Ikke-invasiv vurdering af mikrovaskulære og endotelfunktion

Summary

Capillaroscopy er en non-invasiv, relativt billig metode til direkte visualisering af mikrocirkulationen. Underarmen blodgennemstrømning teknik giver accepterede ikke-invasive foranstaltninger af endotelfunktion.

Abstract

Forfatterne har anvendt capillaroscopy og underarm blodgennemstrømningen teknikker til at undersøge den rolle, microvascular dysfunktion i patogenesen af ​​kardiovaskulær sygdom. Capillaroscopy er en non-invasiv, relativt billig metode til direkte visualisering af mikrocirkulationen. Procent kapillar rekruttering vurderes ved at dividere den øgede kapillære densitet induceret af postocclusive reaktiv hyperæmi (postocclusive reaktiv hyperæmi kapillær densitet minus baseline kapillær densitet), med den maksimale kapillær densitet (observeret under passiv venøs okklusion). Procent perfunderet kapillærer repræsenterer andelen af ​​alle kapillærer stede, der perfunderes (funktionelt aktivt), og beregnes ved at dividere postocclusive reaktiv hyperæmi kapillær densitet med den maksimale kapillær densitet. Både procent kapillar rekruttering og procent perfunderet kapillærer afspejler antallet af funktionelle kapillærer. Underarmen blodgennemstrømning (FBF) teknikken provides accepteret ikke-invasive foranstaltninger af endotelfunktion: Forholdet FBF _max / _FBF-basen er beregnet som et estimat af vasodilation, ved at dividere middelværdien af de fire FBF _max værdier ved gennemsnittet af de fire FBF _{værdigrundlag.} Underarmen vaskulær modstand ved maksimal vasodilation (FVR _max) beregnes som det gennemsnitlige arterielle tryk (MAP) divideret med FBF _max. Både capillaroscopy og underarm teknikker er let acceptabel for patienterne og kan læres hurtigt.

Den mikrovaskulær og endotelfunktion måler opnået under anvendelse af de metoder, der er beskrevet i dette dokument kan have fremtidig nytte i kliniske patientsituationer kardiovaskulære risikobegrænsende strategier. Som vi har offentliggjort rapporter, der påviser, at mikrovaskulær og endotel dysfunktion findes i de indledende faser af hypertension, herunder prehypertension, kan mikrovaskulære og endotelfunktion foranstaltninger i sidste ende hjælpe med tidlig identifikation, Risiko-stratificering og forebyggelse af slutstadiet vaskulær patologi, med dens potentielt fatale konsekvenser.

Protocol

Case Præsentation (påkrævet, hvis relevant): NA, det er stadig en eksperimentel forskning procedure, der endnu ikke er brugt klinisk.

Diagnose, vurdering, og Plan (påkrævet, hvis relevant): NA, det er stadig en eksperimentel forskning procedure, der endnu ikke er brugt klinisk.

Procedure (påkrævet): Denne del skal omfatte en trin-for-trin beskrivelse af relevante procedurer, der opfylder nedenstående retningslinjer.

1. Kapillær Microscopy (figur 1)

1. Vores capillaroscopy teknik blev tilpasset fra Serne og hans kolleger ^1. En udelukkelse kriterium for denne procedure er collagen vaskulær sygdom, da kollagen vaskulær sygdom producerer kendte kapillære ændringer ^2.
2. Efter en minimum 10-timers faste natten over og 20 min af siddende hvile, er mikrovaskulære målinger foretaget for en halv time mellem 7og 11 am, i en rolig, temperaturreguleret rum (opretholdt mellem 21,5-22,5 ° C), med emnet i den siddende stilling og venstre hånd på hjertet niveau.
3. Nailfold kapillærer i den dorsale hud af den tredje finger visualiseres ved hjælp af et stereomikroskop (Olympus, Center Valley, PA), der er forbundet til en 4 megapixel SPOT Insight monokrom digital kamera (modelnummer i-1400: Diagnostiske Instrumenter, Sterling Heights, MI), og en bærbar computer (Dell Latitude D600: Dell, Austin, TX). At begrænse bevægelse, er den venstre hånd og underarm løst dækket med et foldet tæppe, og hvilede på et andet foldet tæppe placeret ved bunden af ​​mikroskopet.
4. Nailbed belysning opnås med en 250 W halogenlampe fiberoptisk lyskilde (KL 2500LCD: Schott-Fostec, Elmsford, NY), supplerende belysning fra en supplerende 150W fiberoptisk halogen lyskilde (B & B Mikroskop, Ltd, Warrendale, PA) anvendes i mørkt pigmenterede individer.
5. At visualisere kapillærer,3,2 x objektiv (Olympus 3.2/0.07) anvendes med et samlet system, forstørrelse 38.4x.
6. Brug SPOT imaging software, der leveres med kameraet, lys / mørk kontrast i de kapillære fotografier øges ved brug af samme standard SPOT software funktion (strækning af lyse og mørke niveauer) for at maksimere synligheden af ​​kapillærer i alle fag.
7. For at kvantificere kapillær densitet, er digitale fotomikrografier taget hver 3-5 sekunder under hver af de tre etaper, hvilende baseline, under postocclusive reaktiv hyperæmi, og i løbet af venøs okklusion. (A) At hvile baseline, der fotomikrografier overtaget en periode på tre minutter til at opdage kapillærer perfunderet i hvile. (B) Under postocclusive reaktiv hyperæmi, er mikrofotografier taget for at kvantificere funktionelt perfunderet kapillærer (baseline plus reserve kapillærer), som følger. For det første er en okklusion manchetten på venstre overarm oppustet til 40 mm Hg over systolisk tryk i 10 minutter. Mikrofotografier derefter taget under the første minut umiddelbart efter frigivelse af arteriel okklusion, visualisere alle funktionelt perfunderet kapillærer. Lavere kapillær densitet efter reaktiv hyperæmi indikerer nedsat funktion kapillær rekruttering, og derfor funktionelt rarefaction. (C) første Veneokklusion mikrofotografier er taget for at kvantificere maksimal kapillær densitet, som omfatter både perfunderede (med aktiv røde blodlegemer (RBC) bevægelse) og nonperfused (fyldt med stagnerende, ikke-bevægelige RBC'er) kapillærer ³ som følger. Efter ti minutters hvile efter postocclusive reaktiv hyperæmi procedure, er manchetten pustes op til 60 mm Hg i 60 sek, passivt tvinge blod i alle patenter kapillærer til stede og mikrofotografier blev taget i løbet af denne tid. Da maksimal kapillær densitet omfatter alle kapillærerne strukturelt til stede, en reduktion i maksimal kapillær densitet indikerer strukturel rarefaction.
8. Kapillær densitet er defineret som antallet af kapillærer per square millimeter af nailfold hud, og beregnes som gennemsnittet af fire målinger opnået fra de fire mest tydeligt fokuserede billeder, mindst fordrejes af bevægelse. I vores undersøgelser, har typiske værdier for kapillære tællinger (kapillærer / mm ²⁾ været 55-80 for baseline, 65-90 til post-iskæmisk, og 90-105 for venøs okklusion. Værdier for procent kapillar rekruttering er typisk mellem 5% og 25% (gennemsnit ~ 10-15%) og for procent perfunderet kapillærer mellem 70% og 95% (gennemsnit ~ 80-90%), med værdier er lavere blandt hypertensive end normotensive. Reproducerbarheden af den tælle procedure er blevet verificeret med tre observatører, som udførte uafhængige manuelle vurderinger af fotografier af 10 forskellige emner (figur 2). Observatørerne blev blindet til identiteten og blodtryk af disse fag. Efter træning, viste de efterfølgende tællinger udført uafhængigt en høj grad af enighed. Gennemsnitlige inter-Rater og intra-rater uoverensstemmelser var af order på 2-3 kapillærer / mm ² og intraclass korrelationskoefficienter blev alle større end 0,90. Kortvarig variation af capillaroscopy foranstaltninger var af samme størrelsesorden som inter-Rater og intra-rater uoverensstemmelser (ca. 2 kapillarer / mm ^2), men på længere sigt variation observeret over 2-3 år var en størrelsesorden større (ca. 15 kapillærer / mm ^2), hvilket indikerer, at længdeændringer kan let skelnes fra rater variation. Pålideligheden af ​​de to kapillære funktion foranstaltninger var også høj (intraclass korrelationskoefficient = 0,84 for procent kapillær rekruttering og 0,82 for procent perfunderet kapillærer).

9. Efterforskerne nu udnytte en computer-baseret metode til kvantificering kapillær densitet ved hjælp af Image-Pro Plus imaging software (Version 6,2, Media Kybernetik, Inc., Bethesda, MD: Figur 3). Pearson korrelationer mellem baseline, post-iskæmisk, og venoos overbelastning tæller gjort med softwaren og tilsvarende manuelle tællinger i 10 forsøgspersoner var 0,78, 0,78, og 0,71 henholdsvis (alle p <0,05), hvilket indikerer en rimelig aftale mellem de to metoder. Pålideligheden af ​​de edb-baserede tællinger er lidt lavere end for manuelle optællinger, men stadig høj (intraclass korrelationskoefficient = 0,91 for baseline, 0,86 til post-iskæmisk, og 0,84 for venøs okklusion). Vi har upublicerede data også viser foreningen af ​​automatiserede tæller med flere kardiovaskulære risikofaktorer herunder forhøjet blodtryk, som vi forbereder i øjeblikket med henblik på offentliggørelse.

10. Tabel 1 opsummerer de kapillære densitet målinger og beregninger. Procent kapillar rekruttering vurderes ved at dividere den øgede kapillære densitet induceret af postocclusive reaktiv hyperæmi (postocclusive reaktiv hyperæmi kapillær densitet minus baseline kapillær densitet), med den maksimale kapillær densitet (observeret under passive venoos okklusion). Procent perfunderet kapillærer repræsenterer andelen af ​​alle kapillærer stede, der perfunderes (funktionelt aktivt), og beregnes ved at dividere postocclusive reaktiv hyperæmi kapillær densitet med den maksimale kapillær densitet. Både procent kapillar rekruttering og procent perfunderet kapillærer afspejler antallet af funktionelle kapillærer. Lavere værdier for disse foranstaltninger viser funktionel kapillær rarefaction.

2. Endotelfunktion Assessment

1. Endotelfunktion vurderes før og efter postocclusive reaktiv hyperæmi, under anvendelse af ikke-invasive plethysmografi målinger af underarmen blodgennemstrømning, ifølge fremgangsmåden af Sivertsson, ^4, som anvender den endothelium-afhængig stimulering af reaktiv hyperæmi at fremkalde vasodilation.
2. Med motivet i siddende stilling efter 10 min af liggende hvile, strakte et kviksølv-in gummi strain gauge til 10% over dens hvile længde er loopes around individets underarm 5 cm under antecubital fossa.
3. The strain-gauge er forbundet til en plethysmograf (EF-4: DE Hokanson, Inc, Bellevue, WA), som igen er forbundet til en Doppler-optager (CW-1; DE Hokanson, Inc, Belleveue, WA).
4. En overarm okklusion manchetten anvendes, og armen er ophængt komfortabelt på hjerte niveau ved hjælp af en slynge bandage forbundet til en justerbar intravenøs pol. Systolisk og diastolisk blodtryk og hjertefrekvens opnås med en Dinamap ProCare 100 automatisk BP manchet (GE Healthcare, Piscataway, NJ) er placeret på den modsatte arm.
5. En pædiatrisk manchetten omkring håndleddet pustes op til 200 mm Hg at okkludere strømning til hånden. Den øverste arm manchet er oppumpet til 50 mm Hg, deflateret i 1,5 sek, og derefter igen pustes hurtigt forud for hver underarm blod flowmåling, opnået gennem udbygning af følerne placeret rundt om underarmen.
6. Underarmen blodgennemstrømning (FBF) måles hvile baseline (FBF _base) og igen ent postocclusive hyperæmi-induceret maksimal vasodilation (FBF _max). For baseline blodgennemstrømningen målinger, er fire på hinanden følgende FBF kurver opnået inden for 30 sekunder (FBF _base).
7. Okklusionen manchetten oppustes derefter til 40 mm Hg over systolisk tryk i 10 minutter. Efter frigivelse af arterieokklusion (postocclusive reaktiv hyperæmi), er fire på hinanden følgende FBF kurver inden for de første 30 sekunder af flow (FBF _max).
8. Forholdet FBF _max / FBF _basen beregnes som et estimat af vasodilatation, ved at dividere gennemsnittet af de fire FBF _max-værdier fra gennemsnittet af de fire FBF _{værdigrundlag.} ^Fem Underarm vaskulær modstand ved maksimal vasodilation (FVR _max) beregnes som middel arterietryk (MAP) divideret med FBF _max. FBF _max ved reaktiv hyperæmi er direkte relateret til FBF efter maksimal infusion af intraarteriel acetylcholin, en endotel-afhængig vasodilator. ⁶ max og forholdet FBF _max / FBF _basen accepteret ikke-invasive foranstaltninger af endotelfunktion. ^{6-8 i} øvrigt både FBF _max og FVR _max afspejler modstand arterie strukturelle ændringer (øget væg / lumen forhold). ⁹

Representative Results

Forskelle i udseendet af mikrovaskulaturen mellem normotensive og hypertensive personer er indlysende ved at sammenligne figurerne 4 og 5. Figur 4 viser den typiske net af lige kapillærer i godt organiseret rækker i en normotensive individ. I modsætning hertil viser figur 5 et mere disarranged mønster af krympede, coiled kapillærer.

Forfatterne har en vedvarende interesse i rollen microvascular dysfunktion i patogenesen af ​​kardiovaskulær sygdom. I deres første NIH / NHLBI tilskud, held forfatterne samlet en kohorte af 200 individer, herunder normotensive, prehypertensive, og hypertensive fag, og udførte en række undersøgelser på mikrovaskulære dysfunktion (kapillært rarefaction og endotelfunktion foranstaltninger). Personer i denne kohorte var i alderen 18 til 55, var 60% kvinder, 46% African American, og 61% prehypertensive (n = 122). Vi har offentliggjort rapporter fra denne kohorte viser, at mikrovaskulære dysfunktion er fundet i de indledende faser af hypertension (prehypertension og Trin 1 hypertension:. Detaljer tidligere offentliggjorte ^{10, 11} Mens tværsnit, vores resultater viser, at den hypertensive vaskulære patologiske proces er allerede i gang på beskedne niveauer af blodtryksforhøjelse, hvilket antyder, at mikrovaskulære dysfunktion kan forud udviklingen af ​​kronisk vedvarende hypertension.

Kapillær densitet = antal af kapillærer per kvadrat millimeter (mm 2) af finger nailfold hud Resting baseline: kontinuerligt perfunderes kapillærer 1 Postocclusive reaktiv hyperæmi: kontinuerligt perfunderes + intermitterende perfunderede (funktionel reserve) kapillærer, måling af kapillær-funktion 1 Veneokklusion (maximal kapillær densitet): maksimal visualisering af hele kapillærerne stede, herunder både perfunderede (med aktiv røde blodlegemer (RBC) bevægelse) og nonperfused (fyldt med stagnerende, ikke-bevægelige RBC'er) kapillærer, måling af kapillær struktur 3

Procent kapillar rekruttering = (BA) ÷ C x 100 [Postocclusive reaktiv hyperæmi kapillær densitet - hvilende baseline kapillær densitet] ÷ Maksimal kapillær densitet (under passiv venøs overbelastning) Måling af kapillar funktion Procent perfunderet kapillærer = (B ÷ C) x 100 Postocclusive reaktiv hyperæmi kapillær densitet ÷ Maksimal kapillær densitet (under passiv venøs overbelastning) Måling af kapillar funktion

Tabel 1. Foranstaltninger af kapillærstrukturog funktion.

Figur 1. Capillaroscopy. Diagnostisk undersøgelse af kapillærer, især af sømmet senge, med et mikroskop.

Figur 2. Capillaroscopy billeder. Counting i hånden. Boxed noteret område er udarbejdet ved hjælp af en Staedler engineering lineal og betegner 1 kvadratmillimeter.

Figur 3. Computer-Assisted Capillaroscopy. Image-Pro software bruges til at øge kontrasten (eksempel til højre) i de oprindelige digitale billeder (eksemplet til venstre), som derefter kan tælles ved hjælp af softwaren.

Figur 4. Capillaroscopy image: normotensive individ.

Figur 5. Capillaroscopy image: Hypertensiv individ.

Discussion

Capillaroscopy (kapillar mikroskopi) er en ikke-standardiseret mål for kapillær struktur. Imidlertid i øjeblikket, er der ingen standardmetoder til direkte vurdering af kapillær structure.Furthermore, er kapillær mikroskopi været meget anvendt til direkte vurdering af capillarydensity i et stort og voksende publiceret arbejde ^{12, 13, 10, 11, 14-18} . Derudover har vi valideret den kapillære mikroskopi teknik ved at korrelere capillaroscopy resultater med underarmen blodgennemstrømning, et veletableret mål for vaskulær ^{funktion, 10, 11} og med UAE, en veletableret mål for karskade (udgivet værk, manuskript under udarbejdelse) . Mens den oprindelige metode benytter kontinuerlig visualisering ved hjælp af video fotografering, vores forenklede metode udnytter stadig digitale fotografier taget gentagne gange over minutter, som beskrevet i procedurerne sektion.

Selv om det er teoretisk korrekt, at peak kapillær densitet coUld blive undervurderet eller savnet hjælp stillbilleder til at tælle kapillærer uden en kørende videobånd til at henvise til, at vi udnytter de stillbilleder taget i hurtig rækkefølge i 1 minut under spidsbelastning reaktiv hyperæmi efter frigivelse af manchetten, der specifikt tælle de første fire billeder således opnåede som skulle give de maksimale post-iskæmiske kapillære tæller. Endvidere er det blevet rapporteret, at ved anvendelse af en længere periode med overarmen iskæmi ved suprasystolic tryk i adskillige minutter, kan den hyperæmi respons vare i 3-4 minutter i raske mindste, i modsætning til kun 10 sekunder efter 1 minut okklusion med en finger manchet. ¹⁹

Vi gjorde tilpasninger til den teknik Serne et al for to grunde: 1). Primært for at gøre teknikken mere praktisk og tilgængelig til brug i både en klinisk og klinisk forskning indstilling, og 2) At tættere afspejle den metode, vi har brugt til validere teknikken som virksomring vores resultater med dem, der findes i underarmen plethymography teknik, som er en etableret metode til evaluering af vaskulære funktion. Vi anvendte en manchetten i stedet for digitale manchetter, som ikke er let tilgængelige i USA. Også som angivet ovenfor kan anvendelsen af ​​overarmen versus digital iskæmi resultere i en mere langvarig hyperæmi respons, udlån sig lettere at fange af toppen hyperæmi respons til analyse. Placering af iskæmi manchetten på overarmen i stedet for underarmen resulterer i større hyperæmi strømning (som følge af højere brachialarterien vasodilatation. ^6. Ved udformningen af den teknik, vi undersøgte litteraturen til den mest passende varighed arterieokklusion. Vi fandt perioder fra 3 minutter ^{fra 19} til 5 minutter ^{4, 6, 8} til 13 minutter, ^{20, 21} med en af undersøgelser under anvendelse af 13 minutter rapporterer god reproducerbarhed af det derved fremkomne. Endnu en anden undersøgelse viste øge blodgennemstrømningen med udtagningreasing okklusion tid. ²² Derfor valgte vi 10 minutter som en mellemliggende værdi.

Vi har indført den nye parameter, procent kapillar rekruttering, som udtrykker kapillær rekruttering som en procent af det maksimale antal visualiseret under venøs occlusion, i et forsøg på at normalisere det antal rekrutteret fartøjer ved at dividere med det samlede antal af kapillarer til stede, muliggør direkte sammenligning af det samlede antal af aktivt perfunderede (funktionel) kapillærer mellem individer. Vi har også rapporteret om de mere udbredte parametre (kapillært rekruttering og venøs okklusion) i vores publikationer til dato.

Vor teknik anvender en lavere forstørrelse (38,4 x) sammenlignet med den for andre rapporteret i tidligere litteratur. Den kapillær densitet rapporteret af James / Shore et al ²³ (98-117 per mm ²⁾ og Antonios ^12, som også bruger høj forstørrelse 196X (fra 57 til 93 pr0,68 mm ²⁾ er faktisk højere. Men opnåede Debbabi / Levy ²⁴ kapillære tætheder (60-79) næsten identiske med vores (55-74), ved hjælp 200x forstørrelse. Vores tællinger er faktisk højere end salget fra Serne et al. ^25, der brugte 100x forstørrelse (48-57). Dette kan i det mindste delvis skyldes den kendsgerning, at det absolutte antal fartøjer pr feltet reduceres i kraftigere forstørrelse, hvilket gør det vanskeligere at identificere et begrænset antal fartøjer sygdom. Derudover vores brug af 38.4x forstørrelse producerer digitale billeder fra hvor vi kan få flere tilstødende klare felter ⁴ uden behov for yderligere behandling (reduktion eller forstørrelse) af billederne.

I vores undersøgelser har vi valgt at undersøge kapillærer i det perifere kredsløb, som er let tilgængelige i hånden ved hjælp af en simpel stereomikroskop, og let kan studeres uden brug af intravenøs farvestof injektion. ²⁶ 24, 27, med ingen data om kapillær rarefaction i sorte forsøgspersoner rapporterede før vores resultater. Brug af dobbelte lyskilder og foto-styrke software beskrevet i metoderne, er vi i stand til at visualisere og kvantificere kapillærer i alle indrullerede forsøgspersoner, herunder mørkt pigmenterede sorte.

Sammenfattende er capillaroscopy en non-invasiv, relativt billig metode til direkte visualisering af mikrocirkulationen. Både capillaroscopy og underarm teknikker er let acceptabel for patienterne og kan læres hurtigt. Den mikrovaskulær og endotelfunktion måler opnået under anvendelse af de metoder, der er beskrevet i dette dokument kan have fremtidig nytte i kliniske patientsituationer kardiovaskulære risikobegrænsende strategier. Som vi har offentliggjort rapporter, der påviser, at mikrovaskulær og endotel dysfunktion findes i de indledende faser af hypertension herunder prehypertension, capillaroscopy og venøs okklusion plethysmografi i sidste ende kan hjælpe med tidlig identifikation, risiko-stratificering og forebyggelse af slutstadiet vaskulær patologi, med dens potentielt fatale konsekvenser.