Summary
Nous décrivons ici une cellule de Schwann (SC) essai de migration dans lequel SC sont en mesure de développer le long des axones s'étendent.
Abstract
Le développement des nerfs périphériques est un processus fascinant. Neurones envoient des axones innervent à des objectifs spécifiques, qui chez l'homme sont souvent de plus de 100 cm du soma du neurone. La survie neuronale au cours du développement dépend de facteurs de croissance dérivés cible, mais aussi sur le soutien des cellules de Schwann (CS). Vers l'extrémité des axones ensheath sc de la région de la soma neuronale (ou la transition de la centrale au système nerveux périphérique) de la synapse ou de la jonction neuromusculaire. Les cellules de Schwann sont des dérivés de la crête neurale et migrent le long des axones en tant que précurseurs émergents jusqu'en l'axone entier est couvert de SC. Cela montre l'importance de la migration SC pour le développement du système nerveux périphérique et souligne la nécessité d'enquêter sur ce processus. Afin d'analyser le développement SC, une configuration qui est nécessaire à côté des castes repose aussi sur le substrat physiologique de la migration, de l'axone. En raison du développement intra-utérin
Protocol
1. Préparation de gels de collagène
- Préparer le milieu de stock, contenant 455 ul MEM 10x, 112 ul de 7,5% de NaHCO 3, 50 ul glutamine et NaOH. La concentration et la quantité de NaOH dépend de la préparation de collagène de queue de rat (voir 1.2), le volume final du milieu stocks étant 1,000 pi.
- Préparer du collagène de queue de rat selon la Ebendal (1). Conserver la solution de collagène à 4 ° C. Une dégradation de la solution de collagène n'a pas pu être observée. Après la préparation d'un nouveau lot, estimer la concentration de NaOH nécessaire pour le support d'actions (voir 1.1). Utiliser l'indicateur de pH du milieu pour le titrage de la quantité et la concentration de NaOH. 800 ul acide de collagène de queue de rat ont à prendre une teinte rouge lorsqu'il est mélangé avec 210 ul du milieu boursier. Si la concentration de NaOH est trop faible, la solution devient jaune collagène, du fait de l'indicateur de pH du milieu. Ajouter le collagène dans le milieu et mélanger sans produitspremière utilisation de bulles. Exécutez ces étapes sur la glace. La polymérisation a lieu dans les 2 heures après la solution de collagène et le moyen de stock ont été mélangés et la nouvelle solution est incubée à 37 ° C. Testez cela avant de commencer une expérience. 1,3) Mélanger 800 ul de solution de collagène avec 210 de moyenne ul stock (voir 1.2). Placer 100 ul de cette solution dans les puits d'une diapositive 8 chambre bien. Incuber les lames à 37 ° C, 5% de CO 2 et les conditions humides dans un incubateur de culture cellulaire. Préparer les gels de collagène sous un banc de culture cellulaire et des conditions stériles. Le collagène gelatinise dans les 2 heures.
2. Dissection de SCGs embryonnaires
- Récolte des embryons de souris gravides temps (E16-18) de l'utérus et gardez-les dans du PBS jusqu'à nouvel nécessaire.
- Disséquer un embryon à partir de l'amnios. Décapiter l'embryon caudale du niveau de la clavicule. Fixer la tête sur un plat en bas de silicium avec des insectes "aiguilles". La face ventrale de la tête doit faire face à vous unD Vous devez voir la région sous-maxillaire. La fixation permet de faciliter la préparation.
- Retirez la peau de la région sous-maxillaire gauche et à droite, et avec elle le tissu conjonctif sous-cutané.
- Retirez les glandes sous-maxillaires salivaires de leur emplacement pour dégager la vue sur l'os hyoïde, les muscles infrahyoidal et le muscle sterno.
- Enlevez ces muscles avec soin pour dégager la vue sur le larynx et la trachée. Retirer la trachée et le larynx. Les artères carotides sont alors visibles des deux côtés sur les muscles prévertébraux. La CTB est situé à la bifurcation de l'artère carotide et a une forme ovale. Retirez délicatement les ganglions et les placer dans du PBS. Retirez délicatement les ganglions des outils de dissection, si elles s'en tiennent à leur disposition. Il est avantageux d'utiliser une pince ainsi qu'un porte-aiguille monté avec une "aiguille papillon" pour le retrait CTB.
- Une fois dans du PBS, stocker les ganglions à la température ambiante dans du PBS jusqu'à ce que vous disséqué enouganglions gh. Ensuite, nettoyer les ganglions des vaisseaux sanguins et des tissus conjonctifs. La dissection CTB et le nettoyage sous un microscope à dissection placé sous un banc à flux laminaire.
- Enfin, placer les noyaux explanté sur les gels de collagène gélatinisé à l'aide d'aiguilles de seringues montées sur une seringue pour une manipulation plus aisée.
- Incuber les explants CTB sur le collagène gélatinisé dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C, avec des conditions de CO 2 humide et 5%.
3. Traitement des explants SCG
- Après 1-2 heures d'incubation, couvrir le collagène explant CTB contenant avec 100 pl de milieu de culture contenant Neurobasal cellule B27 supplément, la glutamine et des antibiotiques. Maintenant les puits des diapositives de chambre contenir un volume de 200 pi (100 ul gel et 100 pl de milieu). Ajouter un autre ul 200 de la moyenne, mais maintenant contenant NGF (60 ng / ml) pour faciliter la croissance axonale. En conséquence, la concentration finale est NGF 30 ng / ml.
- Pour étudier l'apparition de la SC migration, ajoutez d'autres facteurs directement au jour in vitro 0 (DIV0). Dissoudre les facteurs du milieu contenant du NGF dans le double concentration nécessaire (2).
- Afin d'analyser l'impact sur la SC, qui ont déjà commencé la migration le long des axones, ajouter des facteurs supplémentaires à DIV3 jusqu'à DIV4 (arrêt potentiel de l'expérience). À cette fin, retirez avec précaution 180 ul de la solution, à DIV3, et ajouter 200 ul NGF milieu neuf contenant et les autres facteurs d'intérêt à la concentration double (2).
4. Imagerie time-lapse
Utiliser un microscope inversé pour les analyses. Divers objectifs peuvent être utilisés, en définissant le champ de vision et le grossissement. Un aspect important, cependant, est la distance de travail de l'objectif utilisé, comme l'imagerie des explants CTB est effectuée par la lame de verre et le collagènegel. La cadence d'enregistrement des 1/10-30 minutes a montré de bons résultats (2). Cependant, cet aspect doit être ajusté à la question scientifique. Une caméra CCD normale peut être utilisée pour l'acquisition des images. Pour l'imagerie en accéléré une chambre d'incubation de culture cellulaire doit être fixé à la platine du microscope. Incuber le tissu lors de l'imagerie à 37 ° C, avec des conditions de CO 2 humide et 5%. Démarrer le système d'incubation une heure avant le début de la formation d'image. Ceci permet aux parties (par exemple, microscopie objectif), y compris la chambre de coulissement pour régler la température et évite les dérives induites par la température. Définir des domaines spécifiques d'analyses (dans le explant et entre les différents explants) à l'aide du logiciel microscope et une étape contrôlée par logiciel motorisé (réglage multiposition) pour les analyses simultanées de différentes conditions appliquées aux explants SCG. Pour imagerie time-lapse de type sauvage tissu ainsi que des tissus d'animaux transgéniques peuvent être utilisésmarquant le SC (S100B: GFP) (3). Pour fluorophores imagerie d'une source de lumière fluorescente doit être mis en œuvre dans la configuration micropscope. Utiliser les filtres standards.
5. Quantification des distances de migration SC
- Au point de fin (DIV4 par exemple), fixer les gels de collagène avec 4% de PFA dans la chambre de coulissement pour 3-4 heures. Consécutivement laver les gels de collagène 5 fois pendant 10 minutes avec du PBS. Appliquer des protocoles normalisés pour l'immunocytochimie (2). Si vous êtes nouveau à la préparation du GEC, vérifier l'identité du ganglion en ganglion sympathique par immunohistochimie contre la tyrosine hydroxylase (TH) un marqueur commun pour les cellules catécholaminergiques. Au cours de l'immunohistochimie (après l'anticorps primaire), transférer les gels de collagène contenant des explants de plaques à 24 puits, qui ont un plus grand volume, ce qui est bénéfique pour le lavage des gels.
- Après immunohistochimie, placer soigneusement les gels de collagène sur des lames de verre. Soigneusementenlever le reste de la solution et laisser sécher le collagène / réduire à deux dimensions. Cela permet de mesurer facilement les distances (2). Après cela, montez les échantillons.
- Enfin, mesurer les distances de migration à l'aide de Fidji (NIH) des logiciels. Aucun plugin spéciaux sont nécessaires à cette fin. Afin de permettre des mesures correctes dans um, vérifiez les métadonnées imagerie correcte et les paramètres sous les Fidji, l'image et l'échelle. Utilisez Fidji ont également pour la quantification des cellules.
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Representative Results
La croissance axonale est facilitée à partir SCG explants par traitement avec NGF (4) (schéma de film S1 Figure 1 schéma). Ce processus est facilement visible par n'importe quel microscope inversé et peut être suivi par imagerie time-lapse (film S2). Si un scientifique est nouveau pour disséquer CTB à partir d'embryons de souris, nous recommandons fortement une validation de la technique par un simple anti-tyrosine hydroxylase (TH) immunohistochimie. TH est un marqueur commun pour les neurones catécholaminergiques (dans ce cas les neurones sympathiques) et fait aussi des axones étiquette (figure 2B). Par ce moyen, la longueur des axones peuvent être analysées dans ce système (2).
Surtout, après une croissance axonale a été induite, une vague de migration des cellules peuvent être observées (film S2 et S3). Migration des cellules ont été validés comme immuno S100 SC positive (2). En outre, une lignée de souris transgénique, dans lequel la GFP est sous le contrôle de l'humain s10Fragment de promoteur 0b (3) peut être utilisé pour analyser directement la population marquée SC (2) (film S4 et S5). Avec l'aide de cette lignée transgénique de ces expériences peut également être effectuée par microscopie confocale-feuille ou de la lumière (non réalisée ici).
Pour les analyses de SC lors de la migration, nous vous recommandons un espace d'analyse avec une faible densité axonale (figure 1 gros plan DIV3 et DIV4) et de ce fait une petite population de SC par domaine d'analyse. Cela facilite les meilleures possibilités de voir la morphologie des cellules et le comportement cellulaire (S3 films).
SC distances de migration peut être mesurée à la fin de l'expérience (p. ex DIV4). À cette fin DAPI marquage nucléaire peut être effectuée sur des tissus fixés et les distances à partir des noyaux de premier plan SC à la frontière de l'explant peut être mesurée à l'aide de Fidji (NIH logiciel) (figure 2 DAPI régime et étiquetage) (2).En outre également la prolifération ou la mort SC SC peuvent être analysés. À cette fin pour l'immunohistochimie ou de pHH3 activé Caspase 3 peut être réalisée par exemple, l'identification ou la mitose des cellules apoptotiques, respectivement (2).
Figure 1:. Schéma montrant la croissance axonale à partir d'un CTB explanté au fil du temps (DIV0-DIV4). B / C: images en fond clair, enregistrées lors imagerie time-lapse montrant des gros plans d'une région d'un explant CTB à DIV3 (B) et DIV4 (C) (barre d'échelle = 100 um).
Figure 2:. Schéma montrant SC (bleu) le long des axones étendus (gris), cultivés à partir d'un CTB explanté (bleu clair) à DIV3 et DIV4. Distances de migration peut être mesurée sur DAPI nucléaire marqués échantillons en mesurant la distance entre le noyau de la SC menant à la frontière de la CTB explanté à destinations multiples (C). TH immunohistochimie (DIV4) doit être effectuée si un scientifique est nouveau pour SCG dissection. Un marquage positif identifie clairement le ganglion explantée comme un ganglion sympathique (B). TH immunohistochimie permet également l'analyse des axones issues de SCGs explantés.
S1 film. Schéma montrant la croissance axonale à partir d'un CTB explanté sur plusieurs jours in vitro. Cliquez ici pour voir le film .
Film S2. La croissance axonale et la migration à partir d'un SC NGF traité CTB explant. Imagerie commencé à DIV2. Cadence d'enregistrement est de 1/30 min. Barre d'échelle = 100 um. Cliquez ici pour voir le film .
ntent "> Film S3. Gros plan sur une zone périphérique d'un explant CTB. Grâce à une faible densité axonale simples SC peut facilement être analysés. début imagerie était DIV3. Enregistrement taux d'image était 1/10 min. Scale-bar = 100 um . Cliquez ici pour voir le film .S4 film. La combinaison de clair et fluorescence permet de visualiser SC S100 GFP positives et les axones. Fréquence d'enregistrement était 1/10 min. Barre d'échelle = 100 um. Cliquez ici pour voir le film .
Film S5. SC migrations à la frontière d'un explant CTB. Ici, seul le canal de fluorescence est illustré permettant une interprétation plus facile des SC S100 GFP positives. Fréquence d'enregistrement était 1/10 min. Échelle-bar = 100 um./ 50016/50016movieS5.avi "target =" _blank "> Cliquez ici pour voir le film.
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Discussion
Le développement du système nerveux périphérique est un processus passionnant. Lorsque le développement est terminé, les axones sont entourées par SC sur toute la longueur, ce qui peut, chez l'homme, souvent plus de 100 cm. À cette fin, le nombre exact des SC requis doit être établi au cours du développement et les SC ont aussi à se déplacer le long des axones s'étendent à la périphérie pour assurer la couverture complète des axones. Cela est vrai pour myélinisées, mais aussi pour les axones unmeylinated. Dans les deux cas, tous les axones sont en contact avec SC et dépendent de leur soutien. Pour étudier le développement du SC, les essais sont nécessaires, qui prennent le compartiment axonal en compte et donc imiter le développement in vivo à une meilleure mesure que les essais à gratter (5), les tests de Boyden (6) ou des tests de chambre peut faire. Dans certaines analyses le compartiment axonal a été prise en compte déjà. Par exemple sections des nerfs sciatiques ont été utilisés comme itinéraires pour les SC à migrerlong (7, 8), ou SC ont été co-cultivées avec des neurones le long des axones qui ils ont été observés à migrer (9).
La CTB explant SC migration dosage, cependant, a encore plus d'avantages. Il est particulièrement intéressant parce que SC se développent le long des axones leurs propres physiologiques, et ceux-ci sont eux-mêmes encore en croissance. En outre, la technique est facile à apprendre et ne nécessite qu'un peu de compétences techniques de dissection et ne nécessite pas un complexe système de co-culture de neurones et de SC. Une configuration assez similaire, mais pas en utilisant SCGs mais plutôt DRG, a été proposé par Gumy et ses collègues (10). Cependant, pour exploiter toutes les possibilités de tel dosage, une configuration microscope inversé est nécessaire permettant imagerie time-lapse. Il est important d'avoir la possibilité de faire des «expériences multi-positions", afin d'être en mesure d'analyser différemment traités explants CTB, situé dans une chambre de coulissement, à la mêmetemps, ce qui permet le travail avec le côté contrôles optimale à côte avec les facteurs d'intérêt (2). Pour les analyses, nous n'avons utilisé la lumière de fluorescence conventionnelle et conventionnelle (pour transgénique S100B: GFP souris) microscopie. La technique, cependant, peuvent aussi être facilement utilisé par microscopie confocale feuille ou même la lumière (non réalisée ici). Enregistrements time-lapse peut être utilisé pour identifier des propriétés cellulaires / comportements lors de la migration. Jusqu'à présent, seuls souris de type sauvage et transgéniques ont été utilisées (2). Cependant, la transfection de SC et de ce fait la modification des cycles d'ARNi par exemple, devrait être faisable. Avec cette technique, il pourrait même être possible d'analyser l'interaction SC-SC axone normale et altérée sur le même axone ou voisins. En ce qui concerne la distance de migration, la prolifération et la survie SC SC, les analyses de point final peut être facilement réalisée par immunohistochimie avec DAPI nucléaire étiquetage et les Fidji (NIH) des logiciels. Cependant, par la suite, même la vie des pensionsrter à la prolifération (11) et la mort cellulaire (12, 13) peut être utilisé, ce qui permet une lecture directe lors de l'imagerie.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Arumae Urmas pour partager un protocole de collagène et Jutta Fey et Ursula Hinz d'assistance technique excellente. En outre, nous tenons à remercier Christian F. Ackermann, Ulrike Engel et le Nikon Imaging Center à l'Université de Heidelberg et aussi Joachim Kirsch d'avoir bien voulu contribuer à la shoting vidéo. Le travail a été partiellement financé par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 592).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x MEM | Gibco | 21430 | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080 | |
| Glutamine | Gibco | 25030 | |
| NaOH | Merck | 109137 | |
| NGF | Roche | 1058231 | R&D#556-NG-100 |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504 | |
| antibiotics | Gibco | 15640 | |
| d-PBS | Gibco | 14040 | |
| insect needles | FST | 26002-20 | |
| syringe needle | Braun | BD # 300013 | |
| 8 well chamber slide | Lab tek | 177402 |
References
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