Summary
Hier beschrijven we een Schwann-cellen (SC) migratie assay waarin SC kunnen ontwikkelen langs axonen verlenging.
Abstract
De ontwikkeling van de perifere zenuwen is een intrigerend proces. Neuronen sturen axonen om specifieke doelen, die bij de mens zijn vaak meer dan 100 cm afstand van de soma van het neuron innerveren. Neuronale overleving tijdens de ontwikkeling afhankelijk doel afgeleide groeifactoren maar ook op de steun van Schwann-cellen (SC). Daartoe SC ensheath axonen uit het gebied van de neuronale soma (of de overgang van centrale naar perifere zenuwstelsel) de synapsen of neuromusculaire junctie. Schwann cellen zijn derivaten van de neurale lijst en migreren als voorlopers langs nieuwe axons totdat de axon is bedekt met SC. Dit toont het belang van SC migratie voor de ontwikkeling van het perifere zenuwstelsel en onderstreept de noodzaak om dit proces te onderzoeken. Met het oog op SC ontwikkeling te analyseren, is een setup nodig die naast de SC's ook hun fysiologische substraat voor migratie, het axon omvat. Door intra-uteriene ontwikkeling
Protocol
1. Bereiding van collageengels
- Bereid een voorraad medium, dat 455 ul 10x MEM, 112 ul 7,5% NaHCO3, 50 pl glutamine en NaOH. De concentratie en de hoeveelheid NaOH afhankelijk van de rat-tail collageen preparaat (zie 1.2), het uiteindelijke volume van de voorraad medium dat 1000 pi.
- Bereid rat-tail collageen volgens Ebendal (1). Sla de collageenoplossing bij 4 ° C. Een verslechtering van de collageenoplossing kon niet worden vastgesteld. Na voorbereiding van een nieuwe partij, een schatting van de NaOH-concentratie die nodig is voor de voorraad medium (zie 1.1). Gebruik de pH-indicator van het medium voor titratie van de hoeveelheid en concentratie van NaOH. 800 ul zure rat-tail collageen moet een kleur rood te zetten wanneer het wordt gemengd met 210 ul van de voorraad medium. Indien de concentratie van NaOH te laag is collageen oplossing geel vanwege de pH indicator van het medium. Voeg de collageen aan het medium en meng zonder proucing bellen. Voer de volgende stappen op het ijs. De polymerisatie binnen 2 uur na de collageenoplossing en stock medium zijn gemengd en de nieuwe oplossing geïncubeerd bij 37 ° C. Test dit voordat een experiment. 1,3) Meng 800 ul van collageen oplossing met 210 ul van voorraad medium (zie 1.2). Plaats 100 ul van deze oplossing in putjes van een 8 goed kamer dia. Incubeer de glaasjes bij 37 ° C, 5% CO2 en vochtige omstandigheden in een celkweek incubator. Bereid de collageen gels onder een celcultuur bank en steriele omstandigheden. Het collageen verstijfselt binnen 2 uur.
2. Dissectie van embryonale SCGS
- Oogst embryo's van de tijd zwangere muizen (E16-18) uit de baarmoeder en bewaar ze in PBS tot nader nodig.
- Prepareer een embryo van het amnion. Onthoofden het embryo caudale van de claviculaire niveau. Bevestig de kop op een silicium onderste schaal met "insect-naalden". De ventrale zijde van het hoofd mee te maken heeft u eend moet je de submandibulaire regio te zien. De fixatie kan gemakkelijker voorbereiding.
- Verwijderen van de huid van de submandibulaire regio links en rechts en daarmee de subcutane bindweefsel.
- Verwijder de submandibulaire speekselklieren van hun locatie om van het uitzicht te wissen op het tongbeen, de infrahyoidal spieren en de m. sternocleidomastoideus.
- Verwijder voorzichtig deze spieren om de weergave te wissen op het strottenhoofd en de luchtpijp. Verwijder de luchtpijp en het strottenhoofd. De halsslagaders zijn dan zichtbaar aan beide kanten op de prevertebrale spieren. De SCG ligt in de bifurcatie van de halsslagader en heeft een ovale vorm. Verwijder voorzichtig de ganglia en plaats ze in PBS. Verwijder voorzichtig de ganglia van de dissectie-instrumenten als ze vasthouden aan hen. Het is gunstig voor forceps en een naaldhouder bevestigd met een "insect naald" voor de SCG verwijderen gebruiken.
- Eenmaal in PBS, slaan de ganglia bij kamertemperatuur in PBS tot ontleed enough ganglia. Reinig vervolgens de achterwortelganglia van bloedvaten en bindweefsel. Voer de SCG dissectie en schoonmaken onder een dissectie microscoop onder een laminaire stroming bank.
- Plaats tenslotte de geëxplanteerde ganglia op het verstijfselde collageen gels met behulp van injectienaalden gemonteerd op een injectiespuit een eenvoudige bediening.
- Incubeer de SCG explantaten op gegelatiniseerde collageen in een celkweek incubator bij 37 ° C met 5% CO2 en vochtige omstandigheden.
3. Behandeling van SCG Explantaten
- Na 1-2 uur incubatie dekking van de SCG explantatie van collageen met 100 ul Neurobasal celcultuur medium dat B27 supplement, glutamine en antibiotica. Nu de putjes van de kamer's bevatten een volume van 200 ul (100 ul gel en 100 ul medium). Voeg een 200 ul van het medium, maar nu met NGF (60 ng / ml) om axonale groei te bevorderen. Dienovereenkomstig de uiteindelijke NGF concentratie 30 ng / ml.
- Om het begin van de SC migratie te onderzoeken, direct toe te voegen bijkomende factoren op dag in vitro 0 (DIV0). Los de factoren in het medium met NGF in de benodigde dubbele concentratie (2).
- Om het effect op SCS die reeds begonnen migreren langs axonen analyseren voeg extra factoren DIV3 tot DIV4 (mogelijke stop van het experiment). Daartoe verwijder 180 ul van de oplossing op DIV3 en voeg 200 ul nieuwe medium dat NGF en andere factoren van belang bij de dubbele concentratie (2).
4. Time-lapse imaging
Gebruik een omgekeerde microscoop voor analyses. Verschillende doelen worden gebruikt, waarin het gezichtsveld en vergroting. Een belangrijk aspect is echter de werkafstand van de gebruikte doel, zoals beeldvorming van de SCG explantaten wordt uitgevoerd door het objectglaasje en collageengel. De opname snelheid van 1/10-30 minuut toonde goede resultaten (2). Echter, dit aspect moet worden aangepast aan de wetenschappelijke vraag. Een normale CCD camera kan worden gebruikt voor beeldopname. Voor time lapse imaging een celkweek incubatiekamer moet worden gehecht aan de objecttafel van de microscoop. Incubeer het weefsel tijdens imaging bij 37 ° C met 5% CO2 en vochtige omstandigheden. Start het incubatiesysteem een uur voor de start van beeldvorming. Hierdoor kan de microscoop delen (bijv. doel) met de kamer dia aanpassen aan de temperatuur en voorkomt temperatuur veroorzaakte drift. Definieer specifieke analyses (binnen explant op en tussen verschillende explantaten) met behulp van de microscoop software en een software-gecontroleerde gemotoriseerde fase (meervoudig setup) voor gelijktijdige analyse van verschillende toegepaste omstandigheden de SCG explantaten. Voor time-lapse imaging wildtype weefsel en weefsel van transgene dieren kunnen worden gebruiktmarkeren van de SCS (S100B: GFP) (3). Voor grafische fluoroforen een fluorescerende lichtbron moet worden geïmplementeerd in de micropscope setup. Gebruik standaard filters.
5. Kwantificering van SC migratie afstanden
- Op het eindpunt (DIV4 bijvoorbeeld), bevestig de collageengels met 4% PFA in de kamer glijbaan voor 3-4 uur. Achtereenvolgens wassen collageengels 5 keer gedurende 10 minuten met PBS. Toepassing standaardprotocollen voor immunocytochemie (2). Als je nieuw bent in de voorbereiding van SCGS, controleert de identiteit van het ganglion als een sympathieke ganglion door immunohistochemie tegen tyrosine hydroxylase (TH) een gemeenschappelijke marker voor catecholaminerge cellen. Tijdens immunohistochemie (na het primaire antilichaam), overdragen bevattende explant collageengels aan platen met 24 putjes, die een groter volume, wat gunstig is voor het wassen van de gels zijn.
- Na immunohistochemie, plaatst u voorzichtig het collageen gels op glasplaatjes. VoorzichtigVerwijder de resterende oplossing en laat het collageen drogen / krimpen tot twee dimensies. Dit maakt een eenvoudige metingen van afstanden (2). Daarna monteert u de monsters.
- Tenslotte meet de migratie afstanden met behulp van Fiji (NIH)-software. Geen speciale plugins nodig daartoe. Om een correcte metingen in micrometer mogelijk te maken, de correcte beeldvorming metadata en de instellingen onder de Fiji-, beeld-en schaal. Ook gebruik maken van Fiji voor de kwantificering van cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Axonale groei wordt vergemakkelijkt van SCG explantaten na behandeling met NGF (4) (film schema S1 figuur 1 schema). Dit proces is gemakkelijk zichtbaar door een omgekeerde microscoop en kan gevolgd worden door time-lapse imaging (film S2). Als een wetenschapper is nieuw voor ontleden SCG van muis embryo's adviseren wij een validatie van de techniek via een eenvoudige anti-tyrosine hydroxylase (TH) immunohistochemie. TH is een gemeenschappelijke marker voor catecholaminergische neuronen (in dit geval sympathische neuronen) en doet ook label axons (Figuur 2B). Op deze wijze axonale lengten kunnen worden geanalyseerd in dit systeem (2).
Belangrijker na axonale groei werd geïnduceerd, kan een golf van migrerende cellen worden waargenomen (film S2 en S3). Migrerende cellen werden gevalideerd als S100 immuno positieve SC (2). Naast een transgene muis lijn, waarbij GFP onder de controle van de menselijke s100b promoter fragment (3) kan worden gebruikt om direct analyseren gemerkte SC populatie (2) (film S4 en S5). Met behulp van deze transgene lijn deze experimenten kan ook worden uitgevoerd met confocale-of lichtwaaier microscopie (hier niet uitgevoerd).
Voor analyses van SC tijdens de migratie, adviseren wij een gebied van analyse met een lage dichtheid axonale (figuur 1 close-up DIV3 en DIV4) en daarmee een kleine populatie van SC per gebied van analyse. Dit vergemakkelijkt de beste mogelijkheden om te zien celmorfologie en cellulaire gedrag (film S3).
SC migratie afstanden worden gemeten aan het einde van een experiment (bijvoorbeeld DIV4). Daartoe DAPI nucleaire etikettering kan worden uitgevoerd op vaste weefsel en afstanden van de toonaangevende SC kernen aan de rand van de explantatie kan worden gemeten met behulp van Fiji (NIH-software) (figuur 2 schema en DAPI etikettering) (2).Daarnaast ook SC SC proliferatie of dood kan worden geanalyseerd. Daartoe immunohistochemie voor pHH3 of geactiveerde Caspase 3 kan worden uitgevoerd bijvoorbeeld mitotische identificeren of apoptotische cellen respectievelijk (2).
Figuur 1 A:. Schema toont axonale groei van een geëxplanteerd SCG na verloop van tijd (DIV0-DIV4). B / C: helderveld beelden, opgenomen in time-lapse imaging geeft close ups van een gedeelte van een SCG explant op DIV3 (B) en DIV4 (C) (schaal bar = 100 urn).
Figuur 2 A:. Regeling met SC (blauw) in lange axonen (grijs), uitgegroeid van een geëxplanteerd SCG (lichtblauw) op DIV3 en DIV4. Migratie afstanden kunnen worden gemeten op DAPI nucleaire-gelabelde monsters door de afstand van de kern van de belangrijkste SC naar de rand van de geëxplanteerde SCG op meerdere locaties (C). TH immunohistochemie (DIV4) moet worden uitgevoerd als er een wetenschapper is nieuw voor SCG dissectie. Een positieve etikettering identificeert duidelijk de geëxplanteerd ganglion als een sympathieke ganglion (B). TH immunohistochemie maakt het ook mogelijk de analyse van axonen gegroeid van geëxplanteerd SCGS.
Movie S1. Regeling met axonale groei van een geëxplanteerd SCG gedurende een aantal dagen in vitro. Klik hier om naar de film te bekijken .
Movie S2. Axonale groei en SC migratie van een NGF behandelde SCG explantatie. Imaging gestart DIV2. Opnamesnelheid was 1/30 min. Schaal-bar = 100 um. Klik hier om film te bekijken .
ntent "> Film S3. Close-up van een perifeer gebied van een SCG explant. Vanwege een lage dichtheid axonale enkele SC kunnen gemakkelijk worden geanalyseerd. Imaging start was DIV3. Opnamesnelheid was 1/10 min. Schaal-bar = 100 um . Klik hier om film te bekijken .Film S4. Helderveld De combinatie van fluorescentie en maakt visualisatie van GFP positieve S100 SC en de axonen. Opnamesnelheid was 1/10 min. Schaal-bar = 100 um. Klik hier om film te bekijken .
Movie S5. SC migratie aan de rand van een SCG explantaat. Hier alleen de fluorescentie kanaal wordt mogelijk eenvoudiger interpretatie van S100 GFP positieve SC's. Opnamesnelheid was 1/10 min. Schaal-bar = 100 um./ 50016/50016movieS5.avi "target =" _blank "> Klik hier om film te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ontwikkeling van het perifere zenuwstelsel een spannend. Wanneer de ontwikkeling is voltooid, worden axons ensheathed door SCS over de gehele lengte, die, in mensen, vaak meer dan 100 cm. Daartoe het juiste aantal vereiste SC moet worden vastgesteld tijdens de ontwikkeling en de SCS ook bewegen langs axonen zich aan de omtrek om de complete axonale dekking te garanderen. Dit geldt voor gemyelineerde maar ook voor unmeylinated axonen. In beide gevallen zijn alle axons in contact met SCS en afhankelijk van hun steun. Om SC ontwikkeling bestuderen assays vereist die nemen axonale compartiment te houden en daarmee de in vivo ontwikkeling nabootsen om een betere mate dan kras assays (5) kan Boyden assays (6) of kamer assays doen. In sommige testen het axonale compartiment is rekening gehouden met reeds. Bijvoorbeeld delen van sciatic zenuwen werden gebruikt als routes voor de SC te migrerenlangs (7, 8) of SC werden samen gekweekt met neuronen waarlangs axons werden waargenomen migreren (9).
De SCG explantaat SC migratie assay heeft echter nog meer voordelen. Het is vooral interessant omdat SC's zijn het ontwikkelen van langs hun eigen fysiologische axonen, en deze zijn zelf nog steeds groeiende. Verder is de techniek is eenvoudig te leren en vereist slechts een beetje technische dissectie vaardigheden en vereist geen ingewikkelde co-cultuur systeem van neuronen en SC. Een vrij gelijkaardige opstelling echter niet gebruikt SCGS maar DRG, werd voorgesteld door Gumy en collega's (10). Echter de volledige mogelijkheden van deze assay benutten, wordt een inverse microscoop setup nodig waarmee time-lapse imaging. Het is belangrijk om de mogelijkheid "multi-positie experimenten" doen, om te kunnen verschillend behandeld SCG explantaten, gelegen in een kamer dia analyseren op dezelfdetijd, waardoor het werken met een optimale beheersing van zij aan zij met de factoren van belang (2). Voor analyseert we alleen conventionele licht-en conventionele fluorescentie (voor transgene S100B: GFP muizen) microscopie. De techniek kan echter ook gemakkelijk worden gebruikt met confocale-of lichtwaaier microscopie (hier niet uitgevoerd). Time-lapse-opnamen kunnen worden gebruikt om specifieke cellulaire eigenschappen / gedragingen te identificeren tijdens de migratie. Dusver alleen wildtype en transgene muizen werden gebruikt (2). Toch moet transfectie van kasten en daardoor verandering van trajecten met RNAi bijvoorbeeld haalbaar. Met deze techniek kan zelfs mogelijk zijn de SC-axon samenspel van normale en veranderde SC analyseren op dezelfde of aangrenzende axon. Wat migratie betreft afstanden, SC proliferatie en SC overleven, kunnen eindpunt analyses gemakkelijk worden uitgevoerd door middel van immunohistochemie met DAPI nucleaire etikettering en Fiji (NIH)-software. Echter, uiteindelijk zelfs het leven-reporter proliferatie (11) en celdood (12, 13) kunnen worden gebruikt, waardoor een directe uitlezing tijdens de beeldvorming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We willen Urmas Arumae bedanken voor het delen van een collageen-protocol en Jutta Fey en Ursula Hinz voor een uitstekende technische bijstand. Verder willen we Christian F. Ackermann, Ulrike Engel en de Nikon Imaging Center van de Universiteit van Heidelberg en ook Joachim Kirsch bedanken voor zo vriendelijk te helpen voor de video shoting. Het werk werd deels gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 592).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x MEM | Gibco | 21430 | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080 | |
| Glutamine | Gibco | 25030 | |
| NaOH | Merck | 109137 | |
| NGF | Roche | 1058231 | R&D#556-NG-100 |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504 | |
| antibiotics | Gibco | 15640 | |
| d-PBS | Gibco | 14040 | |
| insect needles | FST | 26002-20 | |
| syringe needle | Braun | BD # 300013 | |
| 8 well chamber slide | Lab tek | 177402 |
References
- Ebendal, T. Use of collagen gels to bioassay nerve growth factor activity. Rush, R. A. IBRO Handh, John Wiley & Sons Ltd. (1989).
- Heermann, S., SchmÃcker, J., Hinz, U., Rickmann, M., Unterbarnscheidt, T., Schwab, M. H., Krieglstein, K. Neuregulin 1 type III/ErbB signaling is crucial for Schwann cell colonization of sympathetic axons. PloS One. 6 (12), e28692 (2011).
- Zuo, Y., Lubischer, J. L., Kang, H., Tian, L., Mikesh, M., Marks, A., Scofield, V. L. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. The Journal of Neuroscience. The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (49), 10999-11009 (2004).
- Levi-Montalcini, R., Booker, B. EXCESSIVE GROWTH OF THE SYMPATHETIC GANGLIA EVOKED BY A PROTEIN ISOLATED FROM MOUSE SALIVARY GLANDS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 46 (3), 373-384 (1960).
- Meintanis, S., Thomaidou, D., Jessen, K. R., Mirsky, R., Matsas, R. The neuron-glia signal beta-neuregulin promotes Schwann cell motility via the MAPK pathway. Glia. 34 (1), 39-51 (2001).
- Yamauchi, J., Miyamoto, Y., Chan, J. R., Tanoue, A. ErbB2 directly activates the exchange factor Dock7 to promote Schwann cell migration. The Journal of cell biology. 181 (2), 351-365 (2008).
- Anton, E. S., Weskamp, G., Reichardt, L. F., Matthew, W. D. Nerve growth factor and its low-affinity receptor promote Schwann cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2795-2799 (1994).
- Mahanthappa, N. K., Anton, E. S., Matthew, W. D. Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 16 (15), 4673-4683 (1996).
- Yamauchi, J., Chan, J. R., Shooter, E. M. Neurotrophins regulate Schwann cell migration by activating divergent signaling pathways dependent on Rho GTPases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (23), 8774-8779 (2004).
- Gumy, L. F., Bampton, E. T. W., Tolkovsky, A. M. Hyperglycaemia inhibits Schwann cell proliferation and migration and restricts regeneration of axons and Schwann cells from adult murine DRG. Molecular and Cellular Neurosciences. 37 (2), 298-311 (2008).
- Sakaue-Sawano, A., Kurokawa, H., Morimura, T., Hanyu, A., Hama, H., Osawa, H., Kashiwagi, S. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Park, D., Don, A. S., Massamiri, T., Karwa, A., Warner, B., MacDonald, J., Hemenway, C. Noninvasive imaging of cell death using an Hsp90 ligand. Journal of the American Chemical Society. 133 (9), 2832-2835 (2011).
- Shcherbo, D., Souslova, E. A., Goedhart, J., Chepurnykh, T. V., Gaintzeva, A., Shemiakina, I. I., Gadella, T. W. J., Lukyanov, S., Chudakov, D. M. Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins. BMC Biotechnology. 9, 24 (2009).
