Summary
L'expression ectopique est une technique permettant d'éclaircir le rôle des microARN dans le développement du cerveau. Cependant, le ciblage des zones spécifiques à l'aide de l'électroporation in ovo est un défi. Ici, nous montrons de manière efficace à des régions du mésencéphale ventral et dorsal sélectivement l'électroporation.
Abstract
Les ARN non codantes sont des acteurs supplémentaires dans la régulation de l'expression génique. Ciblée dans électroporation in ovo de domaines spécifiques fournit un outil unique pour le contrôle spatial et temporel de l'expression de microARN extra-utérine. Cependant, les structures du cerveau comme le mésencéphale ventral ventrales sont plutôt difficiles à atteindre pour tous les manipulations. Ici, nous démontrons un moyen efficace pour l'électroporation des miARN dans le mésencéphale ventral en utilisant des électrodes de platine minces. Cette méthode offre un moyen fiable pour transfecter des zones spécifiques du cerveau moyen et un outil utile pour les études in vivo.
Introduction
La reconnaissance de petits ARN non-codants que les joueurs supplémentaires pour l'expression du gène a lancé une nouvelle complexité à la réglementation génomique programmation / de gène. Différentes espèces d'ARN non-codants ont une importance fonctionnelle dans les cellules neuronales, y compris les petits ARN non-codant 1-4. Les microARN miR (ou miARN) par exemple montrent des profils d'expression distincts et l'évolution dans le cerveau en développement 5. Ciblée dans électroporation in ovo d'embryons de poulet offre une occasion unique pour le contrôle temporelle et spatiale de l'expression génique et de la répression au cours du développement.
Cette vidéo montre les différentes étapes de réalisation d'expression ectopique de mirs dans des zones spécifiques du cerveau moyen de poussin en utilisant l'électroporation in ovo 6-10. Pour assurer un effet de longue durée de ces petits ARN non codants dans les cellules, la séquence d'ADN de mirs ont été clones dans des vecteurs de mono-ou bi-cistroniques. Pour en électroporation in ovo, miR contenant vecteur est injecté dans le tube neural par exposition du mésencéphale embryonnaire après avoir effectué une petite fenêtre dans la coquille de l'oeuf. Pour transfecter des zones spécifiques du petit plus mésencéphale (anode) et moins (cathode) électrodes de platine sont placés à des positions spécifiques. Pour la transfection du mésencéphale ventral, l'anode est placée sous le mésencéphale ventral gauche et la cathode au-dessus de la moitié droite du mésencéphale avant l'application d'un courant. L'ouverture dans la coquille d'oeuf est fermé avec la bande et les embryons sont incubés pendant aussi longtemps que nécessaire pour toute l'analyse. Cette méthode a été décrite par Muramatsu et al. 6 et amélioré par Momose et al. 8 pour la zone transfection spécifique.
Vue d'ensemble schématique.
- L'embryon dans l'œuf est exposée en coupant une petite fenêtre en ee coquille.
- Le vecteur (s) en solution est injecté dans le mésencéphale en utilisant un micro-capillaire.
- Deux électrodes placées parallèlement - ou en dessous et au-dessus de l'embryon, - générer un champ électrique pulsé.
- Le champ électrique crée temporairement des pores dans la membrane cellulaire, ce qui facilite l'entrée dans la cellule par l'ADN chargé négativement (ou d'ARN) attirés par l'anode 11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Une. Exigences pour les ovo En électroporation
- Préparation de la construction de vecteur: miR amorces sens et antisens ont été conçus après les instructions de Ambion, recuits et ligaturées dans Apal / digéré par EcoRI U6.1 vecteur pSilencer. Après une transformation réussie des clones résultants a été cultivée et pSilencer plasmide a été isolé par la méthode de la lyse alcaline à l'aide d'un kit de préparation Qiagen midi.
- Électrodes: Les électrodes peuvent être achetés ou facilement être construits 13. Nous utilisons des électrodes de self-made de fil de platine (Φ = 0,2, 0,25 ou 0,5 mm de diamètre) ou, dans certains cas, un fil-électrode de tungstène encore plus faible (Φ = 0,1 mm) 8 en fonction de la zone que nous voulons pour l'électroporation. Pour éviter de brûler du tissu, nous utilisons en règle générale la plus proche du tissu le plus mince des électrodes. Pour large électroporation de mésencéphale, nous utilisons 0,5 fils de platine mm soudées à un tube laiton / acier inoxydablearbre et fixée à un porte-électrode avec un rayon de 5.3 mm (figure 1). Pour l'électroporation des domaines spécifiques, on utilise 0,25 mm anodes en fil de platine de 0,2 mm et un fil de platine ou de tungstène de 0,1 mm de la cathode à une distance d'environ 1 mm ou moins.
- Solutions: Demandez les solutions suivantes Prêt:
- Assortie de poulet à l'autoclave, pH 7,5 (9,0 g NaCl, 0,42 g de KCl, 0,24 g de CaCl2, dissoudre dans 1 L d'eau distillée).
- PBS (NaCl 8 g, 0,2 g de KCl, 0,24 g de KH 2 PO 4, 1,44 g de Na 2 HPO 4, dissoudre dans 1 litre de H 2 O distillée).
- Fast Green: solution mère à 10 mg / ml H 2 O distillée
- Encre de séchage lent (moins de laque et donc moins empoisonnement de l'embryon). Remarque: un filtre dichroïque bleu fixé à une lampe à fibre optique tel que décrit dans Canto-Soler et Adler 14 améliore le contraste et peut éliminer la nécessité d'injecter de l'encre.
Figure 1. Diagramme schématique des électrodes et du porte-électrode. (A, B, C), le fil de platine est soudé à un côté d'un arbre tubulaire en acier inoxydable. Un trou a été percé dans l'autre extrémité de l'arbre tubulaire ainsi que des fiches à broches peuvent s'adapter po (A) et de fils de couleur rouge bleu ont été connectées aux fiches à broches. À l'autre extrémité du fil a été installé sur les fiches bananes qui travaillent avec les prises électriques de la électroporateur. (A, C) Le fil de platine a été plié en un ange de 90 °. Une couche de vernis à ongles isolé l'arbre au-dessus du coude.
2. Préparatifs directement devant Dans ovo électroporation
- Préparer le matériel suivant:
- Diluer l'encre avec du poulet sonnerie 01:06, ajouter la solution antibiotique-antimycosique (100x de GIBCo) 1:100.
- Préparer la solution de vecteur: 1-2 pg / pl par ADN spécifique en H 2 O complété avec Green rapide (1:20).
- Stériliser pinces, ciseaux, aiguilles de tungstène et des électrodes avec 70% d'éthanol.
- Tirer micropipettes pour l'injection de l'acide nucléique à partir de capillaires en verre de borosilicate (longueur à diamètre extérieur: 100 mm x 0,9 mm). Nous utilisons simple extracteur PUL-1 (WPI, Berlin) avec les paramètres indiqués dans le tableau 1.
- Régler les paramètres de l'électroporateur comme indiqué dans le tableau 2.
| Paramètres | Valeurs |
| Chaleur | 350 |
| Tirer | 100 |
| Vitesse 50 | |
| Retard | 200 |
Tableau 1. Réglages pour PUL-1
| Paramètres | Valeurs |
| Fréquence | 50 Hz |
| Retard | 20-50 msec * |
| Largeur | 20 msec |
| Tension | 8-25 V * |
| Impulsion | 3 - 5 fois |
| * Selon le diamètre de l'électrode et de la distance. S'il vous plaîten tenir compte lors du changement de l'un des paramètres. | |
Tableau 2. Réglages pour le stimulateur d'impulsions
- Préparer des embryons de poulet pour l'électroporation:
- Incuber des oeufs de poule fécondés, de leur côté plus de 37 ° C avec 65% d'humidité pour 39 h d'acquérir embryons entre Hamburger & Hamilton (HH) met en scène 15 9-11. L'embryon s'installe à la partie supérieure de l'œuf, de sorte que vous devrait marquer avec un trait de crayon.
- Désinfecter les œufs avec 70% d'éthanol.
- Percer l'œuf à son côté plus large, où la cavité d'air devrait être.
- Retirez 1-2 ml de blanc d'oeuf. Cela détacher l'embryon de la coquille.
- Cello-bande la coquille pour éviter les éclats d'obus tombent sur l'embryon. Utilisez une paire de ciseaux pour couper une petite fenêtre dans la coquille autour de la ligne de crayon.
- Injecter un peu d'encreen dessous de la zone opaca de visualiser l'embryon.
- Faire une coupe dans la membrane vitelline avec une aiguille de tungstène aiguisées pour obtenir une meilleure accessibilité de l'embryon pour l'injection de l'acide nucléique et l'électroporation.
3. Électroporation et incubation
- Ajouter quelques gouttes de solution de Ringer chaud sur les embryons. Cela permettra de diminuer les embryons, d'éviter toute surchauffe, le collage des électrodes au tissu et à fournir un support pour le courant entre les deux électrodes.
- Injecter la solution de vecteur dans la lumière du tube neural au niveau du mésencéphale. Si le vecteur d'expression d'ADN ne contient pas de gène rapporteur (par exemple EGFP), ajouter un vecteur de gène rapporteur légèrement inférieure concentré (1 ug / ul miR vecteur exprimant à 0,9 ug / vecteur du gène rapporteur ul) à la solution d'ADN. Cela permettra d'assurer que vous reconnaissez cellules transfectées plus tard 8. Nous utilisons le vecteur soi-disant pCAX, un cadeau aimable vientm C. Krull 13.
- Pour une large transfection du mésencéphale, placer les électrodes gauche et à droite de l'embryon à la hauteur du mésencéphale. La distance entre les électrodes doit être d'environ 3-5 mm. Les autres paramètres sont 15V, 20 impulsions ms et 50 ms de retard pour HH 10. Le changement de position des deux électrodes légèrement le long de la (DV) axe dorso-ventral du mésencéphale assure une plus large transfection de cellules de la transfection de l'axe de DV.
- Pour la transfection ventrale, ajouter un peu de sonnerie de relever la tête de la membrane du jaune et placer l'anode sous mésencéphale ventral. Si la tête ne dépasse pas pousser l'électrode sous la membrane qui sépare le jaune et l'embryon d'éviter de brûler du tube neural. La cathode doit être placé au-dessus du mésencéphale dorso-latérale opposée à l'anode. Ne touchez pas le tube neural. Nous transfecter la moitié ventrale du mésencéphale gauche pour éviter des difficultés avec le développement du cœur. La distance entre les électrodesest d'environ 1-0,5 mm, le reste des paramètres sont 10V, 20 msec de large et 50 ms de retard.
- Appliquer une goutte de solution saline sur des embryons pour la refroidir et enlever les bulles d'air.
- Sceller les oeufs avec la bande et incuber pendant au moins 4 heures, le temps minimum requis pour l'expression de vecteur.
4. Fixation des embryons de poulet
- Retirez les embryons de leurs œufs.
- Embryons nettoyer sous un stéréomicroscope et d'évaluer l'ampleur de la transfection avec un microscope stéréo fluorescent.
- Fixer les embryons pendant la nuit dans 4% PFA à 4 ° C. Procéder à la coupe et / ou coloration (hybridation in situ, immunohistochimie) pour analyser les changements dans le domaine transfectées.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L'étendue de la région mésencéphalique transfectée avec miR est visible au travers de l'expression de GFP à partir d'un vecteur rapporteur injectée en même temps que le vecteur exprimant miR (figure 2). En utilisant des électrodes en platine d'un diamètre de 0,5 mm et placée parallèlement à l'axe AP du conduit mésencéphale normalement à la transfection d'une large zone le long de la et DV-AP-axe, dont rhombencéphale, le mésencéphale, et parfois diencéphale (figures 2A et B). La taille du résultat de la électrodes dans un large champ électrique appliqué à la région du cerveau et, par conséquent une grande surface de transfectée.
Il est difficile de cibler avec précision une zone comme par exemple le mésencéphale ventral. La réduction de la distance entre les électrodes de 0,5 mm pour parvenir à un champ électrique plus faible est souvent toxiques pour l'embryon et conduit à des artefacts. Nous avons utilisé des électrodes avec des diamètres plus petits (0,2 mm, 0,25 mm ou 0,1 mm platine fil de tungstène aiguisé), qui offrent des tra plus localiséensfection comme celle du cerveau ventral, qui est difficile à atteindre (figures 2C-I). Les petites électrodes réduire le champ électrique appliqué et permettent d'insérer des électrodes beaucoup plus étroits au tissu. Figure 2F montre un exemple, où l'ensemble de mésencéphale ventral avait été transfectée. Dans les figures 2G et 2H zones ventrale transfectées sont plus petits, mais une partie du cerveau postérieur (2F) ou diencéphale (2H) sont également transfectées. Sur la figure 2G, l'anode a été placé sous le milieu du cerveau postérieur et de transfecter les deux zones ventrales. Figure 2H montre un exemple d'une anode pas bien isolé avec du vernis à ongles le long de l'arbre. Ainsi, non seulement la zone ventrale autour du MHB exprime miR / GFP, mais aussi la dorsale antérieure mes-et di-encéphale, où l'arbre de l'anode avait été placée. La distribution miR / GFP ventral spécifique sur les figures 2C-I est le résultat de la localechamp électrique nous appliquons avec les électrodes plus petites. Pris dans leur ensemble, avec de petites électrodes et les champs électriques, nous pouvons exprimer l'ADN / ARN dans des zones plus restreintes comme mésencéphale ventral.
Depuis notre vecteur d'expression de microARN ne contient pas de gène rapporteur, nous mélangeons dans un vecteur exprimant la GFP dans un rapport de 1 ug / ul à 0,9 ug / ul, respectivement. Le ratio presque égal assure que la zone transfectées microARN et GFP presque complètement chevauchement (voir Momose et al. 8 et expérience). Afin de pouvoir juger de l'étendue de la zone devient important lorsque transfectée seule une petite zone contenant des types spécifiques de cellules est transfectée ou les cellules transfectées sont utilisées pour la qRT-PCR. Une concentration beaucoup moins du gène rapporteur peut conduire à des cellules exprimant la GFP sous le niveau de détection. La force de l'expression de n'importe quel vecteur transfecté dépend non seulement de la concentration du vecteur utilisé, mais également sur le promoteur. Nos vecteurs sont U6-promoteur driven (exprimant miARN) et promoteur de ß-actine entraînés (exprimant des protéines fluorescentes) et sont à la fois omniprésente et constitutivement active dans l'embryon de poulet.
La plupart de nos embryons sont électroporation à gauche, sauf pour (image miroir) figure 2C. Pour les expériences time-lapse, électroporation du côté droit de l'embryon est recommandé car la plupart des embryons tourner la tête vers la droite et se coucher sur le côté gauche.
Figure 2. Les résultats représentatifs. Les embryons ont été électroporation entre HH10 et HH11 et fixées aux étapes indiquées dans les images. (AC) montrent électroporations de dorsale du mésencéphale, et (DI) de mésencéphale ventral. Les flèches (D, E) indiquent le ventre, les cellules situées GFP-positives. Pour plus de détails voir le texte. Mes- Mésencéphale / mésencéphale, Di - diencéphale, Tel - télencéphale, Rhom - rhombencephalon / cerveau postérieur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cette vidéo montre une méthode efficace pour transfecter le plasmide dans les cellules neuro-épithéliales des zones spécifiques du cerveau moyen de poussin. Impulsions électriques rectangulaires de basse tension peuvent introduire de l'ADN dans des cellules du tube neural de poussin in ovo 6,16. Toutefois, la précision de ciblage de l'ADN est souvent entravée par le champ électrique de large, qui s'élève à travers les relativement grandes électrodes (Φ = 0,5 mm). Nous avons essayé de s'attaquer à ce problème en utilisant des électrodes plus petites de diamètre suivant les directives de Momose et al. 8. Pour la transfection du mésencéphale ventral, on place la cathode sous la membrane de la zone pellucide ou si l'âge de l'embryon lui permet de directement au-dessous du mésencéphale ventral. Le dernier scénario a besoin d'un peu de pratique puisque le tissu de tube mésencéphale / neural ne devrait pas être touché et endommagé par l'anode. Ajout de sonnerie peut souvent aider à lever la tête de l'embryon un peu hors de la membrane couvrant la zone pellucide.
Bien que de considérer les concentrations de gènes sont dans la cellule. Doses de gènes différents peuvent avoir des effets différents sur les cellules et les tissus. Il pourrait y avoir un effet de seuil concerné (Agoston et al. 17, par exemple) ou des effets différents, classés. Nous testons normalement diffélocation concentrations de la miR exprimer (0,5-2 pg / pl) vecteur et analyser les changements dans la morphologie ou de la protéine / gène-expression. Les effets peuvent être testés in vivo en utilisant l'immunohistochimie, un capteur 18 ou des vecteurs d'ARN par hybridation in situ.
Cette technique offre également de tester la force et la localisation de toute activité de miR spécifique en utilisant par exemple un vecteur reporter / double capteur de fluorescence comme décrit dans De Pietri Tonelli et al. 18 in vivo. Ils utilisent un vecteur contenant un rapporteur GFP et un capteur DP miR. Le DP est suivie par une séquence miR gratuit. Tandis que l'expression de la GFP identifie les cellules transfectées avec succès, la fluorescence rouge (RFP) indique l'absence de la miR enquête, et la disparition de la fluorescence rouge trahit la présence du miR. Cette technique peut également être utilisé pour tester la spécificité de la cible miR in vivo, en utilisant des UTR en 3 'de la séquence cible en aval de la DP.Pris ensemble, cette technique est très approprié pour les études de développement sur l'expression des gènes et la fonction dans les différents tissus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nous n'avons rien à communiquer.
Acknowledgments
Nous reconnaissons K. Mikic, qui ont contribué à la phase initiale de ce film et M. Nicolescu pour l'image miR. C. Huber a été soutenue par une bourse de la IZKF du Universtitätsklinikum Tübingen, A. Alwin Prem Anand par le programme fortune de la Universtitätsklinikum Tübingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Borosillicate glass capillaries | Hartenstein | Model: 0.9 mm | |
| Microcapillary puller | WPI, Berlin | Model: Pul1-E | |
| Electroporator | Intracel | Model: TSSIC | |
| Stereomicroscope - fluorescence | LEICA | Model: MZFLIII | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Model: Stemi | |
| Camera and software | Zeiss | Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8 |
References
- Kutter, C., Svoboda, P. miRNA, siRNA, piRNA: Knowns of the unknown. RNA Biol. 5, 181-188 (2008).
- Szell, M., Bata-Csorgo, Z., Kemeny, L. The enigmatic world of mRNA-like ncRNAs: their role in human evolution and in human diseases. Semin. Cancer Biol. 18, 141-148 (2008).
- Li, X., Jin, P. Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity. Nature reviews. Neuroscience. 11, 329-338 (2010).
- Riedmann, L. T., Schwentner, R. miRNA, siRNA, piRNA and argonautes: news in small matters. RNA Biol. 7, 133-139 (2010).
- Coolen, M., Bally-Cuif, L. MicroRNAs in brain development and physiology. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 461-470 (2009).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
- Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Nakamura, H., Watanabe, Y. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Dev. Growth Differ. 42, 199-201 (2000).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nat. Protoc. 3, 419-426 (2008).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Gene Hofschneider, P. H. transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO journal. 1, 841-845 (1982).
- Potter, H., Weir, L., Leder, P. Enhancer-dependent expression of human kappa immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 7161-7165 (1984).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn. 229, 433-439 (2004).
- Canto-Soler, M. V., Adler, R. Optic cup and lens development requires Pax6 expression in the early optic vesicle during a narrow time window. Developmental biology. , 294-2119 (2006).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev Dyn. 195, 231-272 (1992).
- Muramatsu, T., Nakamura, A., Park, H. M. In vivo electroporation: a powerful and convenient means of nonviral gene transfer to tissues of living animals (Review). Int J Mol Med. 1, 55-62 (1998).
- Agoston, Z., Li, N., Haslinger, A., Wizenmann, A., Schulte, D. Genetic and physical interaction of Meis2, Pax3 and Pax7 during dorsal midbrain development. BMC Dev Biol. 12, 10 (2012).
- De Pietri Tonelli, D., et al. Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid. Biotechniques. 41, 727-732 (2006).
