Summary
在这里，我们描述了雪旺氏细胞（SC）迁移试验中，SC的方向发展，延长轴突。
Abstract
周围神经的发展是一个有趣的过程。神经元发出的轴突支配特定的目标，这在人类的神经元胞体距离超过100厘米。在开发过程中的神经元的存活取决于目标源性生长因子，但也支持雪旺氏细胞（SC）的。为此的SC ensheath轴突从突触或神经肌肉接头的神经元的细胞体（或外周神经系统从中央到过渡）的区域。雪旺氏细胞的神经嵴衍生工具，作为前体以及新兴轴突迁移，直到整个轴突覆盖公务员事务局局长。这表明外周神经系统的发展的SC迁移的重要性，并强调研究该过程的必要性。为了分析SC发展，需要设置下到南海，也包括他们的生理底物的迁移，轴突。由于宫内发育
Protocol
1。胶原蛋白凝胶的制备
- 准备一个股票介质，含455微升10倍MEM，112微升7.5％ 碳酸氢钠 ，50μL谷氨酰胺和NaOH。的浓度和的NaOH的量取决于对大鼠尾胶原制备（见1.2），最终体积为1,000微升股票介质。
- 制备鼠尾胶原根据到Ebendal（1）。胶原溶液在4℃下存放不能观察到甲降解的胶原溶液。新一批准备后，估计需要的股票介质（见1.1）NaOH的浓度。使用的pH指示剂的培养基的量和浓度的NaOH滴定。 800μL酸性鼠尾胶原蛋白210μL的股票介质混合时，把一个红色阴影。如果的NaOH的浓度太低，则胶原溶液会变黄，由于介质的pH指示剂。介质和混合添加的胶原蛋白无产品ucing泡沫。在冰上执行这些步骤。该聚合反应发生后，在2小时之内的胶原蛋白溶液和库存介质已被混合和新的解决方案是在37℃下温育测试前开始实验。 1.3）混合800μl的胶原蛋白溶液与210μL，该股中期（见1.2）。将100μl的该溶液中的孔中的8孔室滑动。孵育幻灯片，在37℃，5％CO 2和潮湿的条件下的细胞培养箱中。准备下的胶原蛋白凝胶的细胞培养板凳和无菌条件下。 2小时内的胶原蛋白凝胶化。
2。解剖胚胎SCGS的
- 收获胚胎的时间子宫的孕鼠（E16-18），直到进一步的需要，让他们在PBS。
- 解剖一个胚胎的羊膜。杀头的胚胎尾部的锁骨水平。修正了在硅基底菜头与“昆虫针”。头的腹侧有面对到你的D你看颌下区。的固定能够更轻松地准备。
- 卸下颌下区域左和右的皮肤，并与它的子皮下的结缔组织。
- 删除颌下唾液腺从自己的位置，以清除到舌骨，infrahyoidal的肌肉与胸锁乳突肌的观点。
- 删除这些肌肉，仔细清除到喉头和气管的观点。取出气管和喉部。颈动脉椎前肌肉双方可见。 SCG是位于颈动脉分叉处，有一个椭圆形。小心地取出核，并将其放置在PBS。轻轻地取出神经节，如果他们坚持他们的清扫工具。这是有益的使用钳子的针保持器，以及在SCG去除安装有一个“昆虫针”。
- 一旦在PBS中，存储的神经节，在室温下在PBS中，直到您解剖enouGH节。然后，清洁的神经血管和结缔组织。执行SCG下的层流工作台放置在解剖显微镜下的清扫和清洗。
- 最后，将取出的神经节到凝胶化的胶原蛋白凝胶的帮助下更容易处理的注射器安装在注射器针头。
- 在37℃下，用5％的CO 2和潮湿的条件下孵育SCG的外植体对凝胶化的胶原蛋白在细胞培养箱。
3。 SCG外植体的处理
- 经过1-2小时的潜伏期，包括SCG用100微升的Neurobasal细胞培养液中含B27的补充，谷氨酰胺和抗生素外植体含有胶原蛋白的。立即室玻片的孔中包含的体积为200微升（加入100μl凝胶和100μl培养基）。添加另一200μl的培养基中，但现在含有NGF（60纳克/毫升），以促进轴突生长。因此，最终的NGF浓度为30纳克/毫升。
- 探讨SC迁移的发生，增加额外的因素，直接在体外日0（DIV0）。双人所需浓度（2）含NGF的介质中溶解的因素。
- 为了分析种姓的影响，已经开始沿着轴突迁移，添加额外的因素DIV3直到DIV4（潜在的停止的实验）。为此，小心地取出180微升的解决方案，在DIV3，并加入200μL新培养基中NGF和其他因素的的双浓度（2）。
4。延时成像
使用倒置显微镜进行分析。可以使用的各种目标，定义的字段的视图和放大倍率。然而，一个重要的方面，是所使用的目标的工作距离，SCG外植体的成像进行通过载玻片和胶原凝胶。 1/10-30分钟记录帧速率，显示效果不错（2）。然而，该方面具有被调整到的科学问题。一个正常的CCD摄像头可以被用于图像采集。对于时间推移成像的细胞培养孵育室具有被连接到显微镜的阶段。孵育在成像过程中的组织在37℃下，用5％的CO 2和潮湿的条件下。孵化系统成像开始前一小时开始。这允许显微镜份（ 例如物镜）包括腔室滑动调整的温度和防止温度引起的漂移。定义的特定区域的分析（内的外植体和不同外植体之间），与显微镜的软件和软件控制的机动阶段（多位置设置）用于同时分析不同的应用条件下的SCG外植体的帮助。对于延时成像野生型组织，以及从转基因动物的组织，可以使用标志着在SC（S100B：GFP）（3）。对于成像荧光基团的荧光光源，以实现在micropscope设置。使用标准的过滤器。
5。 SC迁移距离的量化
- 在终点（DIV4例如），修复胶原蛋白凝胶的4％PFA室幻灯片3-4小时。连续洗的胶原凝胶和10分钟，用PBS中的5倍。应用免疫组化（2）的标准协议。如果你是新的编制SCGS，验证身份的神经节作为交感神经节对酪氨酸羟化酶（TH）的一个共同的标记儿茶酚胺细胞的免疫组化。期间免疫组化（初级抗体后）中，外植体的含胶原凝胶转移到24孔板中，其中有一个更大的量，这是有益的洗涤凝胶。
- 免疫组织化学染色后，小心地将胶原凝胶在载玻片上。小心取出剩余的解决方案，让胶原蛋白干/缩小到两个方面。这使得很容易测量的距离（2）。在此之后，装入样品。
- 最后，测量斐济（NIH）软件的帮助下，迁移距离。为此需要任何特殊的插件。为了让正确的测量单位为μm，检查正确的成像元数据和设置在斐济，图像和规模。使用斐济还定量细胞。
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Representative Results
轴突生长促进从SCG外植体处理后，神经生长因子（4）（电影计划，S1 图1计划）。这个过程是很容易可见的任何倒置显微镜可以后跟延时成像（电影S2）。如果科学家是从小鼠胚胎解剖SCG我们强烈建议通过一个简单的抗酪氨酸羟化酶（TH）免疫组化验证的技术。 TH是儿茶酚胺能神经元（在这种情况下，交感神经元）和一个共同的标记也标签轴突（ 图2B）。轴突长度可以通过这种方式进行分析，在该系统中（2）。
更重要的是，被诱导后轴突生长，细胞迁移的浪潮可以被观察到（电影S2和S3）。 S100免疫阳性SC（2）细胞迁移进行了验证。另外的转基因小鼠的线，在这种GFP是人类S10的控制下0b时的启动子片段（3）可以被用来直接分析的标记SC人口（2）（电影S4和S5）。这种转基因行的帮助下，这些实验还可以进行共聚焦光片显微镜（不执行）。
分析SC在迁移过程中，我们建议的分析与轴突密度低（ 图1特写DIV3和DIV4）和单位面积的分析，从而一小口SC。这有利于最好看细胞形态和细胞行为（电影S3）的可能性。
SC迁移距离可以测量的实验结束时（ 例如 DIV4）。要为此DAPI核贴标可以进行固定的组织和距离上领先的SC核的边界外植体可以测量的帮助下，斐济（NIH软件）（ 图2方案和DAPI标记）（2）。此外还SC增殖或SC死亡的可以进行分析。为此，免疫组化pHH3或活化Caspase 3可以执行的，例如，分别为（2）确定有丝分裂或细胞凋亡。
图1 A：从外植SCG随着时间的推移（DIV0 DIV4）计划轴突生长。 B / C：明视场图像，记录SCG DIV3（B）和DIV4（C）（规模杆= 100微米）的外植体在一个区域的特写在时间的推移成像。
图2：A：计划显示SC（蓝色）沿延长轴突（灰色），从外植SCG（淡蓝色）在DIV3与DIV4增长。迁移距离可以测量的DAPI核标记的样本通过在多个位置（C）的边界的取出的SCG，从领先SC细胞核测量的距离。 TH免疫组化（DIV4），应进行一个科学家是新SCG解剖。一个积极的标签清楚地标识为交感神经节（B）取出的神经节。 TH免疫组化的从外植SCGS轴突生长的可以分析。
电影S1。计划过几天在体外的外植SCG轴突生长。 点击这里观看电影 。
电影S2。轴突生长和SC迁移神经生长因子治疗SCG外植体。影像开始在DIV2。录像帧率为1/30分钟。酒吧尺度为100微米。 点击这里观看电影 。
ntent“的> 电影S3。关闭了一个SCG外植体的周边区域。由于低轴突密度SC可以很容易地进行分析。，拍摄开始DIV3。录像帧率为1/10分钟。规模杆= 100微米点击这里观看电影 。电影S4。明场和荧光的组合使S100中GFP阳性SCs和轴突的可视化。录像帧率为1/10分钟。酒吧尺度为100微米。 点击这里观看电影 。
电影S5。SC移植在SCG植的边界。这里只荧光通道S100 GFP阳性种姓能够更容易地解释。录像帧率为1/10分钟。酒吧尺度为100微米。/ 50016/50016movieS5.avi“目标=”_blank“>点击这里观看电影。
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Discussion
外周神经系统的发展，是一个令人兴奋的过程。当开发完成，轴突ensheathed SC的沿其整个长度，可以在人类中，往往是超过百厘米的。为此所需的SC的正确数量的必须建立在开发过程中，也有在SC沿着向周边延伸的轴突，以确保完整的轴突覆盖。这成立有髓神经也为unmeylinated的轴突。在这两种情况下，所有的轴突接触公务员事务局局长，取决于他们的支持。为了研究SC发展，需要测定轴突室考虑，因此模仿体内发展到更好的程度比从头开始测定（5），Boyden小分析（6）或腔室检测可以做。在某些试验中的轴突室中考虑到了。例如坐骨神经的部分被用来作为SC的迁移路线，沿（7，8），或SC的沿其轴突，他们观察到迁移的神经元（9）共培养。
SCG外植体SC迁移实验，然而，更加具有优势。这是特别有趣，因为SC的方向发展自己的生理轴突，而这些都是自己还在不断增长。此外，该技术是简单易学，只需要一个位的技术夹层技能，不需要复杂的共培养体系中的神经元和SC。一个颇为相似的设置，但是不使用，提出了SCGS而是病种付费的Gumy和他的同事（10）。然而，这样的分析，以充分利用的可能性，倒置显微镜设置，需要启用时间的推移成像。有做“多位置实验”的可能性是很重要的，为了能够分析经过不同处理后的SCG位于在腔室中滑动的外植体，在同一时间，使工作与最优控制并排的权益（2）的因素。进行分析，我们只用了传统的光与传统的荧光显微镜转基因S100B：GFP小鼠。然而，该技术也可以很容易地使用共聚焦，甚至光片显微镜（不执行）。时间的推移记录在迁移过程中，可以用来识别特定的细胞特性/行为。到目前为止，只有野生型和转基因小鼠已被使用（2）。然而，转染的种姓，从而改变与RNAi途径，例如应该是可行的。利用这种技术，它甚至可以是可能的分析对SC-轴突相互作用的正常和改变SC上的相同或相邻的轴突。关于迁移的距离，SC增殖和SC生存，终点分析可以很容易地的DAPI核标记的免疫组化和斐济（NIH）软件进行。然而，最终甚至有生命回购RTER增殖（11）和细胞死亡（12，13）可以被使用，从而能够直接读出成像期间。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们要感谢Urmas Arumae共享的胶原蛋白协议和尤塔Fey和厄休拉·欣茨优秀的技术援助。此外，我们想感谢基督教F.阿克曼，乌尔里克·恩格尔和尼康在德国海德堡大学的医学影像中心和约阿希姆·基尔希请帮助视频shoting的。部分资金通过德意志研究联合会（SFB 592）的工作。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x MEM | Gibco | 21430 | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080 | |
| Glutamine | Gibco | 25030 | |
| NaOH | Merck | 109137 | |
| NGF | Roche | 1058231 | R&D#556-NG-100 |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504 | |
| antibiotics | Gibco | 15640 | |
| d-PBS | Gibco | 14040 | |
| insect needles | FST | 26002-20 | |
| syringe needle | Braun | BD # 300013 | |
| 8 well chamber slide | Lab tek | 177402 |
References
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