在微RNA在腹鸡中脑大毛表达

Summary

异位表达的是一种技术来阐明大脑发育的小分子RNA的作用。但是，使用在OVO电针对特定领域是具有挑战性的。这里，我们表明一个有效的方式来选择性电穿孔腹侧和背侧中脑区域。

Abstract

非编码RNA是另外玩家在调节基因表达。针对在特定领域OVO电提供了空间和时间的控制异位microRNA表达谱的独特工具。不过，腹脑结构，如中脑腹侧是相当难以达成任何操作。在这里，我们展示了使用薄的铂电极电穿孔的miRNA进入中脑腹侧一种有效的方式。这种方法提供了一种可靠的方法转染中脑和体内研究的有用工具的特定区域。

Introduction

小非编码RNA作为额外的球员基因表达的识别推出了新的复杂的基因组编程/基因调控。不同品种的非编码RNA在神经细胞，包括非编码小分子RNA ^1-4功能的重要性。小分子RNA（MIR或miRNA）为例说明在开发大脑^5个不同的和不断变化的表达谱。有针对性的鸡胚蛋内电穿孔提供了开发过程中的基因表达和沉默的时间和空间控制一个独特的机会。

本视频演示了不同的步骤，使用在OVO电^6-10在鸡脑的特定区域进行miR的异位表达。为了确保在这些细胞中的小非编码RNA的效果持久，miR的DNA序列克隆到单或双顺反子载体。 在OVO电中，miR含v厄克托基是通过使一个小窗口，在蛋壳后露出的胚胎注入到中脑的神经管。转染的脑小加（阳极）和减号（阴极）的特定区域的铂电极被放置在特定的位置上。对于腹侧中脑的转染，所述阳极被置于左侧中脑腹侧和上面的中脑的右半边的阴极施加电流前下方。在蛋壳的开口被封闭，磁带和胚胎孵育只要所需的任何分析。该方法最初是由村松等 ⁶所描述和特定区域的转染改善了由百濑等 ^8。

原理概述。

1. 在鸡蛋胚胎是通过切割一个小窗口，进入次曝光Ë蛋壳。
2. 溶解的载体（s）是注入到使用微毛细管中脑。
3. 两个电极 - 平行放置，或根据与上面的胚胎 - 产生一个脉冲电场。
4. 电场在时间上产生毛孔中的细胞膜，从而促进进入细胞由带负电荷的DNA（或RNA）被吸引到阳极^11,12。

Protocol

1。用于在OVO电要求

1. 制备的载体构建：的miR义和反义引物设计后Ambion公司的指示，退火并连接到的ApaI / EcoRI位消化的pSilencer U6.1载体。成功转型后所产生的克隆人被种植和使用Quiagen公司的midi制备试剂盒的pSilencer质粒分离碱裂解法。
2. 电极：电极可以购买或容易建立^13。我们使用铂丝的自制电极（Φ= 0.2，0.25或0.5毫米的直径），或者在某些情况下甚至更小的钨丝电极（Φ=0.1毫米^）8取决于我们要电穿孔的区域。为了避免组织炎炎，我们作为一个规则的接近使用到组织中的电极越细。对于脑的广泛电，我们用焊接到铜管/不锈钢管0.5毫米铂丝轴和固定在具有一定距离的3-5毫米（ 图1）的电极保持器。以电穿孔的特定区域中，我们使用0.25毫米铂丝阳极0.2毫米的铂丝或0.1毫米钨为1毫米或更小的近似距离的阴极。
3. 解决方案：有以下解决方案就绪：
   1. 蒸压鸡铃声，pH为7.5（9.0克氯化钠，0.42克氯化钾0.24克氯化钙，1升溶于蒸馏水）。
   2. PBS（8克氯化钠，0.2克氯化钾0.24克KH ₂ PO 4，1.44克Na ₂ HPO _4，溶于1L蒸馏水H ₂ O）。
   3. 固绿：原液10毫克/毫升蒸馏水H _{2 O}的
   4. 慢干油墨（虫胶少，从而为胚胎中毒以下）。注：在粤语索莱尔和阿德勒¹⁴说明连接到光纤灯蓝色二向色滤光片增强了对比度，能消除需要注入墨水。

图1。电极和电极座示意图。 （A，B，C）的铂丝焊接到不锈钢的管状轴的一侧。一个洞钻成的管状轴的另一侧因而该引脚插头可以适应。（一）红色和蓝色导线连接到引脚插头。在另一端的导线被安装到与该电穿孔的电插座工作香蕉连接器（A，C）的铂丝被弯曲成90°的天使。指甲油的隔离层的上面弯曲的轴。

2。准备直接在卵内电穿孔

1. 准备以下材料：
   1. 稀释油墨与鸡铃声1:6，添加抗生素，抗真菌溶液（100X从GIBCO）1:100。
   2. 准备向量解：1-2微克/每特定的DNA中H _{2 O}的微升辅以固绿（1:20）。
   3. 消毒镊子，剪刀，钨针和电极，用70％的乙醇。
   4. 拉微量核酸注入硼硅玻璃毛细管（长度外径：100毫米x0.9毫米）。我们使用了一个简单的牵拉PUL-1（WPI，柏林）与表1中所示的设置。
   5. 设定电穿孔的参数如表2所示。

参数	值
热	350
拉	100
速度 50
延迟	200

表1中。设置PUL-1

参数	值
频率	50赫兹
延迟	20 - 50毫秒*
宽度	20毫秒
电压	8-25 V *
脉冲	3 - 5倍
*根据电极直径和距离。请改变其中一个参数时考虑到这一点。

表2。设置为脉冲刺激

2. 准备小鸡胚胎的电穿孔：
   1. 培养他们的长边受精鸡蛋在37℃，65％湿度下39小时，以收购汉堡和汉密尔顿（HH）之间的胚胎阶段¹⁵ 9-11。胚胎沉淀在鸡蛋的最上面的部分，所以你应该把它用铅笔线标记。
   2. 消毒的鸡蛋用70％乙醇。
   3. 穿透卵子在其更广泛的方面，这里的空气腔应该是。
   4. 除去1-2毫升蛋清。这将分离的胚胎从蛋壳。
   5. 大提琴磁带蛋壳，避免外壳碎片掉落到胚胎。用剪刀剪一个小窗口，进入周围的铅笔线的蛋壳。
   6. 注入一点墨水下方的区域opaca以可视化的胚胎。
   7. 使一个切成卵黄膜具有削尖的钨针，以达到更好的可访问性的胚胎用于核酸注射和电穿孔。

3。电穿孔和孵化

1. 添加几滴温暖林格氏溶液到胚胎。这将降低胚胎，防止过热，电极粘附到组织，并在两个电极之间的电流提供了一个平台。
2. 注入载体溶液成神经管在中脑水平的内腔中。如果你的DNA表达载体，不含有报告基因（ 例如绿色荧光蛋白），增加一个略低浓缩报告基因载体（1微克/微升的miR表达载体至0.9微克/微升的报告基因载体）的DNA溶液。这将确保你认识到转染细胞后^8。我们使用了所谓的pCAX矢量，一种赠品来回米C.克鲁尔^13。
3. 对中脑的广泛的转染，将左电极和胚胎的权利在中脑的高度。电极之间的距离应为大约3-5毫米。其他设置为15V，20毫秒脉冲和50毫秒的延迟HH 10。改变两个电极的位置略微沿脑的背腹（DV）的轴线保证细胞的更广泛的转染对DV轴转染。
4. 对于腹侧转染，增加一些林格从蛋黄膜抬高头部，并放置在阳极腹侧中脑的下方。如果头不上升推分开蛋黄和胚胎以避免神经管烧焦膜下的电极。阴极应放置在上面的中脑DORSO-横向相对的阳极。请勿触碰神经管。我们转染中脑的腹侧左边一半，以避免与心脏发育的任何困难。电极之间的距离大约是1-0.5毫米，其余设置均10V，20毫秒宽度和50毫秒的延迟。
5. 适用于胚胎的顶级另一滴的盐水冷却下来，并除去气泡。
6. 密封鸡蛋与磁带孵育至少4小时;需要载体表达的最短时间。

4。鸡胚胎的固定

1. 从他们的鸡蛋取出胚胎。
2. 在立体显微镜下，并评估转染用荧光立体显微镜的程度清洁胚胎。
3. 固定过夜的胚胎在4％PFA在4°C进行切片和/或染色（ 荧光原位杂交，免疫组织化学）的变化来分析转染的区域。

Representative Results

转染了miR中脑区域的范围是可见的，通过GFP的从沿与所述miR表达载体（ 图2）喷射的报告基因载体的表达。使用铂电极的直径为0.5mm且平行放置脑引线的AP轴通常为大面积的转染沿DV-和AP-轴，包括后脑，中脑和间脑有时（ 图2A和B）。的电极的结果在宽的电场的大小施加到大脑区域，因此广泛染区。

它难以精确地定位，比如例如在腹侧中脑区域。降低0.5毫米电极之间的距离，实现了更小的电场，往往为胚胎毒性并导致工件。我们用电极直径较小（0.2毫米0.25毫米的铂金或0.1毫米削尖的钨丝），它提供更多的本地化TRAnsfection这样的腹侧脑，这是很难达到（ 图2C-I）的。较小的电极减小所施加的电场，使插入所述电极更接近该组织。 图2F显示了一个例子，其中在整个腹侧中脑已被转染。在图2G和2H转染的腹侧区域较小，但后脑（2F）或间脑（2H）的一部分，也被转染。在图2G中，阳极被设置在中间和后脑下转染两腹侧区域。 图2H示出了阳极不能很好地隔离，沿轴指甲涂剂的例子。因此，不仅周围的MHB的腹侧区域表达的miR / GFP而且背侧前MES和二脑，其中所述阳极的轴已被放置。 图2C-I的具体腹的miR / GFP的分布是从本地的结果电场我们应用具有较小的电极。两者合计，较小的电极和电场，我们可以像在中脑腹侧更禁区表达的DNA / RNA。

由于我们的microRNA表达载体包含任何报告基因，我们在1微克/微升至0.9微克/微升，分别比表达载体GFP的混合。几乎相等比例保证了小分子RNA和GFP转染的面积几乎完全重叠（见百濑等人 ^。8和自己的经验）。为了能够判断转区域的范围变得重要时仅含有特定细胞类型的小区域被转染或转染的细胞被用于定量RT-PCR。报告基因的少得多的浓度可能会导致细胞表达GFP下检测水平。任何转染载体​​的表达的强度不仅取决于所使用的载体浓度而且在启动子。我们的载体是U6启动子软碟烯（表达的miRNA）和β-肌动蛋白启动子驱动的（表达荧光蛋白），并都普遍存在和组成型活性的鸡胚。

我们的大部分胚胎的电穿孔在左侧除了图2C（镜像）。时间推移的实验中，在右侧的胚胎的电穿孔被推荐使用，因为大多数胚胎把他们的头部朝向其左侧的权利和谎言。

图2。代表性结果。胚胎HH10和HH11之间的电穿孔和固定在图像显示的阶段 。背侧中脑（AC）显示电穿孔，和（DI）中脑腹侧的。在（D，E）的箭头指示位于腹侧，GFP阳性细胞。欲了解更多详情，请参阅文本。 MES- 脑/脑，迪 - 间脑，电话 - 端脑，RHOM - 菱脑/后脑。

Discussion

该视频演示了转染质粒转化的小鸡脑的特定区域的神经上皮细胞的有效方法。低电压的矩形电脉冲可以将DNA引入小鸡神经管细胞大毛 ^6,16。但是，DNA的定位精度由宽电场，其上升通过比较大的电极（Φ= 0.5mm）的经常受阻。我们试图通过下面的百濑等 ⁸的指引，使用电极直径小，以解决这个问题。对于腹侧中脑转染，我们将阴极区带蛋白或膜下如果胚胎的年龄允许它正下方的腹侧中脑。最后一种情形需要一些练习，因为中脑/神经管组织不应该被感动，被损坏的阳极。添加铃声往往可以帮助解除胚胎的头稍微偏离膜覆盖的区域透明带。

虽然考虑在小区处于基因的浓度。不同基因的剂量可能对细胞和组织的影响不同。有可能是所涉及的阈值效应（见Agoston 等人 ^17，例如）或不同，分级效果。我们通常测试迪菲和平号的租金浓度表达（0.5-2微克/微升）矢量和分析形态变化或蛋白质/基因表达。效果可在体内采用免疫组织化学测试，传感器原位杂交载体¹⁸或RNA。

该技术还提供了测试如De Pietri的托内利等 ¹⁸描述使用例如双荧光记者/传感器矢量特定的miR 体内的任何活动的强度和位置。他们使用包含GFP-记者和RFP的miR传感器的矢量。在RFP之后是一个免费的miR序列。而GFP表达识别成功转染的细胞，红色荧光（RFP）表明不存在所研究的miR的，以及红色荧光消失暴露出所述miR的存在。此技术也可用于测试的miR靶的特异性体内 ，通过在RFP的下游使用靶序列的3'UTR。两者合计这种技术是非常适合于在不同组织中的基因表达和功能的发育研究。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Borosillicate glass capillaries	Hartenstein		Model: 0.9 mm
Microcapillary puller	WPI, Berlin		Model: Pul1-E
Electroporator	Intracel		Model: TSSIC
Stereomicroscope - fluorescence	LEICA		Model: MZFLIII
Stereomicroscope	Zeiss		Model: Stemi
Camera and software	Zeiss		Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8