Summary
Espressione ectopica è una tecnica per chiarire il ruolo microRNA nello sviluppo del cervello. Tuttavia, il targeting aree specifiche utilizzando in elettroporazione ovo è impegnativo. Qui vi mostriamo un modo efficiente alle regioni mesencefalo ventrale e dorsale in modo selettivo l'elettroporazione.
Abstract
RNA non codificanti sono altri giocatori nella regolazione dell'espressione genica. Mirata in elettroporazione ovo di settori specifici fornisce uno strumento unico per il controllo spaziale e temporale di espressione microRNA ectopica. Tuttavia, le strutture cerebrali ventrali come mesencefalo ventrale sono piuttosto difficili da raggiungere per eventuali manipolazioni. Qui, dimostriamo un modo efficiente per l'elettroporazione di miRNA nel mesencefalo ventrale con elettrodi di platino sottili. Questo metodo offre un modo affidabile per trasfettare aree specifiche del mesencefalo e uno strumento utile per studi in vivo.
Introduction
Il riconoscimento di piccoli RNA non codificanti come lettori aggiuntivi per l'espressione genica ha lanciato una nuova complessità genomica regolamento programmazione / gene. Diverse specie di RNA non codificanti hanno importanza funzionale in cellule neurali, comprese le piccole non codificanti RNA 1-4. I microRNA (miR o miRNA), per esempio, mostrano profili di espressione distinti e mutevoli nel cervello in via di sviluppo 5. Mirata in elettroporazione ovo di embrioni di pollo offre un'opportunità unica per il controllo spaziale e temporale di espressione genica e silenziamento durante lo sviluppo.
Questo video mostra le varie fasi di esecuzione di espressione ectopica di miR in specifiche aree del mesencefalo pulcino utilizzo in ovo elettroporazione 6-10. Per garantire un effetto di lunga durata di questi piccoli RNA non codificanti nelle cellule, la sequenza di DNA di miR sono stati clonati in vettori mono o bi-cistronic. Perché in elettroporazione ovo, miR contenente vettore viene iniettato nel tubo neurale mesencefalo esponendo l'embrione dopo aver effettuato una piccola finestra nel guscio dell'uovo. Trasfezione aree specifiche del mesencefalo più piccola (anodo) e negativo (catodo) elettrodi di platino sono collocati in posizioni specifiche. Per ventrale trasfezione mesencefalo, l'anodo si trova sotto il mesencefalo ventrale sinistro e il catodo sopra la metà destra del mesencefalo prima di applicare una corrente. L'apertura nel guscio è chiusa con nastro e embrioni vengono incubati per tutto il tempo richiesto per ogni analisi. Questo metodo è stato originariamente descritto da Muramatsu et al. 6 e migliorata Momose et al. 8 per zona specifica trasfezione.
Panoramica schematica.
- L'embrione nell'uovo è esposto tagliando una piccola finestra in the guscio d'uovo.
- Il vettore (s) disciolto viene iniettato nel mesencefalo usando un micro capillare.
- Due elettrodi - disposti parallelamente o sotto e sopra l'embrione - generano un campo elettrico pulsato.
- Il campo elettrico crea temporalmente pori nella membrana cellulare, che facilitano l'ingresso nella cellula dal DNA caricato negativamente (o RNA) attratti verso l'anodo 11,12.
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Protocol
1. Requisiti per In ovo Elettroporazione
- Preparazione del costrutto vettore: miR senso e antisenso primer sono stati progettati dopo le istruzioni del Ambion, ricotte e legato in ApaI / EcoRI digerito pSilencer U6.1 vettoriale. Dopo trasformazione di successo uno dei cloni risultanti stata coltivata e pSilencer plasmide è stato isolato mediante metodo di lisi alcalina utilizzando un kit di preparazione midi Quiagen.
- Elettrodi: Gli elettrodi possono essere acquistati o facilmente essere costruite 13. Usiamo elettrodi self-made di filo di platino (Φ = 0.2, 0.25, o 0,5 millimetri di diametro) o in alcuni casi un ancora più piccolo elettrodo filo di tungsteno (Φ = 0.1 mm) 8, a seconda di quale area si vuole l'elettroporazione. Per evitare scottature di tessuto, usiamo di norma il più vicino al tessuto del diluente elettrodi. Per un'ampia elettroporazione di mesencefalo, usiamo 0,5 millimetri fili di platino saldati ad un tubolare in ottone / acciaio inoxalbero e fissato ad una porta elettrodi con una distanza di 3-5 mm (figura 1). Per l'elettroporazione di aree specifiche, usiamo 0,25 millimetri anodi filo di platino e 0,2 millimetri filo di platino o 0,1 millimetri di tungsteno per il catodo con una distanza approssimativa di 1 mm o meno.
- Soluzioni: hanno le seguenti soluzioni pronte:
- Ringer pollo autoclavato, pH 7.5 (9.0 g NaCl, 0,42 g KCl, CaCl2 0,24 g, sciogliere in 1 L di acqua distillata).
- PBS (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 0.24 g di KH 2 PO 4, 1,44 g di Na 2 HPO 4, sciogliere in 1l distillata H 2 O).
- Veloce Verde: soluzione stock 10 mg / ml di H 2 O distillata
- Inchiostro essiccazione lenta (meno gommalacca e quindi meno avvelenamento per l'embrione). Nota: Un filtro dicroico blu collegata a una lampada a fibre ottiche come descritto nel canto-Soler e Adler 14 migliora il contrasto e può eliminare la necessità di iniettare inchiostro.
Figura 1. Schema di elettrodi e porta elettrodo. (A, B, C) filo di platino è stato saldato su un lato di un albero tubolare in acciaio inox. Un foro è stato praticato nell'altro lato dell'albero tubolare così che le spine possono adattarsi in (A) rosso e fili di colore blu sono stati collegati alle spine. All'estremità opposta il filo è stato montato connettori a banana che lavorano con le prese elettriche del electroporator. (A, C) Il filo di platino è stato piegato in un angelo di 90 °. Uno strato di smalto isolato dell'albero sopra la piega.
2. Preparazioni direttamente prima in ovo Elettroporazione
- Preparare il seguente materiale:
- Diluire Ink con pollo Ringer 01:06, aggiungere la soluzione antibiotica-antimicotica (100x da Gibco) 1:100.
- Preparare la soluzione di vettore: 1-2 mg / mL per DNA specifico in H 2 O integrato con verde veloce (1,20).
- Sterilizzare pinze, forbici, ago di tungsteno e gli elettrodi con il 70% di etanolo.
- Tirare micropipette per l'iniezione di acido nucleico da capillari di vetro borosilicato (lunghezza e il diametro esterno: 100 mm x 0.9 mm). Usiamo un semplice estrattore PUL-1 (WPI, Berlino) con le impostazioni mostrate nella Tabella 1.
- Impostare i parametri del electroporator come mostrato nella Tabella 2.
| Parametri | Valori |
| Calore | 350 |
| Tirare | 100 |
| Velocità 50 | |
| Ritardo | 200 |
Tabella 1. Impostazioni per PUL-1
| Parametri | Valori |
| Frequenza | 50 Hz |
| Ritardo | 20-50 msec * |
| Larghezza | 20 msec |
| Tensione | 8-25 V * |
| Impulso | 3 - 5 volte |
| * A seconda del diametro dell'elettrodo e la distanza. Per favoretenerne conto quando si cambia uno dei parametri. | |
Tabella 2. Impostazioni per lo stimolatore Pulse
- Preparare embrioni di pollo per l'elettroporazione:
- Incubare uova di gallina fecondate dal loro lato più lungo a 37 ° C con 65% di umidità per 39 ore per acquisire embrioni tra Hamburger & Hamilton (HH) mette in scena 15 9-11. L'embrione si deposita nella parte più alta delle uova, così si dovrebbe segnare con un tratto di matita.
- Disinfettare le uova con il 70% di etanolo.
- Perforare l'uovo al suo lato più ampio, in cui la cavità d'aria dovrebbe essere.
- Rimuovere 1-2 ml di bianco d'uovo. Questo staccare l'embrione dal guscio d'uovo.
- Cello-tape guscio d'uovo per evitare scheggiature sul guscio di cui l'embrione. Utilizzare un paio di forbici per tagliare una piccola finestra nel guscio attorno alla linea di matita.
- Iniettare un po 'di inchiostrosotto la zona opaca per visualizzare l'embrione.
- Effettuare un taglio nella membrana vitellina con un ago di tungsteno affilato per ottenere una migliore accessibilità dell'embrione iniettabile acido nucleico ed elettroporazione.
3. Elettroporazione e incubazione
- Aggiungere poche gocce di soluzione calda di Ringer sulle embrioni. Questo abbasserà gli embrioni, evitare il surriscaldamento, attaccare degli elettrodi al tessuto e fornire un mezzo per la corrente tra i due elettrodi.
- Iniettare il vettore soluzione nel lume del tubo neurale a livello del mesencefalo. Se l'espressione del DNA vettore contiene alcun gene reporter (es. EGFP), aggiungere un vettore gene reporter leggermente inferiore concentrato (1 mg / mL miR esprimere vettore a 0,9 mg / mL gene reporter vector) alla soluzione di DNA. Questo farà sì che si riconoscono cellule transfettate dopo 8. Usiamo il cosiddetto vettore pCAX, un gentile dono from C. Krull 13.
- Per un'ampia trasfezione del mesencefalo, posizionare gli elettrodi sinistra e destra dell'embrione all'altezza del mesencefalo. La distanza tra gli elettrodi deve essere di circa 3-5 mm. Le altre impostazioni sono 15V, 20 impulsi msec e 50 msec di ritardo per HH 10. Modifica della posizione dei due elettrodi leggermente lungo la (DV) asse dorso-ventrale del mesencefalo assicura un più ampio trasfezione di cellule trasfezione asse DV.
- Per la trasfezione ventrale, aggiungere qualche Ringer per sollevare la testa dalla membrana tuorlo e posizionare l'anodo sotto mesencefalo ventrale. Se la testa non fanno spingere l'elettrodo sotto la membrana che separa tuorlo e embrioni per evitare scottature del tubo neurale. Il catodo deve essere posto sopra il dorso lateralmente mesencefalo opposto verso l'anodo. Non toccare il tubo neurale. Abbiamo transfettare la metà ventrale sinistro del mesencefalo per evitare difficoltà con lo sviluppo del cuore. La distanza tra gli elettrodiè di circa 1-0,5 mm, il resto delle impostazioni sono 10V, larghezza di 20 msec e 50 msec di ritardo.
- Applicare un'altra goccia di Saline sopra degli embrioni per raffreddarlo e rimuovere le bolle d'aria.
- Sigillare le uova con il nastro e incubare per almeno 4 ore, il tempo minimo richiesto per il vettore di espressione.
4. Fissazione di pollo embrioni
- Rimuovere gli embrioni dalle loro uova.
- Embrioni Pulire sotto uno stereomicroscopio e valutare il grado di trasfezione con un microscopio a fluorescenza stereo.
- Fissare gli embrioni per tutta la notte in PFA 4% a 4 ° C. Procedere con sezionamento e / o colorazione (ibridazione in situ, immunoistochimica) per analizzare i cambiamenti nella zona transfettate.
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Representative Results
L'estensione dell'area mesencefalo trasfettate con miR è visibile attraverso l'espressione di GFP da un vettore giornalista iniettato insieme al miR esprimendo vettore (Figura 2). Utilizzando elettrodi di platino con un diametro di 0,5 mm e collocato parallelamente all'asse AP di porta mesencefalo normalmente alla trasfezione di una vasta area lungo la-DV e AP-asse, compresi hindbrain, mesencefalo e talvolta diencefalo (Figure 2A e B). Le dimensioni degli elettrodi risultati in un campo elettrico un'ampia applicato alla regione cerebrale, ovvero a un'area molto ampia transfettate.
È difficile colpire con precisione un'area come ad esempio il mesencefalo ventrale. Riducendo la distanza tra gli elettrodi 0,5 mm a raggiungere un campo elettrico più piccolo è spesso tossici per l'embrione e comporta difetti. Abbiamo usato gli elettrodi con diametri più piccoli (0,2 millimetri, 0,25 millimetri di platino o 0,1 millimetri di filo di tungsteno affilato), che offrono TRA più localizzatinsfection come quella del cervello ventrale, che è difficile da raggiungere (figure 2C-I). Elettrodi piccoli riducono il campo elettrico applicato e consentono di inserire gli elettrodi molto più vicino al tessuto. Figura 2F mostra un esempio, in cui l'intero mesencefalo ventrale era stato transfettate. Nelle figure 2G e 2H le zone ventrali trasfettate sono più piccoli, ma parte della hindbrain (2F) o diencefalo (2H) vengono transfettate. In Figura 2G, l'anodo è stata posta sotto il metà e hindbrain trasfezione entrambe le aree ventrali. Figura 2H mostra un esempio di un anodo non ben isolato con smalto lungo l'albero. Così, non solo l'area ventrale intorno al MHB esprime miR / GFP, ma anche la dove era stato posto l'albero del anodo anteriore dorsale mes-e di-encefalo,. La ventrale distribuzione miR / GFP specifico nelle figure 2C-I è un risultato dal localecampo elettrico applichiamo con gli elettrodi più piccoli. Nel loro insieme, con elettrodi più piccoli e campi elettrici possiamo esprimere DNA / RNA in aree più ristrette come mesencefalo ventrale.
Dal momento che la nostra espressione di microRNA vettore contiene alcun gene reporter, mescoliamo in un GFP che esprimono vettore in un rapporto di 1 mg / ml a 0,9 mg / ml, rispettivamente. La quasi uguale rapporto assicura che l'area trasfettate microRNA e GFP quasi completamente sovrapposizione (vedi Momose et al. 8 e propria esperienza). Per poter valutare l'estensione dell'area trasfettate diventa importante quando solo una piccola area contenente specifici tipi cellulari è trasfettato o le cellule transfettate sono utilizzati per qRT-PCR. A meno concentrazione del gene reporter potrebbe portare a cellule esprimenti GFP sotto il livello di rilevamento. La forza di espressione del vettore trasfettate dipende non solo dalla concentrazione del vettore utilizzato, ma anche sul promotore. I nostri vettori sono U6-promotore DRIVit (che esprime miRNA) e ß-actina promotore guidato (che esprime proteine fluorescenti) e sono entrambi ubiquitariamente e costitutivamente attivo nella embrione di pollo.
La maggior parte dei nostri embrioni sono elettroporati a sinistra ad eccezione di Figura 2C (immagine speculare). Per gli esperimenti time-lapse, elettroporazione del lato destro dell'embrione è raccomandato in quanto la maggior parte degli embrioni girare la testa verso destra e si trovano sul fianco sinistro.
Figura 2. Risultati rappresentativi. Embrioni sono stati elettroporati tra HH10 e HH11 e fissati ai livelli indicati nelle tabelle. (AC) mostrano electroporations del mesencefalo dorsale, e (DI) del mesencefalo ventrale. Le frecce in (D, E) indicano ventre situati, GFP cellule positive. Per maggiori dettagli si veda il testo. Mes- Mesencefalo / mesencefalo, Di - diencefalo, Tel - telencefalo, Rhom - rhombencephalon / hindbrain.
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Discussion
Questo video mostra un metodo efficace per trasfettare plasmide nelle cellule neuroepiteliale di aree specifiche del mesencefalo pulcino. Impulsi elettrici rettangolari di bassa tensione possono introdurre DNA in cellule del tubo neurale pulcino in ovo 6,16. Tuttavia, la precisione di targeting DNA è spesso ostacolata dal campo elettrico ampia, che sale attraverso le relativamente grandi elettrodi (Φ = 0,5 mm). Abbiamo cercato di affrontare questo problema utilizzando elettrodi più piccoli di diametro seguendo le linee guida del Momose et al. 8. Per ventrale trasfezione mesencefalo, poniamo il catodo sotto la membrana della zona pellucida o se l'età dell'embrione permette esattamente sotto il mesencefalo ventrale. L'ultimo scenario ha bisogno di un po 'di pratica in quanto tessuto tubo mesencefalo / neurale non deve essere toccato e danneggiato da l'anodo. Aggiunta di Ringer spesso può aiutare a sollevare la testa dell'embrione leggermente la membrana che ricopre la zona pellucida.
Anche se a prendere in considerazione le concentrazioni genica sono in cella. Dosi differenti del gene possono avere effetti diversi sulle cellule e tessuti. Ci potrebbe essere un effetto soglia in questione (cfr. Agoston et al. 17, per esempio) o differenti, effetti graduati. Normalmente prova diffeaffitto concentrazioni del miR esprimere (0,5-2 mg / mL) vettoriale e analizzare i cambiamenti nella morfologia o di proteine / espressione genica. Gli effetti possono essere testati in vivo utilizzando l'immunoistochimica, sensore vettori 18 o RNA ibridazione in situ.
Questa tecnica offre anche per testare la forza e la posizione di qualsiasi attività di uno specifico miR in vivo usando per esempio un doppio fluorescenza reporter / sensore vettore come descritto in De Pietri Tonelli et al. 18. Essi utilizzano un vettore che contiene una GFP-reporter e un sensore RFP miR. Il RFP è seguita da una sequenza di miR gratuito. Mentre l'espressione della GFP identifica le cellule trasfettate con successo, fluorescenza rossa (RFP) indica l'assenza del miR indagato, e la scomparsa di fluorescenza rossa tradisce la presenza del miR. Questa tecnica può anche essere utilizzato per verificare la specificità di bersaglio miR in vivo, utilizzando 3'UTR della sequenza bersaglio a valle di RFP.Preso insieme questa tecnica è molto appropriata per gli studi sullo sviluppo sull'espressione genica e la funzione in diversi tessuti.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Riconosciamo K. Mikic, che ha contribuito alla fase iniziale di questo film e M. Nicolescu per l'immagine miR. C. Huber è stato sostenuto da una borsa di studio del IZKF del Universtitätsklinikum Tübingen, A. Alwin Prem Anand dal programma fortuna del Universtitätsklinikum Tubinga.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Borosillicate glass capillaries | Hartenstein | Model: 0.9 mm | |
| Microcapillary puller | WPI, Berlin | Model: Pul1-E | |
| Electroporator | Intracel | Model: TSSIC | |
| Stereomicroscope - fluorescence | LEICA | Model: MZFLIII | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Model: Stemi | |
| Camera and software | Zeiss | Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8 |
References
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