I ovo Expression av mikroRNA i ventral Chick midthjernen

Summary

Ektopisk uttrykk er en teknikk for å belyse den microRNAs rolle i hjernens utvikling. Men, rettet mot bestemte områder ved hjelp av i ovo electroporation er utfordrende. Her viser vi en effektiv måte å selektivt electroporate ventrale og dorsale midthjernen regioner.

Abstract

Ikke-kodende RNA er flere spillere i regulering av genuttrykk. Målrettet i ovo electroporation av bestemte områder gir et unikt verktøy for romlig og tidsmessig kontroll av ektopisk mikroRNA uttrykk. Men ventral strukturer i hjernen som ventral midthjernen er ganske vanskelig å nå for noen manipulasjoner. Her viser vi en effektiv måte å electroporate miRNA inn ventral midthjernen ved hjelp av tynne platina elektroder. Denne metoden gir en pålitelig måte å transfektere bestemte områder av midthjernen og et nyttig verktøy for in vivo studier.

Introduction

Erkjennelsen av små ikke-kodende RNA som flere spillere for genuttrykk lansert en ny kompleksitet til genomisk programmering / genregulering. Forskjellige arter av ikke-kodende RNA har funksjonell betydning i nerveceller, inkludert små ikke-kodende RNA ^1-4. MicroRNAs (MIR eller miRNA), for eksempel vise distinkte og skiftende uttrykk profiler i utviklings hjerner ^fem. Målrettet i ovo electroporation av kyllingembryo gir en unik mulighet for temporal og romlig kontroll av genuttrykk og lyddemping under utvikling.

Denne videoen viser de ulike trinnene i å utføre ektopisk uttrykk for Mirs i bestemte områder av dama midthjernen bruker i ovo elektroporering ^6-10. For å sikre en langvarig effekt av disse små ikke-kodende RNA i celler, ble DNA-sekvensen av Mirs klonet inn mono-eller bi-cistronic vektorer. For i ovo electroporation, Mir inneholder vEctor injiseres i midthjernen nevralrøret ved å utsette fosteret etter at et lite vindu i eggeskallet. For å transfektere bestemte områder av midthjernen plus (anode) og minus (katoden) platina elektroder er plassert på bestemte posisjoner. For ventral midthjernen transfeksjon, blir anode plassert under den venstre ventral midthjernen og katoden over den høyre halvdelen av midthjernen før påføring av en strøm. Åpningen i eggeskallet er lukket med tape, og embryoene ble inkubert så lenge som er nødvendig for en hvilken som helst analyse. Denne fremgangsmåte ble opprinnelig beskrevet av Muramatsu et al. ^6. og forbedret av Momose et al. ⁸ for bestemt område transfeksjon.

Skjematisk oversikt.

1. Embryoet i egget er eksponert ved å skjære et lite vindu inn i the eggeskall.
2. Det oppløste vektor (e) blir injisert inn i midthjernen ved hjelp av et mikrokapillært.
3. To elektroder - som er lagt inn parallelt eller under og over embryoet - å generere et pulset elektrisk felt.
4. Det elektriske feltet timelig skaper porene i cellemembranen, noe som letter adgang til cellen av den negativt ladede DNA (eller RNA) tiltrekkes til anoden ^11,12.

Protocol

En. Krav til In ovo Electroporation

1. Klargjøring av vektorkonstruksjon: Mir fornuft og antisense primere ble utformet etter instruksjoner fra Ambion, glødet og legert inn ApaI / EcoRI fordøyd pSilencer U6.1 vektor. Etter vellykket endring av en av de resulterende klonene ble dyrket og pSilencer plasmid ble isolert ved alkalisk lysis metoden ved hjelp av et Quiagen midi preparat kit.
2. Elektroder: Elektroder kan kjøpes eller kan lett bygges ^13.. Vi bruker selvlagde elektroder av platinatråd (Φ = 0,2, 0,25 eller 0,5 mm i diameter), eller i noen tilfeller en enda mindre wolframtrådelektroder (Φ = 0,1 mm) ⁸ avhengig av hvilket område som vi ønsker å electroporate. For å unngå scorching av vev, bruker vi som regel desto nærmere til vevet den tynnere elektrodene. For bred elektroporering av midthjernen, bruker vi 0,5 mm platina ledninger loddet til en messing / rustfritt stål rørformetakselen og festet til en elektrodeholder med en avstand på 3-5 mm (fig. 1). For å electroporate bestemte områder, bruker vi 0,25 mm av platinatrådanoder og 0,2 mm platinatråd eller 0,1 mm wolfram for katoden med en omtrentlig avstand på 1 mm eller mindre.
3. Løsninger: Har følgende løsninger klare:
   1. Autoklavert kylling Ringer, pH 7,5 (9,0 g NaCl, 0,42 g KCl, 0,24 g CaCl2, oppløses i en l destillert vann).
   2. PBS (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 0,24 g KH ₂ PO4, 1,44 g Na ₂ HPO _4, oppløses i 1 liter destillert _H2O).
   3. Rask Grønn: stamløsning 10 mg / ml destillert H ₂ O
   4. Langsom tørking blekk (mindre skjellakk og dermed mindre forgiftning for fosteret). Merk: En blå dikroisk filter festet til en fiberoptisk lampe som beskrevet i Canto-Soler, og Adler ¹⁴ øker kontrasten og kan eliminere behovet for å injisere blekk.

Figur 1. Prinsippskisse av elektroder og elektrodeholder. (A, B, C) ​​platinatråd ble loddet til den ene side av en rustfri rørformet skaft. Et hull ble boret inn i den andre siden av røret akselen dermed at støpsler kan passe inn i. (A) Rød og blå fargede ledningene ble koblet til de støpsler. I motsatt ende av ledningen ble montert på banankontakter som arbeider med de elektriske kontaktene på electroporator. (A, C) Den platinatråd ble bøyd i en engel av 90 °. Et lag av neglelakk isolert akselen over bøyen.

2. Forberedelser rett før i ovo Electroporation

1. Forbered følgende materiale:
   1. Spe Ink med kylling Ringer 01:06, legge Antibiotika Anti-fungal løsning (100x fra Gibco) 1:100.
   2. Forbered vektor løsning: 1-2 mikrogram / ​​mL per spesifikke DNA i H ₂ O supplert med Fast Grønn (01:20).
   3. Steriliser pinsett, saks, wolfram nål og elektroder med 70% etanol.
   4. Trekk mikropipetter for nukleinsyre injeksjon fra borsilikatglass kapillærer (lengde til ytre diameter: 100 mm x 0,9 mm). Vi bruker en enkel avtrekker PUL-en (WPI, Berlin) med innstillingene vist i tabell 1.
   5. Sett parameterne for electroporator som vist i Tabell 2.

Parametere	Verdier
Hete	350
Trekk	100
Velocity 50
Forsinkelse	200

Tabell 1. Innstillinger for PUL-en

Parametere	Verdier
Frekvens	50 Hz
Forsinkelse	20 - 50 ms *
Bredde	20 msek
Spenning	8-25 V *
Puls	3 - 5 ganger
* Avhengig av elektroden diameter og avstand. Vennligstta dette i betraktning når du bytter en av parametrene.

Tabell 2. Innstillinger for Pulse Stimulator

2. Forbered kyllingembryo for elektroporering:
   1. Inkuber befruktede kylling egg på sine lengre side ved 37 ° C med 65% luftfuktighet for 39 timer for å skaffe embryoer mellom Hamburger & Hamilton (HH) iscenesetter ¹⁵ 9-11. Fosteret legger seg på den øverste delen av egget, så du bør markere det med en blyantstrek.
   2. Desinfiser eggene med 70% etanol.
   3. Pierce egg på sitt bredere side, der luftrommet bør være.
   4. Fjern 1-2 ml av eggehvite. Dette vil løsne embryo fra eggeskallet.
   5. Cello-tape eggeskallet for å unngå skall splinter faller på embryo. Bruk en saks til å klippe et lite vindu inn i eggeskallet rundt blyantstrek.
   6. Injisere litt blekkunder området opaca å visualisere fosteret.
   7. Gjør et kutt i vitelline membran med en skjerpet tungsten nål for å oppnå en bedre tilgjengelighet av embryo for nukleinsyre injeksjon og elektroporering.

Tre. Electroporation og Inkubasjon

1. Tilsett noen dråper varmt Ringers løsning på embryoene. Dette vil senke embryoene, unngå overoppheting, som stikker over elektrodene til vev og gi et medium for den strøm mellom de to elektrodene.
2. Injiser vektorløsningen inn i lumen av det nevrale røret ved midbrain nivå. Hvis DNA ekspressjonsvektor inneholder ingen reporter genet (f.eks EGFP), legge til en litt lavere konsentrert reporter genvektor (1 mikrogram / ​​mL Mir uttrykke vektor til 0,9 mikrogram / ​​mL reporter genvektor) til DNA-løsningen. Dette vil sikre at du kjenner igjen transfekterte celler senere ^åtte. Vi bruker den såkalte pCAX vektor, en slags gave from C. Krull ^13.
3. For en bred transfeksjon av midthjernen, plassere elektrodene venstre og høyre for embryo på høyden av midthjernen. Avstanden mellom elektrodene skal være ca 3-5 mm. De andre innstillingene er 15V, 20 msek pulser og 50 msek forsinkelse for HH 10. Endring av posisjonen til de to elektrodene litt langs den dorso-ventrale (DV) aksen av midthjernen sikrer en mer bred transfeksjon av celler DV aksen transfeksjon.
4. For ventral transfeksjon, legg til litt Ringer å heve hodet fra plommesekken og plassere anoden under ventral midthjernen. Hvis hodet ikke stiger skyve elektroden under membranen som skiller plomme og embryo for å unngå scorching av neural røret. Katoden bør plasseres over midthjernen dorso-sideveis motsatt av anoden. Ikke berør nevralrøret. Vi transfektere venstre ventral halvdel av midthjernen for å unngå eventuelle problemer med hjerte utvikling. Avstanden mellom elektrodeneer rundt 1 til 0,5 mm, resten av innstillingene er 10V, 20 ms bredde og 50 msek forsinkelse.
5. Påfør en dråpe av Saline på toppen av embryoene for å kjøle det ned og fjerne luftbobler.
6. Forsegl eggene med tape og inkuberes i minst 4 timer, og den minste tid som kreves for vektoruttrykk.

4. Fiksering av kyllingembryoer

1. Fjern embryoene fra eggene sine.
2. Rene embryoer i henhold til en stereo og vurdere omfanget av transfeksjon med et fluorescerende stereo mikroskop.
3. Fix embryoene over natten i 4% PFA ved 4 ° C. Fortsett med seksjonering og / eller farging (in situ hybridisering, immunhistokjemi) for å analysere endringer i transfekterte området.

Representative Results

Omfanget av midthjernen område transfektert med miR er synlig gjennom ekspresjon av GFP fra en reporter vektor injisert sammen med miR uttrykker vektoren (figur 2). Ved å bruke platina-elektroder med en diameter på 0,5 mm og plassert parallelt med ap-aksen av midthjernen fører normalt til transfeksjon av et bredt område langs DV-og AP-aksen, inklusive hindbrain, midthjernen og noen ganger diencephalon (figurene 2A og B). Størrelsen av elektrodene resulterer i et stort elektrisk felt påføres på hjerneregion, og dermed et stort transfektert området.

Det er vanskelig å nøyaktig rettet mot et område som for eksempel den ventrale midthjernen. Reduksjon av avstanden mellom de på 0,5 mm elektroder for å oppnå en mindre elektrisk felt ofte er giftig for embryoet og fører til gjenstander. Vi brukte elektroder med mindre diameter (0,2 mm, 0,25 mm platina eller 0,1 mm skjerpet tungsten wire), som tilbyr mer lokaliserte transfection som det av den ventrale hjernen, som er vanskelig å nå (figurene 2C-I). Mindre elektroder reduserer det elektriske felt påføres og gjør det mulig å sette elektrodene mye nærmere til vevet. Figur 2F viser et eksempel, hvor hele ventral midthjernen hadde blitt transfektert. I figurene 2G og 2H de transfekterte ventral områdene er mindre, men en del av hindbrain (2F) eller diencephalon (2H) også er transfektert. I figur 2G, ble anoden plassert under midten og hindbrain å transfektere begge ventral områder. Figur 2 H viser et eksempel på en anode ikke godt isolert med neglelakk langs akselen. Altså ikke bare ventralområdet rundt MHB uttrykker Mir / GFP men også rygg fremre mes-og di-encephalon, hvor skaftet av anoden hadde blitt plassert. Den spesifikke ventral Mir / GFP fordelingen i figur 2C-I er et resultat fra den lokaleelektrisk felt vi anvende de mindre elektroder. Tatt sammen, med mindre elektroder og elektriske felt vi kan uttrykke DNA / RNA i mer begrensede områder som ventral midthjernen.

Siden våre mikroRNA ekspresjonsvektoren ikke inneholder noe reportergen, vi blande i en vektor som uttrykker GFP i et forhold på 1 pg / pl til 0,9 mikrogram / mikroliter, respektivt. Den nesten likt forhold sikrer at mikroRNA og GFP transfekterte området nesten helt overlapping (se Momose et al. ⁸ og egen erfaring). For å være i stand til å bedømme graden av transfekterte området blir viktig når bare et lite område med spesifikke celletyper transfekteres eller de transfekterte celler brukes for QRT-PCR. En mindre konsentrasjon av reporter-genet kan lede til celler som uttrykker GFP under deteksjonsgrensen. Styrken av ekspresjon av hvilken som helst vektor transfektert avhenger ikke bare av konsentrasjonen av den brukte vektoren, men også på promotoren. Våre vektorer er U6-promoter drivno (uttrykke miRNA) og ß-aktin promoter drevet (uttrykke fluorescerende proteiner) og er både overalt og konstitutivt aktiv i chick embryo.

De fleste av våre embryoer er elektroporert på venstre side med unntak av figur 2C (speilbilde). For time-lapse eksperimenter, er elektroporering av høyre side av embryoet anbefalt siden de fleste embryoer snu hodet mot høyre og ligge på sin venstre side.

Figur 2. Representative resultater. Embryoene ble elektroporert mellom HH10 og HH11 og fast på etapper som er angitt i bildene. (AC) viser electroporations av ryggmidthjernen, og (DI) av ventral midthjernen. Pilene i (D, E) indikerer ventrally located, GFP positive celler. For mer detaljer se tekst. Mes- Mesencephalon / midthjernen, Di - diencephalon, Tlf - telencephalon, Rhom - rhombencephalon / hindbrain.

Discussion

Denne videoen viser en effektiv metode for å transfektere plasmid inn i neuroepithelial cellene i bestemte områder av dama midthjernen. Rektangulære elektriske pulser av lav spenning kan innføre DNA i cellene i chick nevralrøret i ovo ^6,16. Imidlertid er nøyaktigheten av DNA målretting ofte hindret av den store elektriske felt, som stiger opp gjennom den relativt store elektroder (Φ = 0,5 mm). Vi prøvde å takle det problemet ved hjelp av elektroder mindre i diameter følge retningslinjene for Momose et al. ^8. For ventral midthjernen transfeksjon, plasserer vi katoden under membran av området pellucida eller hvis en alder av embryoet gjør den like under ventral midthjernen. Det siste scenariet trenger litt praksis siden midthjernen / nevralrøret vev ikke skal bli berørt og skadet av anoden. Legge Ringer kan ofte bidra til å løfte hodet av embryoet litt utenfor membranen som dekker området pellucida.

Selv om å vurdere er genet konsentrasjoner i cellen. Ulike genet doser kan ha ulik effekt på celler og vev. Det kan være en terskeleffekt involvert (se Agoston et al. ^17, for eksempel) eller forskjellige, gradert effekter. Vi normalt teste forskjellerleie konsentrasjoner av Mir uttrykke (0,5-2 mg / mL) vektor og analysere endringer i morfologi eller protein / gen-uttrykk. Effekter kan testes in vivo ved hjelp av immunhistokjemi, vektorer sensor ¹⁸ eller RNA in situ hybridisering.

Denne teknikken har også til å teste styrke og plasseringen av en hvilken som helst aktivitet av en bestemt miR in vivo ved hjelp av for eksempel en dual fluorescens reporter / sensor vektor som beskrevet i De Pietri Tonelli et al. ^18.. De bruker en vektor som inneholder en GFP-reporter og en RFP Mir sensor. RFP er etterfulgt av en gratis Mir sekvens. Mens GFP ekspresjon identifiserer hell transfekterte celler, rød fluorescens (RFP) indikerer fravær av det undersøkte Mir, og forsvinningen av rød fluorescens avslører tilstedeværelsen av mir. Denne teknikken kan også brukes til å teste spesifisiteten av Mir target in vivo, ved hjelp av 3'UTR av target-sekvens i den nedstrøms RFP.Tatt sammen denne teknikken er svært passende for utviklingsstudier på genuttrykk og funksjon i ulike vev.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Borosillicate glass capillaries	Hartenstein		Model: 0.9 mm
Microcapillary puller	WPI, Berlin		Model: Pul1-E
Electroporator	Intracel		Model: TSSIC
Stereomicroscope - fluorescence	LEICA		Model: MZFLIII
Stereomicroscope	Zeiss		Model: Stemi
Camera and software	Zeiss		Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8