Invriezen menselijke embryonale stamcellen

Summary

Hier laten we zien hoe onze lab TINTEN menselijke embryonale stamcellijnen bevriest.

Abstract

Hier laten we zien hoe onze lab TINTEN menselijke embryonale stamcellijnen bevriest. Een gezonde, exponentieel groeiende cultuur wordt gewassen met PBS om de resterende media die anders zouden kunnen blussen van de Trypsine reactie te verwijderen. Opgewarmd 0,05% trypsine-EDTA wordt dan toegevoegd aan de cellen te dekken, en de plaat mag incuberen tot maximaal 5 minuten bij kamertemperatuur. Gedurende deze tijd-cellen kunnen worden waargenomen afronding, en kolonies tillen uit het plaatoppervlak. Gentle herhaald pipetteren zal verwijderen cellen en kolonies van de plaat oppervlak. Getrypsiniseerd cellen zijn geplaatst in een standaard conische buis met een voorverwarmde hES cell media om de resterende trypsine te lessen, en dan gesponnen. Cellen worden geresuspendeerd groei media bij een concentratie van ongeveer een miljoen cellen in een ml van media, een concentratie zodanig dat een bevroren hoeveelheid is voldoende om een ​​cultuur leven in te blazen op een 10cm plaat. Na de cellen voldoende geresuspendeerd, is ijskoud bevriezen media toegevoegd gelijk volume. Celsuspensies worden grondig gemengd, in hoeveelheden verdeeld in invriezen flesjes, en liet langzaam bevriezen tot-80C gedurende 24 uur. Bevroren cellen kunnen dan verplaatst naar de dampfase van vloeibaar stikstof voor langdurige opslag, of blijven bij -80 gedurende ongeveer zes maanden.

Protocol

1. Een gezonde, exponentieel groeiende cultuur wordt gewassen met PBS om de resterende media die anders zouden kunnen blussen van de Trypsine reactie te verwijderen.
2. Opgewarmd 0,05% trypsine-EDTA wordt dan toegevoegd aan de cellen te dekken, en de plaat mag incuberen tot maximaal 5 minuten bij kamertemperatuur. Gedurende deze tijd-cellen kunnen worden waargenomen afronding, en kolonies tillen uit het plaatoppervlak.
3. Gentle herhaald pipetteren zal verwijderen cellen en kolonies van de plaat oppervlak.
4. Getrypsiniseerd cellen zijn geplaatst in een standaard conische buis met een voorverwarmde hES cell media om de resterende trypsine te lessen, en dan gesponnen.
5. Cellen worden geresuspendeerd groei media bij een concentratie van ongeveer een miljoen cellen in een ml media.
6. Na de cellen voldoende geresuspendeerd, is ijskoud Invriezen Media toegevoegd gelijk volume.
7. Celsuspensies worden grondig gemengd, in hoeveelheden verdeeld in invriezen flesjes, en liet langzaam bevriezen tot-80C gedurende 24 uur.
8. Bevroren cellen kunnen dan verplaatst naar de dampfase van vloeibaar stikstof voor langdurige opslag, of blijven bij -80 gedurende ongeveer zes maanden.

Let op: zo'n bevroren hoeveelheid bij een concentratie van 106 cellen / ml is voldoende om een ​​cultuur leven in te blazen op een 10cm plaat.

Discussion

De techniek die we beschrijven voor het invriezen van TINTEN cellijnen werkt goed voor het efficiënt opslaan en herrijzen TINTEN cellijnen en ook alle zoogdiercellen van belang. Invriezen een klein deel van de cellen op elke passage is een belangrijke overweging bij het werken met hES cellijnen, als karyotype afwijkingen kunnen ontstaan ​​en abnormale cellen kunnen zich snel nemen over de lijn. Dus, met bevroren splitst bij elke passage naast de grote banken op bepaalde passages is zeer wenselijk.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
HuES Medium	medium			For a total of 651.5 mL, add: 500 mL KO-DMEM + 6.5 mL PenStrep + 6.5 mL L-Glut + 6.5 mL NEAA 6.5 mL + beta-mercapt–thanol 0.6 µL (14.3 M stock) + 65 mL Serum Replacement + 65 mL Plasmanate + 0.65 mL bFGF2 (~10 ng/mL final)
Freezing Medium	medium			80% FCS (fetal calf serum) + 20% DMSO (dimethyl sulfoxide). Stored at 4 °C.