% trypsyny-EDTA dodaje się następnie na pokrycie komórek, a płyta pozostawiono do inkubacji przez 5 min w temperaturze pokojowej. W tym czasie komórki można zaobserwować zaokrąglania, i kolonie podnoszenia z powierzchni płyty.
3. Delikatne powtarzane pipetowania usunie komórek i kolonie z powierzchni płyty.
4. Trypsyny komórki są umieszczane w standardowej rury stożkowej zawierającej ogrzana mediów HES komórki, aby ugasić trypsyny pozostałych, a następnie obrócił.
5. Komórki zawieszano mediów wzrost w stężeniu około miliona komórek w jednym ml mediów.
6. Po komórek są odpowiednio zawiesza, lodem mediów Zamrażanie jest dodana w równej objętości.
7. Zawiesin komórkowych są dokładnie wymieszać, dzielić na równe objętości do zamrożenia fiolki i mogą powoli zamarznąć na-80C w ciągu 24 godzin.
8. Zamrożone komórki można następnie przeniósł się do fazy gazowej ciekłego azotu do długotrwałego przechowywania, lub pozostać w temperaturze -80 do około sześciu miesięcy.

Uwaga: takie zamrożone porcji w stężeniu 106 komórek / ml jest wystarczający do wskrzeszenia kultury na talerz 10cm.

Discussion

Technika opiszemy na zamrożenie barwy linii komórkowych działa dobrze dla efektywnego przechowywania i przebudziła barwy linii komórkowych, a także wszelkie komórek ssaków interesów. Zamrażanie niewielki odsetek komórek w każdym fragmencie jest ważnym czynnikiem podczas pracy z linii HES komórek, jak zaburzenia kariotypu może powstać i nieprawidłowych komórek, mogą szybko przejąć linię. Tak więc, zamrożone dzieli na każdym fragmencie Oprócz dużych banków w niektórych fragmentach jest wysoce pożądane.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
HuES Medium	medium			For a total of 651.5 mL, add: 500 mL KO-DMEM + 6.5 mL PenStrep + 6.5 mL L-Glut + 6.5 mL NEAA 6.5 mL + beta-mercapt–thanol 0.6 µL (14.3 M stock) + 65 mL Serum Replacement + 65 mL Plasmanate + 0.65 mL bFGF2 (~10 ng/mL final)
Freezing Medium	medium			80% FCS (fetal calf serum) + 20% DMSO (dimethyl sulfoxide). Stored at 4 °C.