Avaliação não invasiva da função microvascular e endotelial

Summary

Capilaroscopia é uma metodologia não-invasiva, relativamente barato para a visualização direta da microcirculação. O antebraço técnica de fluxo de sangue proporciona aceitos não invasivos medidas da função endotelial.

Abstract

Os autores utilizaram capilaroscópicas e antebraço técnicas de fluxo de sangue para investigar o papel da disfunção microvascular na patogênese da doença cardiovascular. Capilaroscopia é uma metodologia não-invasiva, relativamente barato para a visualização direta da microcirculação. Recrutamento por cento capilar é avaliada através da divisão do aumento na densidade capilar induzida por postocclusive HR (HR postocclusive densidade capilar menos densidade basal capilar), a densidade máxima por capilar (observado durante a oclusão venosa passiva). Por cento capilares perfundidos representa a proporção de todas as que estão presentes capilares perfundidos (funcionalmente activa), e é calculada dividindo a densidade postocclusive HR capilar pela densidade máxima capilar. Tanto o recrutamento por cento por cento capilar e perfundidos capilares refletem o número de capilares funcionais. O fluxo de sangue do antebraço (FBF), técnica provides aceite não invasivos medidas da função endotelial: A relação _{de base} FBF _max / FBF é calculada como uma estimativa de vasodilatação, dividindo-se a média dos quatro valores FBF _max por a média dos quatro valores de _base FBF. Resistência vascular no antebraço vasodilatação máxima (FVR _max) é calculado como a pressão arterial média (PAM), dividido pela FBF _max. Ambos capilaroscopia e técnicas do antebraço são facilmente aceitável para os pacientes e pode ser aprendido rapidamente.

A função endotelial microvascular e medidas obtidas utilizando as metodologias descritas neste documento podem ter utilidade futura em clínicas de pacientes de risco cardiovascular estratégias de redução. Como já publicados relatórios que demonstram que a disfunção endotelial microvascular e são encontrados em estágios iniciais de hipertensão, incluindo a pré-hipertensão, medidas de função endotelial microvascular e pode eventualmente ajudar na identificação precoce, Estratificação de risco e prevenção da fase final da patologia vascular, com suas consequências potencialmente fatais.

Protocol

Apresentação de Caso (exigida, se aplicável): NA, este ainda é um procedimento de pesquisa experimental, ainda não utilizados clinicamente.

Avaliação, Diagnóstico e Plano (obrigatório, se aplicável): NA, este ainda é um procedimento de pesquisa experimental, ainda não utilizados clinicamente.

Procedimento (obrigatório): Esta parte deve incluir uma descrição passo-a-passo dos procedimentos relevantes, atendendo as orientações abaixo.

1. Microscopia capilar (Figura 1)

1. A nossa técnica capilaroscopia foi adaptado a partir serne e seus colegas ^1. Um critério de exclusão para este procedimento é a doença vascular do colagénio, desde doenças do colágeno vascular produz conhecidas alterações capilares ^2.
2. Após um jejum de 10 horas durante a noite e no mínimo 20 minutos de descanso sentada, medições microvasculares são realizados para uma meia hora entre 7e 11 horas, em uma sala com temperatura tranquila, controlada (mantida entre 21,5-22,5 ° C), com o assunto na posição sentada e da mão esquerda na altura do coração.
3. Periungueal capilares na pele dorsal do terceiro dedo são visualizadas em um estereomicroscópio (Olympus; Center Valley, PA), ligado a uma introspecção SPOT 4 megapixels monocromático câmera digital (Número do Modelo IN-1400: Instrumentos de Diagnóstico; Sterling Heights, MI), e um computador portátil (Dell Latitude D600: Dell; Austin, TX). Para limitar o movimento, a mão esquerda e antebraço são frouxamente tapado com um cobertor dobrado, e repousou no outro cobertor dobrado posicionado na base do microscópio.
4. Iluminação leito ungueal é conseguida com uma lâmpada de fibra de 250 W halogéneo óptica (KL 2500LCD: Schott-FOSTEC; Elmsford, NY); iluminação adicional a partir de uma fibra de 150W suplementar fonte de luz óptica halogéneo (B & B microscópios, Ltd., Warrendale, PA) é usado em indivíduos pigmentadas.
5. Para visualizar os vasos capilares, o3.2x objectivo (Olympus 3.2/0.07) é usado com um sistema de amplificação total de 38.4x.
6. Usando o software de imagens SPOT fornecido com a câmera, luz / escuridão contraste nas fotografias capilar é reforçada com a função mesmo software padrão SPOT (alongamento dos níveis de claro e escuro) para maximizar a visibilidade dos capilares em todas as disciplinas.
7. Para quantificar a densidade capilar, fotomicrografias digitais são tiradas a cada 3-5 segundos, durante cada uma das três fases, na linha de base de descanso, durante a hiperemia reativa postocclusive, e durante a oclusão venosa. (A) No início do estudo descanso, fotomicrografias são tomadas durante um período de três minutos para detectar capilares perfundidos em repouso. (B) Durante a hiperemia reativa postocclusive, fotomicrografias são levados para quantificar capilares funcionalmente perfundidos (linha de base mais reserva de capilares), como segue. Em primeiro lugar, uma braçadeira de oclusão no braço esquerdo é inflada até 40 mm Hg acima da pressão arterial sistólica, durante 10 min. Fotomicrografias são então levados durante thprimeiro minuto e imediatamente após o lançamento de oclusão arterial, visualizando todos os capilares funcionalmente perfundido. Menor densidade capilar após hiperemia reativa indica prejudicada recrutamento funcional capilar, e, portanto, rarefação funcional. (C) Durante fotomicrografias oclusão venosa são levados para quantificar a densidade capilar máxima, que inclui tanto a perfusão (com glóbulo vermelho ativo (RBC) de movimento) e nonperfused (cheio de estagnado, sem movimento hemácias) capilares ^{3 da} seguinte forma. Depois de dez minutos de descanso após o procedimento reativa postocclusive hiperemia, o manguito do braço é inflado a 60 mm Hg para 60 seg, passivamente forçando o sangue para todos os presentes capilares patente e fotomicrografias foram tomadas durante este tempo. Uma vez que a densidade capilar máxima inclui todos os capilares estruturalmente presente, uma redução máxima na densidade capilar indica rarefação estrutural.
8. A densidade capilar é definida como o número de capilares por quadrado millimeter de pele periungueal, e é calculado como a média de quatro medições obtidas a partir de quatro imagens mais claramente definidas, pelo menos distorcida pelo movimento. Nos nossos estudos, os valores típicos para as contagens capilar (capilares / mm ²⁾ foram 55-80 para linha de base, 65-90 para o pós-isquémica, e 90-105 para a oclusão venosa. Os valores para o recrutamento por cento capilar são, tipicamente, entre 5% e 25% (média de ~ 10-15%), e para os capilares perfundidos por cento entre os 70% e 95% (média de ~ 80-90%), com valores sendo menor entre hipertensos do que normotensos. A reprodutibilidade do processo de contagem foi verificada com três observadores independentes que realizaram as avaliações manuais de fotografias de 10 indivíduos diferentes (Figura 2). Os observadores foram cegos para a pressão de identidade e do sangue destes assuntos. Após o treinamento, conta subseqüentes realizadas de forma independente mostrou um alto nível de concordância. Média de discrepâncias inter e intra-avaliadores eram da order de 2-3 capilares / mm ^2, e os coeficientes de correlação intraclasse foram todos maiores do que 0,90. Curto prazo variação das medidas capilaroscópicos foram da mesma ordem de grandeza que as discrepâncias inter-e intra-observador (aproximadamente 2 capilares / mm ^2), mas a longo prazo a variação observada ao longo de 2-3 anos era uma ordem de magnitude maior (cerca de 15 capilares / mm ^2), indicando que as alterações longitudinais podem ser facilmente distinguidas das variações de avaliadores. Confiabilidade das duas medidas função capilar também foi alta (coeficiente de correlação intraclasse = 0,84 por cento para o recrutamento capilar e 0,82 por cento para os capilares perfundidos).

9. Os investigadores agora utilizar um método baseado em computador para quantificar a densidade capilar utilizando-Image Pro Plus software de imagem (Versão 6.2, Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD: Figura 3). Correlações de Pearson entre linha de base, pós-isquêmica, e venocontagens de nós de congestionamento feitas com o software e os correspondentes contagens manuais em 10 indivíduos foram de 0,78, 0,78, e 0,71, respectivamente (todos p <0,05), indicando boa concordância entre os dois métodos. Fiabilidade das contagens baseados em computador é um pouco menor do que a contagem de manuais mas ainda elevada (coeficiente de correlação intraclasse = 0,91 para linha de base, 0,86 para o pós-isquémica, e de 0,84 para a oclusão venosa). Temos também dados inéditos que demonstram a associação de contagens automatizadas com múltiplos fatores de risco cardiovasculares, incluindo hipertensão, o que estamos preparando para publicação.

10. A Tabela 1 resume as medições da densidade capilar e cálculos. Recrutamento por cento capilar é avaliada através da divisão do aumento na densidade capilar induzido pela HR postocclusive (postocclusive densidade capilar menos hiperemia reativa de linha de base da densidade capilar), a densidade máxima de capilar (observado durante passivo venonos oclusão). Por cento capilares perfundidos representa a proporção de todas as que estão presentes capilares perfundidos (funcionalmente activa), e é calculada dividindo a densidade postocclusive HR capilar pela densidade máxima capilar. Tanto o recrutamento por cento por cento capilar e perfundidos capilares refletem o número de capilares funcionais. Os valores mais baixos para estas medidas indicam rarefação capilar funcional.

2. Avaliação da função endotelial

1. A função endotelial é avaliada antes e após a hiperemia reativa postocclusive, utilizando medições não invasivas pletismografia de fluxo sanguíneo do antebraço, de acordo com o método de Sivertsson ^4, que utiliza o estímulo endotélio-dependente de HR para induzir vasodilatação.
2. Com o tema na posição sentada após 10 minutos de descanso em decúbito dorsal, um de mercúrio em medidor de tensão de borracha esticado para 10% além do seu comprimento de repouso for repetido around o assunto do antebraço de 5 cm abaixo da fossa antecubital.
3. O calibre de tensão está ligado a um pletismógrafo (EC-4: DE Hokanson, Inc; Bellevue, WA), o qual por sua vez está ligado a um registador de Doppler (CW-1; DE Hokanson, Inc; Belleveue, WA).
4. Uma braçadeira de oclusão superior do braço é aplicado, e o braço é suspenso confortavelmente ao nível do coração utilizando uma atadura funda ligado a um pólo ajustável intravenosa. Sistólica e diastólica e freqüência cardíaca são obtidos com um 100 automático Dinamap ProCare manguito BP (GE Healthcare, Piscataway, NJ) colocado no braço oposto.
5. Um manguito pediátrico em torno do punho é inflado para 200 mm Hg para ocluir o fluxo para o lado. A braçadeira é insuflada superior a 50 mm Hg, esvaziado para 1,5 seg, e, em seguida, re-inflado rapidamente antes de cada medição do fluxo sanguíneo do antebraço, obtido por meio da expansão do medidor de tensão colocado ao redor do antebraço.
6. Fluxo de sangue do antebraço (FSA) é medido no início descansou (FBF _base) e novamente umat vasodilatação induzida por hiperemia postocclusive máxima (FBF _max). Para as medições da linha de base do fluxo sanguíneo, quatro curvas consecutivas FBF são obtidos dentro de 30 seg (FBF _base).
7. A braçadeira de oclusão é então inflada até 40 mm Hg acima da pressão arterial sistólica, durante 10 min. Após a libertação da oclusão arterial (HR postocclusive), quatro curvas FBF consecutivos são obtidos dentro dos primeiros 30 segundos de fluxo (FBF _max).
8. A proporção _{de base} FBF _max / FBF é calculado como uma estimativa da vasodilatação, dividindo-se a média dos quatro valores FBF _max pela média dos quatro valores de _base FBF. Antebraço ⁵ Resistência vascular na vasodilatação máxima (FVR _max) é calculado como a pressão arterial média (PAM) dividido pela FBF _max. FBF _máximo durante hiperemia reativa está diretamente relacionada à FBF após a infusão máxima de intra-arterial de acetilcolina, um vasodilatador endotélio-dependente. ⁶ máximo ea relação FBF _{base de max} / FBF são aceites medidas não invasivas da função endotelial. ^6-8 Além disso, tanto a FBF _{max max} e FVR refletir as mudanças de resistência das artérias estruturais (aumento do índice de parede / lúmen). ⁹

Representative Results

Diferenças na aparência da microvasculatura entre normotensos e hipertensos são prontamente evidentes ao comparar as Figuras 4 e 5. Figura 4 mostra a rede de capilares normal reto em filas bem organizadas em um indivíduo normotenso. Em contraste, a Figura 5 mostra um padrão mais desordenada de encolhido, enrolada capilares.

Os autores têm interesse em curso no papel da disfunção microvascular na patogênese da doença cardiovascular. Em sua primeira NIH / NHLBI concessão, os autores montado com sucesso uma coorte de 200 indivíduos, incluindo normotensos, assuntos pré-hipertensos e hipertensos, e realizou uma série de investigações sobre a disfunção microvascular (rarefação capilar e medidas de função endotelial). Indivíduos deste grupo variaram na idade de 18-55, eram do sexo feminino de 60%, 46% Africano-americanos, e 61% PREHypertensive (n = 122). Nós publicamos relatórios desta coorte demonstrando que a disfunção microvascular é encontrado em estágios iniciais de hipertensão (pré-hipertensão e hipertensão estágio 1:. Detalhes publicados anteriormente ^{10, 11} Embora transversal, nossos achados indicam que o processo patológico vascular hipertensiva já está em andamento no níveis modestos de elevação da pressão arterial, sugerindo que a disfunção microvascular pode preceder o desenvolvimento de hipertensão sustentada crônica.

Densidade capilar = número de capilares por milímetro quadrado (mm2) de pele periungueal dedo Base de repouso: capilares perfundidos continuamente um Hiperemia reativa Postocclusive: continuamente perfundidos + intermitentemente perfundido (reserva funcional) capilares; medida da função capilar 1 Oclusão venosa (maximal densidade capilar): visualização máxima de todos os presentes capilares, incluindo tanto perfundido (com células de sangue vermelho ativo (RBC) de movimento) e nonperfused (cheio de estagnado, sem movimento hemácias) capilares; medida da estrutura capilar 3

Recrutamento por cento capilar = (BA) ÷ C x 100 [Postocclusive densidade capilar hiperemia reativa - densidade base repouso capilar] ÷ Densidade capilar máxima (durante congestão venosa passiva) Medida da função capilar Por cento capilares perfundidos = (B ÷ C) x 100 Postocclusive densidade capilar hiperemia reativa ÷ Densidade capilar máxima (durante congestão venosa passiva) Medida da função capilar

Tabela 1. Medidas da estrutura capilare função.

Figura 1. Capilaroscopia. Exame de diagnóstico de capilares, especialmente dos leitos das unhas, com um microscópio.

Figura 2. Imagens capilaroscópicos. Contando com a mão. Área encaixotada observou é desenhado com uma régua de engenharia Staedler e denota um milímetro quadrado.

Figura 3. Computer-Assisted capilaroscopia. Software Image-Pro é usado para melhorar o contraste (por exemplo à direita) nas imagens digitais originais (por exemplo, à esquerda), que podem então ser contadas utilizando o software.

Figura 4. Imagem capilaroscopia: individual normotensos.

Figura 5. Imagem capilaroscopia: individual hipertensiva.

Discussion

Capilaroscopia (microscopia capilar) é uma medida não-padrão da estrutura capilar. No entanto, atualmente, não existem métodos padronizados para avaliação direta da structure.Furthermore capilar, microscopia capilar tem sido amplamente utilizado para a avaliação direta de capillarydensity em um corpo grande e crescente de trabalhos publicados ^{12, 13, 10, 11, 14-18} . Além disso, validamos a técnica de microscopia capilar, correlacionando as alterações capilaroscópicas com fluxo antebraço sangue, uma medida bem estabelecida da função ^{vascular, 10, 11} e com Emirados Árabes Unidos, uma medida bem-estabelecida de lesão vascular (trabalho inédito, manuscrito em preparação) . Enquanto a metodologia original utiliza visualização contínua usando a fotografia de vídeo, nossa metodologia simplificada utiliza ainda fotografias digitais tiradas repetidamente ao longo de minutos, conforme detalhado na seção de procedimentos.

Embora seja verdade que, teoricamente, co densidade capilar picoULD ser subestimada ou perdeu usando imagens estáticas para contar capilares sem uma fita de vídeo em execução para se referir, nós utilizamos as imagens estáticas tiradas em rápida sucessão por 1 minuto durante o pico de liberação hiperemia reativa seguinte do manguito, especificamente contando as quatro primeiras fotos assim obtidos, que deverá fornecer as máximas pós-isquêmicos conta capilares. Além disso, tem sido relatado que, ao utilizar um período de tempo prolongado de isquemia braço superior à pressão suprasystolic durante vários minutos, a resposta a hiperemia podem durar 3 a 4 minutos, em indivíduos saudáveis, no mínimo, ao contrário de somente 10 segundos após 1 minuto, com oclusão um cuff dedo ^19.

Fizemos adaptações à técnica de serne et al, por duas razões: 1.) Principalmente para tornar a técnica mais prática e acessível para utilização tanto em ambientes de pesquisa clínica e clínica, e 2) para reflectir mais intimamente a metodologia que temos utilizado para validar a técnica por compatocar nossos resultados aos encontrados na técnica plethymography antebraço, que é um método estabelecido para a avaliação da função vascular. Utilizou-se um punho de braço no lugar dos punhos digitais, que não se encontram facilmente disponíveis nos Estados Unidos. Além disso, como mencionado acima, a utilização do braço superior versus isquemia digital pode resultar numa resposta mais prolongada hiperemia, prestando-se mais facilmente para capturar a resposta de hiperemia pico para análise. Colocação do manguito isquemia no braço superior, em vez de os resultados do antebraço de fluxo maior hiperemia (resultante da vasodilatação maior artéria braquial. ⁶ No desenvolvimento da técnica, foi pesquisado na literatura para o período mais adequado da oclusão arterial. Descobrimos períodos que vão desde 3 minutos ^19-5 minutos ^{4, 6, 8} a 13 minutos, ^{20, 21,} com um dos estudos utilizando 13 minutos relatando boa reprodutibilidade dos valores assim obtidos. Ainda um outro estudo mostrou aumento do fluxo sanguíneo com increasing tempo de oclusão ^22. Assim, optamos por 10 minutos como um valor intermediário.

Introduzimos o novo parâmetro, o recrutamento capilar por cento, a qual expressa o recrutamento capilar como uma percentagem do número máximo visualizado durante a oclusão venosa, na tentativa de normalizar o número de vasos recrutados dividindo pelo número total de capilares presente, permitindo a comparação directa do número total de activa perfundido (funcional) capilares entre os indivíduos. Nós também relataram os parâmetros mais utilizados (recrutamento capilar e oclusão venosa) em nossas publicações até à data.

A nossa técnica utiliza uma baixa ampliação (38,4 x) em comparação com a de outros descritos na literatura anterior. A densidade capilar relatado por James et al / Shore ²³ (98-117 por mm ²⁾ e Antonios ^12, que também usa alta ampliação 196x (57-93 por0,68 milímetros ²⁾ são, de facto mais elevada. No entanto, Debbabi / Levy ²⁴ obtidas densidades capilares (60-79) quase idênticos aos nossos (55-74), com aumento de 200x. Nossos conta são realmente superiores aos relatados por serne et al. ^25, que usou 100x (48-57). Este pode ser, pelo menos parcialmente, devido ao facto de que o número absoluto de vasos por campo é reduzido a uma ampliação maior, tornando-se mais difícil de identificar um número reduzido de navios em doença. Além disso, o uso de ampliação 38.4x produz imagens digitais a partir do qual podemos obter vários campos adjacentes claras ⁴ sem necessidade de processamento adicional (redução ou ampliação) das imagens.

Nas nossas investigações, optamos por estudar capilares na circulação periférica, que estão prontamente acessíveis na ponta dos dedos, utilizando-se um estereomicroscópio simples, e pode ser facilmente avaliada, sem a utilização de injecção de corante por via intravenosa ^26. 24, 27, sem dados sobre rarefação capilar em indivíduos negros relataram antes de nossos achados. Usando as fontes de luz dupla e foto de melhoria de software descritos nos métodos, somos capazes de visualizar e quantificar capilares em todos os sujeitos matriculados, incluindo os negros pigmentadas.

Em resumo, a capilaroscopia é um não-invasivo metodologia, relativamente barato para visualizar diretamente a microcirculação. Ambos capilaroscopia e técnicas do antebraço são facilmente aceitável para os pacientes e pode ser aprendido rapidamente. A função endotelial microvascular e medidas obtidas utilizando as metodologias descritas neste documento podem ter utilidade futura em clínicas de pacientes de risco cardiovascular estratégias de redução. Como já publicados relatórios que demonstram que a disfunção microvascular e endoteliais encontram-se na fase inicial da Hypertension incluindo capilaroscopia pré-hipertensão, e pletismografia de oclusão venosa podem eventualmente ajudar na identificação precoce, estratificação de risco e prevenção da fase final da patologia vascular, com suas consequências potencialmente fatais.