Крыса Модель гематоэнцефалический барьер Нарушение чтобы позволить Целевые нейрососудистой терапии

Summary

Кровь гематоэнцефалический барьер нарушение помогает доставки некоторых лекарств к мозгу. Маннит доставлен внутриартериально сжимается клетки, окружающие кровеносные сосуды, чтобы физически нарушить барьер.

Protocol

1. Подготовка животных и оборудования для процедуры

1. Перед началом операции, подготовка области операции и животных. Сделать сонной катетер путем вставки 23-калибровочного тупой иглой в один конец 12 "PE50 труб. Отрежьте примерно наклона 45 ° в противоположном конце катетера. Стерилизовать оборудования до процедуры. Носить волосы капота, хирургические маски и стерильные перчатки.
2. Поместите грелку на поверхность, где операция будет выполнена. Активируйте его и дайте ему прогреться. Покройте поверхность с абсорбирующей прокладки скамейке.
3. Убедитесь, что у вас есть 25% маннита в раствор без кристаллов. Если присутствуют кристаллы, растворите их, поместив флакон в ванну с горячей водой при температуре 80 ° С и перемешивание периодически.
4. Запись массы животного.
5. Сделать пропофола разбавления для доставки в количестве 0,8 мг / кг / мин со скоростью 0,1 мл / мин.
6. Положите крысу в коробку индукции в течение 3 мин. Настройки: 5% изофлурана, 2 л / минСкорость потока на вентиляторе.
7. На вершине одноразовые полотенца, брить шею и обе внутренние поверхности бедер.

2. Интубация Крысы

1. Поместите животное обратно в коробку индукции в течение 3 мин.
2. Подготовка эндотрахеальной трубки с катетером IV. Для этого размер и напряжение крыса, мы используем на 18 га катетер. Трубка должна быть достаточно большой, чтобы позволить достаточный воздушный поток, но достаточно маленький, чтобы вписаться в трахею, не причинив ущерба. Вытащите иглу из пластиковых катетеров и тщательно сломать иглу ок. 1 см от ее острым кончиком. Bunted игла будет ваше перо. Введите иглу обратно в катетер.
3. Повесить крысу его зубами на наклонную поверхность.
4. Shine A Light непосредственно к шее животного и выстроились между его ушами.
5. Вставьте небольшую около шпателем. 3 см в ротоглотке. Поднимите вверх, а осторожно потянув за язык изо рта.
6. Визуализируйте открытие трахеи. Вы будете себеEA небольшое отверстие открывать и закрывать с каждым дыханием.
7. Аккуратно вставить катетер в отверстие. Иногда вы можете чувствовать себя пластиковую ввести хрящей трахеи. Трахеи является чувствительным. Не заставляйте катетер.
8. Установить вентилятор на 1 л / мин и 60 ударов в минуту и ​​изофлурана до 2%.
9. Подключите катетер к вентилятору и ленты трубки к рабочей поверхности.
10. Убедитесь, что животное находится под наркозом, выполняя ноги шнура.

3. Создание Пропофол IV анестезии

1. Закрепить крысы, записывая на пленку все четыре конечности и хвост к рабочей поверхности.
2. Скраб побрил шею и пах сайтов с хлоргексидином мылом три раза. Затем скраб с хлоргексидином промыть три раза.
3. Прикрепите шприц пропофола, чтобы расширение набора IV. Установите шприц на инфузионного насоса.
4. Использование скальпеля, прорезали кожу побрился бедра. Избегайте резки мышц.
5. Откройте разрез с силойPS Для визуализации бедренную вену.
6. Раздвиньте ткани над артерией подвергать судно.
7. Вставьте в 26 га monoject ветеринарной IV катетер в вену. Когда игла прокалывает стенку вены вы почувствуете это стало легче толкать. Уберите иглу и нажать катетера в сосуде.
8. Начало инфузии пропофола на 0,1 мл / мин.
9. 3-5 мин после начала инфузии пропофола, переключиться анестезии газа в смеси 50% O ₂ и 50% N ₂ O и выключил изофлурана.

4. Expose бифуркации общей сонной артерии

1. Сделайте срединный разрез на шее лезвие скальпеля.
2. Вырезать между двумя большими слюнных желез с помощью ножниц или скальпеля.
3. Проанализируйте от ткани по бокам от средней линии, чтобы разоблачить сонной артерии. Используйте пинцет, чтобы открыть слоев ткани. Вы можете использовать ножницы, чтобы удалить кусочки, которые вы подвергаете с помощью пинцета и определить, что minimallУ сосудистые. Остановки кровотечения марлей, ватные тампоны, и прижигания, если необходимо.
4. Inject 3 мл солевого IP, если произошли от умеренного до сильного кровотечения.
5. Используйте втягивающих тянуть ткань от сонной артерии. Найти бифуркации.
6. Expose затылочной артерии только дистально по отношению к бифуркации. Прижигание его между щипцами и отделить его с электрокоагуляции.
7. Используйте пинцет, чтобы полностью раскрыть бифуркации сонной артерии и, как большая часть ECA насколько это возможно.
8. Expose верхняя щитовидная артерия отходящие ECA дистальной к затылочной артерии. Прижигание его между щипцами и отделить его с электрокоагуляции.

5. Катетеризации наружной сонной артерии

1. 2-е место длиной 4/0 шелка под ЭКА.
2. Возьмите 1 длина шва с кровоостанавливающего и отвода ECA назад каудально (в сторону ног крысы).
3. Возьмем другой шва и связать насколько краниально (к уст крысы) в качестве возможных Wго хирурга узел. Это формирует постоянную лигатуры пожертвовать ЭКА.
4. Удалить первый кровоостанавливающего (тот, что был применения хвостового натяжения) и захватить другие шов (тот, который завязывается вокруг ECA) и применить нежное напряжение краниально с кровоостанавливающего.
5. Завяжите узлом другого хирурга свободно (не безопасно - оставить только связали) дистальнее бифуркации и проксимальных к постоянной лигатуры.
6. Промыть 1% лидокаина, чтобы расслабиться артерии.
7. Заполните катетер с гепарином физиологическим раствором.
8. Место временного клип судно как можно ближе к развилке. Место судна клип под углом, чтобы максимизировать пространство для катетеризации. Наденьте свободную узел в сторону клипа.
9. Сделайте небольшой артериотомии (разреза) в регионе ЕЦА только проксимальнее лигатуры использованием microscissors. Там не должно быть кровотечение, если клип и лигатуры находятся в безопасности.
10. Используя щипцы для управления ECA стены, кормить скошенной конце катетера в сосуде. Закрепить катетер со свободным узлом шва. Свяжите артерии вокруг катетера.
11. Снимите клип и очистить территорию с помощью ватного тампона.
12. Продвигать катетер до 1 мм дистальнее бифуркации. Держите артерии пинцетом проксимальнее узел, чтобы обеспечить судно обездвижен.

6. Администрирование Маннит

1. Заполнить 8 "IV расширение набора и 6 мл шприц с маннит, не создавая никаких пузырьков воздуха Хранить в инкубаторе при температуре 37 ° C. Примечание: работа быстро с маннитом - это будет легко выпадают из раствора при комнатной температуре..
2. Для того, чтобы визуализировать BBBD, вы можете управлять Эванса синего красителя и смотреть его войти в областях мозга, где барьер был нарушен. Чтобы сделать это, дать животному 2 мл / кг 2% Evans Blue через новый сайт IV на ногу контралатеральной инфузии пропофола.
3. Установите расширение установлен в 5 мкм фильтр и залить его маннит, чтобы удалить пузырьки воздухарублей. Затем присоедините эту крана без создания пузырей.
4. Администрирование маннита на 0,09 мл / сек в течение 25 сек. Следите за маннита для достижения равновесия с потоком в общую сонную на момент просто проксимальнее ICA. Он должен появиться на импульсный с частотой сердечных сокращений крыс. Если маннит просто стекает вниз по направлению к сердцу вы победили артериальное давление крыс. Это может привести к опасным для жизни осложнениям и плохой BBBD.

Representative Results

Рисунок 1. Визуализация гематоэнцефалический барьер, через нарушение Эванс экстравазации синего красителя. Эванс синий краситель пигмент, который связывается с альбумином и не extravasated в мозг в физиологических условиях. Нарушение гематоэнцефалического барьера на одной стороне мозга позволяет голубого Эванса, чтобы войти и пятна нарушается полушария синими то время как не нарушена полушарии остается неизменной. Таким образом, он является полезным маркером гематоэнцефалического барьера разрушения. Рис. 1А является примером мозга без гематоэнцефалического барьера разрушения. Рис. 1б является примером мозг окрашен в голубой цвет после осмотического BBBD с использованием 25% маннита. Обратите внимание, что одно полушарие окрашивается синим цветом, а другой остается незапятнанным. Некоторые синие вступил в левом полушарии у медиального продольного трещина в результате смешения кровотока при ТОн Круг Уиллис.

Discussion

Есть несколько средством максимизации эффективности BBBD. Важно, чтобы свести к минимуму кровотечение во время урезанную фазу. Артериальное давление и частота сердечных сокращений могут быть затронуты существенным кровотечением, и эти факторы, как известно, влияют на степень BBBD ^13. Кровотечение может быть уменьшен с помощью швов для лигирования крупных сосудов, таких, как превосходные щитовидной железы и затылочной артерии, которая должна быть разделена. Кроме того, электрокоагуляции можно использовать для разделения судов и анализировать областях, которые имеют богатое кровоснабжение. Это также важно, чтобы воздух и твердые частицы из всех строк, размещенных в животных - в частности, сонных катетер. Рабочие быстро маннит помогает гарантировать, что кристаллы не образуются внутри шприца или трубки.

Важно использовать маннитол расход, который является эффективным для размеров и деформации крысы, используемые в данном эксперименте. Скорость потока инфузии маннитола должна соответствовать давлению в общей Caroti крысыг артерии, что высокая концентрация маннита впадает в ICA, не стекает общих сонных в сердце и легкие, что может привести к повреждениям. Исследователи выбор различных размеров и деформации крыс, чем тот, использованные в этом исследовании следует провести эксперименты, чтобы найти правильный маннит расхода.

Одним из недостатков этого метода является то, что она требует жертвы ЭКА. После того, ЭКА катетер, становится трудным и ненадежным катетеризация снова. Таким образом, эта процедура не может быть выполнена дважды на одном полушарии. Кроме того, соединения данного следующие BBBD должны быть тщательно проверены на нейротоксичность. Некоторые препараты, которые обычно безопасны становятся опасными, когда они пересекают гематоэнцефалический барьер.

Несмотря на эти ограничения, BBBD широко используется для изучения улучшенных доставки химиотерапии опухолей головного мозга ^8,15-18. Он также может быть полезен для других терапевтических применений в шHICH препарат не эффективно пересечь гематоэнцефалический барьер и управление маннит, как известно, быть безопасными.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Long Evans rat	Harlan Laboratories		210-250 g, male
PE 50 Tubing	Beckton-Dickinson
18 gauge x 2.5" IV catheter	Terumo		For ET tube
30" IV extension sets	Abbott
26 gauge veterinary IV catheter	Monoject
Evans blue dye	Sigma	E2129
Bipolar	Codman
Filter, 5 μm	Braun