Summary
Aqui descrevemos uma célula de Schwann (SC) ensaio de migração em que SCs são capazes de desenvolver ao longo dos axônios estendem.
Abstract
O desenvolvimento de nervos periféricos é um processo intrigante. Neurônios enviam axônios para inervar alvos específicos, que nos seres humanos muitas vezes são mais de 100 cm de distância da soma do neurônio. A sobrevivência neuronal durante o desenvolvimento depende de factores de crescimento derivados alvo, mas também com o apoio de células de Schwann (SC). Para este fim os axônios ensheath SC a partir da região da soma neuronal (ou a transição da central para o sistema nervoso periférico) para a sinapse ou junção neuromuscular. As células de Schwann são derivados da crista neural e migram ao longo de axónios como precursores emergentes até o axónio inteiro é coberto com SCs. Isto demonstra a importância do SC de migração para o desenvolvimento do sistema nervoso periférico e sublinha a necessidade de investigar este processo. A fim de analisar SC desenvolvimento, uma configuração é necessário que ao lado das SCs também inclui seu substrato fisiológico para a migração, o axônio. Devido ao desenvolvimento intra-uterino
Protocol
1. Preparação de géis de colagénio
- Prepara-se uma média de valores, contendo 455 ul de MEM de 10x, 112 ul de 7,5% de NaHCO 3, 50 ul de glutamina e NaOH. A concentração e a quantidade de NaOH depende da preparação de colagénio da cauda de rato (ver 1.2), o volume final do meio de estoque sendo 1000 ul.
- Prepare-colagénio da cauda de rato de acordo com Ebendal (1). Armazene a solução de colagénio, a 4 ° C. A degradação da solução de colagénio não pôde ser observado. Após a preparação de um novo lote, estimar a concentração de NaOH necessária para o meio de stock (ver 1.1). Utilizar o indicador de pH do meio para a titulação da quantidade e da concentração de NaOH. 800 ul colágeno rato-cauda ácida tem que virar um tom de vermelho quando misturado com 210 ul do meio de ações. Se a concentração de NaOH é muito baixa a solução de colagénio ficará amarela, devido a que o indicador de pH do meio. Adicione o colágeno para o meio e misture sem producing bolhas. Execute essas etapas em gelo. A polimerização ocorre dentro de 2 horas após a solução de colagénio e o meio de estoque foram misturados e a nova solução é incubada a 37 ° C. Testar isso antes de iniciar um experimento. 1.3) Misture 800 ml de solução de colágeno com 210 ul de meio de ações (ver 1.2). Coloque 100 ul desta solução nos poços de uma lâmina de câmara 8 também. Incubar as lâminas a 37 ° C, 5% de CO 2 e de condições de humidade numa incubadora de cultura de células. Preparar os géis de colagénio em um banco de cultura de células e condições estéreis. O colagénio é gelatinizado dentro de 2 horas.
2. Dissecação de SCGs embrionárias
- Colheita de embriões em tempo ratas grávidas (E16-18) do útero e mantê-los em PBS até mais necessário.
- Dissecar um embrião a partir do âmnio. Decapitar o caudal embrião do nível clavicular. Fixe a cabeça em um prato fundo de silício com "inseto-agulhas". O lado ventral da cabeça tem de enfrentar a você umaD Você tem que ver a região submandibular. A fixação permite a fácil preparação.
- Remova a pele da região submandibular esquerda e para a direita e com ele o tecido conjuntivo sub-cutânea.
- Retire as glândulas salivares submandibulares de sua localização para limpar a vista para o hióide, os músculos infrahyoidal eo músculo esternocleidomastóideo.
- Remova os músculos cuidadosamente para limpar a vista para a laringe ea traquéia. Remover a traqueia e laringe. As artérias carótidas são, então, visível em ambos os lados sobre os músculos pré-vertebrais. O GCS está localizado na bifurcação das artérias carótidas e tem uma forma oval. Remova cuidadosamente os gânglios e colocá-los em PBS. Remover os gânglios suavemente a partir das ferramentas de dissecação, se forem aderindo a elas. É vantajoso usar uma pinça, bem como um porta-agulhas montado com uma "agulha de insectos" para a remoção do SCG.
- Uma vez em PBS, armazenar os gânglios à temperatura ambiente em PBS até dissecados enougânglios gh. Em seguida, limpe os gânglios dos vasos sanguíneos e tecido conjuntivo. Realizar a dissecção SCG e limpeza sob um microscópio de dissecação colocado debaixo de um banco de fluxo laminar.
- Finalmente, coloque os gânglios explantados para os géis de colagénio gelatinizadas com a ajuda de agulhas de seringa montado em uma seringa para uma manipulação mais fácil.
- Incubar os explantes SCG sobre o colagénio gelatinizado numa incubadora de cultura de células a 37 ° C, com as condições de 5% de CO2 e humidade.
3. Tratamento de Explantes SCG
- Após 1-2 horas de incubação, cobrir o colagénio explante SCG contendo meio de cultura com 100 uL contendo Neurobasal célula B27 suplemento, glutamina e antibióticos. Agora, os poços das lâminas de câmara conter um volume de 200 ul (100 e 100 ul de gel ul de meio). Adicione outro ul 200 do meio, no entanto agora contendo NGF (60 ng / ml) para facilitar o crescimento axonal. Por conseguinte, a concentração final de NGF é de 30 ng / ml.
- Para investigar o aparecimento de SC migração, adicione fatores adicionais diretamente no dia in vitro 0 (DIV0). Dissolver os fatores do meio de NGF contendo em o dobro da concentração necessária (2).
- A fim de analisar o impacto no SCS, que já começaram a migrar ao longo de axônios, adicione fatores adicionais a DIV3 até DIV4 (paragem potencial do experimento). Para este fim, retirar cuidadosamente 180 ul da solução, em DIV3, e adiciona-se 200 ul de meio novo NGF contendo e os factores adicionais de interesse na concentração dupla (2).
4. Lapso de tempo de imagem
Use um microscópio invertido para análises. Diferentes objectivos podem ser usados, que define o campo de visão e ampliação. Um aspecto importante, contudo, é a distância de trabalho do objectivo utilizado, como imagens dos explantes SCG é realizada por meio da lâmina de vidro e o colagéniogel. A taxa de quadros de gravação de 1/10-30 minutos, mostrou bons resultados (2). No entanto, este aspecto tem de ser ajustado para a questão científica. Uma câmara CCD normal pode ser utilizado para a obtenção da imagem. Para imagiologia de lapso de tempo de uma câmara de incubação de células de cultura tem que ser ligado à fase do microscópio. Incubar o tecido durante a imagiologia, a 37 ° C, com as condições de 5% de CO2 e humidade. Inicie a incubação de uma hora antes do início do sistema de geração de imagens. Isto permite que as partes do microscópio (por exemplo, objectivo), incluindo a câmara de corrediça para ajustar a temperatura e evita desvios de temperatura induzidas. Definir as áreas específicas de análises (dentro de explante e entre diferentes explantes) com a ajuda do software de microscópio e uma fase motorizada controlada por software (configuração multiposições) para análises simultâneas de diferentes condições aplicadas aos explantes SCG. Por lapso de tempo tecidual de tipo selvagem, bem como nos tecidos dos animais transgénicos pode ser usadomarcando o SCs (S100B: GFP) (3). Para fluoróforos de imagem de uma fonte de luz fluorescente deve ser implementado na configuração micropscope. Use filtros padrão.
5. Quantificação das distâncias de migração SC
- No ponto final (DIV4 por exemplo), corrigir os géis de colágeno com PFA 4% no slide câmara para 3-4 horas. Consecutivamente, os géis de colagénio lavar 5 vezes durante 10 min com PBS. Aplicar protocolos padrão para a imunocitoquímica (2). Se você é novo para a preparação de SCGs, verificar a identidade do gânglio como um gânglio simpático por imuno-histoquímica contra tirosina hidroxilase (TH) um marcador comum para células catecolaminérgicos. Durante imunohistoquímica (após o anticorpo primário), transferir os explantes géis de colagénio contendo a placas de 24 poços, os quais têm um volume maior, o que é benéfico para a lavagem do gel.
- Depois de imuno-histoquímica, coloque cuidadosamente o gel de colágeno em lâminas de vidro. Cuidadosamenteremover a solução restante e deixe secar o colágeno / encolher a duas dimensões. Isso permite que as medições fáceis de distâncias (2). Depois disso, montar as amostras.
- Finalmente, medir distâncias de migração com a ajuda de software Fiji (NIH). Não plugins especiais são necessários para esse fim. Para permitir que medidas corretas em um, verificar os metadados de imagem correta e as configurações no Fiji, imagem e escala. Use Fiji também para a quantificação das células.
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Representative Results
Crescimento axonal é facilitada a partir de explantes de SCG, após tratamento com NGF (4) (esquema filme Figura 1 esquema de S1). Este processo é facilmente visível por um microscópio invertido e pode ser seguido por lapso de tempo de imagem (vídeo S2). Se um cientista é novo para dissecar SCG de embriões de camundongos recomendamos uma validação da técnica por um hidroxilase anti-tirosina simples (TH) imuno-histoquímica. TH é um marcador para neurónios catecolaminérgicos comum (neste caso, os neurónios simpáticos) e faz também axónios de etiquetas (Figura 2B). Por este meio comprimentos axonal podem ser analisados no presente sistema (2).
É importante notar que, após o crescimento axonal foi induzida, uma onda de células migratórias podem ser observadas (filme S2 e S3). Células migratórias foram validados como S100 imuno positivo SC (2). Além disso, uma linha de ratinhos transgénicos, na qual GFP está sob o controle do s10 humanoFragmento do promotor 0b (3) pode ser usado para analisar directamente o rotulado população SC (2) (filme S4 e S5). Com a ajuda desta linha transgénica destas experiências também pode ser realizada com microscopia confocal folha ou luz (não executado aqui).
Para as análises de SC durante a migração, recomendamos uma área de análise com uma baixa densidade axonal (Figura 1 close-up DIV3 e DIV4) e, assim, uma pequena população de SC por área de análise. Isso facilita melhores possibilidades para ver morfologia celular e comportamento celular (S3 filme).
SC distâncias de migração podem ser medidos no final de uma experiência (por exemplo, DIV4). Para este fim DAPI rotulagem nuclear pode ser realizada em tecido fixo e as distâncias dos núcleos SC líder para a borda do explante pode ser medida com a ajuda de Fiji (NIH software) (Figura 2 esquema de rotulagem e DAPI) (2).Além disso, também SC SC proliferação ou morte podem ser analisadas. Para este fim por imuno-histoquímica para o phh3 ou activado Caspase 3 pode ser realizada, por exemplo, identificação de células apoptóticas mitótico ou, respectivamente (2).
Figura 1 A:. Esquema mostrando o crescimento axonal de um SCG explantado longo do tempo (DIV0-DIV4). B / C: imagens de campo claro, gravadas durante lapso de tempo de imagem que mostra close-ups de uma região de um explante SCG em DIV3 (B) e DIV4 (C) (escala-bar = 100 mm).
Figura 2 A:. Esquema mostrando SC (azul) ao longo dos axônios estendidos (cinza), cultivadas a partir de um SCG explantado (azul claro) na DIV3 e DIV4. Distâncias de migração pode ser medida em DAPI nuclear marcados amostras através da medição da distância a partir do núcleo do SC que conduz à fronteira da SCG explantado em vários locais (C). TH imunohistoquímica (DIV4) deve ser realizada se um cientista é novo para SCG dissecção. A marcação positiva identifica claramente o gânglio explantado como um gânglio simpático (B). Imunohistoquímica TH também permite a análise de axônios cultivadas a partir de SCGs explantados.
S1 filme. Esquema mostrando crescimento axonal de um SCG explantado durante vários dias in vitro. Clique aqui para ver filme .
Filme de crescimento. S2 axonal e migração SC a partir de um explante de NGF tratado SCG. Imagiologia começou no DIV2. Taxa de quadros de gravação foi de 1/30 min. Escala-bar = 100 mm. Clique aqui para ver filme .
ntent "> filme S3. Feche acima de uma área periférica de um explante SCG. Devido a uma baixa densidade axonal individuais SC podem ser facilmente analisados. início de imagem foi DIV3. taxa de quadros de gravação era 1/10 min. Escala-bar = 100 mm . Clique aqui para ver filme .S4 filme. A combinação de claro e de fluorescência permite a visualização de SCs S100 GFP positivas e os axônios. Taxa de quadros de gravação era 1/10 min. Escala-bar = 100 mm. Clique aqui para ver filme .
Filme S5. SC migração na fronteira de um explante SCG. Aqui só canal a fluorescência é mostrado permitindo fácil interpretação dos SCs S100 GFP positivas. Taxa de quadros de gravação era 1/10 min. Scale bar = 100 jim./ 50016/50016movieS5.avi "target =" _blank "> Clique aqui para ver filme.
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Discussion
O desenvolvimento do sistema nervoso periférico é um processo excitante. Quando o desenvolvimento estiver concluído, os axônios são ensheathed por SCs ao longo de todo o comprimento, o qual pode, em humanos, ser muitas vezes mais de 100 cm. Para este fim, o número correcto de os SCs requeridas deve ser estabelecido durante o desenvolvimento e as SCs também tem que se mover ao longo de axónios estendem para a periferia para assegurar a cobertura completa axonal. Isso vale para mielinizadas, mas também para os axônios unmeylinated. Em ambos os casos todos os axônios estão em contato com SCs e dependem de seu apoio. Para estudar o desenvolvimento SC, ensaios que são necessárias tomar o compartimento axonal em conta e, consequentemente, imitar o desenvolvimento in vivo para um melhor grau do que os ensaios do zero (5), ensaios de Boyden (6) ou ensaios de câmara pode fazer. Em alguns ensaios no compartimento axonal foi tomado em consideração já. Por exemplo seções do nervo ciático foram usadas como rotas para os SCs para migrarao longo de (7, 8), ou SCs foram co-cultivadas com os neurónios ao longo das quais os axônios eles foram observados para migrar (9).
A SCG explante SC ensaio de migração, no entanto, tem ainda mais vantagens. É especialmente interessante porque SCs estão desenvolvendo ao longo de seus próprios axônios fisiológicas, e estes são, eles próprios ainda está crescendo. Além disso, a técnica é fácil de aprender e requer apenas um pouco de competências técnicas de dissecação e não necessita de um sistema de co-cultura de neurónios e complexo SCS. Uma configuração muito similar, no entanto, não utilizar SCGs mas sim DRGs, foi proposto por Gumy e colaboradores (10). No entanto, para explorar todas as possibilidades de ensaio tal, uma configuração microscópio inversa é necessária permitindo lapso de tempo de imagem. É importante ter a possibilidade de fazer "multi-posição experiências", a fim de ser capaz de analisar diferencialmente explantes tratados SCG, situados em uma lâmina de câmara, ao mesmotempo, permitindo que o trabalho com os controlos lado a lado com óptima os factores de interesse (2). Para a análise foi utilizado luz e convencional de fluorescência convencional (para transgênico S100B: GFP ratos) microscopia. A técnica, no entanto, também pode ser facilmente utilizado com microscopia confocal folha ou mesmo de luz (não executado aqui). Time-lapse gravações podem ser usados para identificar as propriedades específicas celulares / comportamentos durante a migração. Até agora, apenas camundongos de tipo selvagem e transgênicos têm sido usados (2). No entanto, a transfecção de SCs e, assim, de alteração dos caminhos de RNAi, por exemplo, deve ser exequível. Com esta técnica pode até ser possível analisar a interação SC-axônio de SC normal e alterada no axônio mesmo ou vizinho. Quanto distâncias de migração, proliferação e sobrevivência SC SC, análises ponto final pode ser facilmente realizada por imuno-histoquímica com DAPI nuclear rotulagem e software Fiji (NIH). No entanto, eventualmente, até mesmo a vida-reporter para a proliferação (11), e morte celular (12, 13) pode ser usada, permitindo assim que uma leitura directa durante imagiologia.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Queremos agradecer Arumae Urmas para compartilhar um protocolo de colágeno e Jutta Fey e Ursula Hinz para assistência técnica excelente. Além disso queremos agradecer a Christian F. Ackermann, Ulrike Engel ea Nikon Imaging Center da Universidade de Heidelberg e também Joachim Kirsch por gentilmente ajuda para o shoting vídeo. O trabalho foi parcialmente financiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 592).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x MEM | Gibco | 21430 | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080 | |
| Glutamine | Gibco | 25030 | |
| NaOH | Merck | 109137 | |
| NGF | Roche | 1058231 | R&D#556-NG-100 |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504 | |
| antibiotics | Gibco | 15640 | |
| d-PBS | Gibco | 14040 | |
| insect needles | FST | 26002-20 | |
| syringe needle | Braun | BD # 300013 | |
| 8 well chamber slide | Lab tek | 177402 |
References
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