Em Expression in ovo de microRNA em Ventral Pintinho Midbrain

Summary

A expressão ectópica é uma técnica para elucidar o papel microRNAs no desenvolvimento do cérebro. No entanto, em áreas específicas usando a eletroporação in ovo é um desafio. Aqui, vamos mostrar uma maneira eficiente para regiões do mesencéfalo ventral e dorsal seletiva electroporate.

Abstract

RNAs não-codificantes são jogadores adicionais na regulação da expressão gênica. Alvejado em eletroporação in ovo de áreas específicas fornece uma ferramenta única para o controle espacial e temporal da expressão do microRNA ectópica. No entanto, as estruturas cerebrais ventral como mesencéfalo ventral são bastante difíceis de alcançar por quaisquer manipulações. Aqui, nós demonstramos uma forma eficiente de electroporate miRNA em mesencéfalo ventral utilizando eletrodos de platina finas. Este método oferece uma maneira confiável de transfecção de áreas específicas do cérebro médio e uma ferramenta útil para estudos in vivo.

Introduction

O reconhecimento de pequenos RNAs não-codificantes como jogadores adicionais para a expressão do gene de lançar uma nova complexidade à regulamentação de programação / gene do genoma. Diferentes espécies de RNAs não-codificantes tem importância funcional em células neurais, incluindo pequeno RNAs não-codificantes ^1-4. MicroRNAs (MIR ou miRNA), por exemplo, mostram perfis de expressão distintas e mutáveis ​​em cérebros em desenvolvimento ^5. Alvejado em eletroporação in ovo de embriões de galinha oferece uma oportunidade única para o controle temporal e espacial da expressão gênica e silenciamento durante o desenvolvimento.

Este vídeo demonstra as diferentes etapas da realização de expressão ectópica da RIM em áreas específicas do mesencéfalo garota usando eletroporação in ovo ^6-10. Para assegurar um efeito de longa duração destes pequenos RNAs não-codificantes nas células, a sequência de ADN de RIM, foram clonados em vectores de mono-ou bi-cistronic. Pois em eletroporação in ovo, miR contendo vector é injectado no tubo neural mesencéfalo expondo o embrião depois de fazer uma pequena janela na casca do ovo. Para transfectar as áreas específicas do cérebro médio mais pequeno (ânodo) e negativo (cátodo) eléctrodos de platina são colocados em posições específicas. Para a transfecção do mesencéfalo ventral, o ânodo é colocado por baixo do mesencéfalo ventral esquerdo e o cátodo acima da metade direita do cérebro médio, antes de aplicar uma corrente. A abertura na casca do ovo é fechado com fita adesiva e os embriões foram incubados durante o tempo necessário para qualquer análise. Este método foi originalmente descrito por Muramatsu et al. ⁶ e melhorado por Momose et al. ⁸ para transfecção área específica.

Visão esquemática.

1. O embrião no ovo é exposta pelo corte de uma pequena janela em the casca de ovo.
2. O vector dissolvido (s) é injectado no mesencéfalo usando um tubo capilar de micro.
3. Dois eletrodos colocados - paralelo ou por baixo e por cima do embrião - gerar um campo elétrico pulsado.
4. O campo eléctrico temporalmente cria poros na membrana da célula, que facilitam a entrada na célula de ADN carregadas negativamente (ou RNA) atraídos para o ânodo ^11,12.

Protocol

1. Requisitos para in ovo Eletroporação

1. Preparação da construção de vector: miR sentido e anti-sentido foram concebidos iniciadores após as instruções de Ambion, recozidos e ligados em Apal / EcoRI digerido pSilencer U6.1 vector. Após a transformação bem sucedida de um dos clones resultantes foram cultivadas e pSilencer plasmídeo foi isolado pelo método de lise alcalina, utilizando um kit de preparação Qiagen Midi.
2. Eletrodos: Eletrodos podem ser comprados ou facilmente ser construído ^13. Nós usamos eletrodos self-made de fio de platina (Φ = 0,2, 0,25, ou 0,5 mm de diâmetro) ou, em alguns casos, um eletrodo de fio de tungstênio ainda menor (Φ = 0,1 mm) ⁸ dependendo de qual área que queremos electroporate. Para evitar escaldante de tecido, usamos como regra o mais próximo do tecido mais fino os eletrodos. Por ampla eletroporação de mesencéfalo, usamos 0,5 milímetros fios de platina soldadas a um tubular de bronze / aço inoxidáveleixo e fixados a um suporte de eléctrodo, com uma distância de 3-5 mm (Figura 1). Para electroporate áreas específicas, usamos 0,25 milímetros ânodos de platina e 0,2 milímetros de fio de platina ou de 0,1 milímetros para o cátodo de tungsténio, com uma distância de aproximadamente 1 mm ou menos.
3. Soluções: Alguma as seguintes soluções de pronto:
   1. Campainha frango autoclavado, pH 7,5 (9,0 g de NaCl, 0,42 g de KCl, 0,24 g de CaCl2, dissolve-se em 1 L de água destilada).
   2. PBS (8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 0,24 g _de KH ₂ PO 4, 1,44 g de Na ₂ HPO _4, dissolve-se em 1 litro _{de H2O} destilada).
   3. Verde Rápido: solução de estoque de 10 mg / ml de _H2O destilada
   4. Tinta de secagem lenta (menos de goma-laca e, portanto, menos envenenamento por embrião). Nota: Um filtro dicróico azul ligado a uma lâmpada de fibra óptica, tal como descrito no Canto-Soler e Adler ¹⁴ melhora o contraste e pode eliminar a necessidade de injectar tinta.

Figura 1. Diagrama esquemático de eletrodos e suporte do eletrodo. (A, B, C) ​​de fio de platina foi soldada a um lado de um eixo tubular em aço inoxidável. Um furo foi perfurado no outro lado do eixo tubular, assim, que as tomadas de pinos pode caber dentro (A) vermelho e azul fios coloridos foram ligados às tomadas de pinos. No extremo oposto do fio foi montado para conectores bananas que trabalham com as tomadas elétricas do electroporador. (A, C) O fio de platina foi dobrado em um anjo de 90 °. Uma camada de verniz de unhas isolado no eixo acima da curva.

2. Preparativos Diretamente antes em ovo Eletroporação

1. Prepare o seguinte material:
   1. Diluir tinta com frango Ringer 1:6, adicionar solução antibiótica-antimicótica (100x de GIBCo) 1:100.
   2. Preparar a solução de vector: 1-2 mg / mL por ADN específica em _H2O suplementada com Verde Rápido (1:20).
   3. Esterilizar fórceps, tesoura, agulha de tungstênio e eletrodos com etanol 70%.
   4. Puxe micropipetas para injeção de ácido nucleico de capilares de vidro de borosilicato (comprimento e diâmetro externo: 100 mm x 0.9 mm). Usamos um puxador simples PUL-1 (WPI, Berlin) com as configurações mostradas na Tabela 1.
   5. Definir os parâmetros do electroporador como mostrado na Tabela 2.

Parâmetros	Valores
Calor	350
Puxe	100
Velocidade 50
Atraso	200

Tabela 1. Configurações para PUL-1

Parâmetros	Valores
Freqüência	50 Hz.
Atraso	20 - 50 ms *
Largura	20 mseg
Tensão	8-25 V *
Pulso	3 - 5 vezes
* Dependendo do diâmetro do eletrodo e distância. Por favorlevar isso em conta quando se muda um dos parâmetros.

Tabela 2. Configurações para o estimulador de pulso

2. Prepare embriões de galinha para eletroporação:
   1. Incubar ovos de galinha fertilizados em seu lado mais longo, a 37 ° C com 65% de umidade por 39 horas para adquirir embriões entre Hamburger & Hamilton (HH) encena ¹⁵ 9-11. O embrião se instala na parte superior do ovo, por isso você deve marcá-lo com uma linha de lápis.
   2. Desinfetar os ovos com etanol 70%.
   3. Perfurar o ovo no seu lado mais largo, onde a cavidade de ar deve ser.
   4. Remover 1-2 ml de clara de ovo. Isto irá separar o embrião da casca de ovo.
   5. Cello-tape a casca do ovo para evitar lascas de casca caindo sobre o embrião. Utilizar um par de tesouras para cortar uma pequena janela para a casca de ovo em torno da linha de lápis.
   6. Injetar um pouco de tintadebaixo da área opaca para visualizar o embrião.
   7. Faça um corte na membrana vitelina com uma agulha de tungstênio afiadas para alcançar uma melhor acessibilidade do embrião para a injeção de ácido nucleico e eletroporação.

3. Eletroporação e Incubação

1. Adicionam-se algumas gotas de solução de Ringer quente sobre os embriões. Isto irá reduzir os embriões, evitar o sobreaquecimento, a aderência dos eléctrodos ao tecido e proporcionar um meio para a corrente entre os dois eléctrodos.
2. Injectar a solução vetor dentro do lúmen do tubo neural em nível mesencéfalo. Se a expressão de DNA vector não contém qualquer gene repórter (por exemplo EGFP), adicionar um vector do gene repórter ligeiramente concentrada inferior (1 ug / ul miR vector de expressão para 0,9 ug / uL vector de gene repórter) para a solução de ADN. Isso irá garantir que você reconhece as células transfectadas depois ^8. Nós usamos o chamado vetor pCAX, um presente amável from C. Krull ^13.
3. Para uma ampla transfecção do mesencéfalo, coloque os eletrodos esquerdo e direito do embrião à altura do mesencéfalo. A distância entre os eletrodos deve ser cerca de 3-5 mm. As outras configurações são 15V, 20 pulsos ms e 50 ms de atraso para HH 10. A alteração da posição dos dois eléctrodos ligeiramente ao longo da (DV) do eixo dorso-ventral do mesencéfalo assegura um mais amplo a transfecção de células a transfecção eixo DV.
4. Para transfecção ventral, adicione um pouco de Ringer para elevar a cabeça a partir da membrana da gema e coloque o ânodo sob mesencéfalo ventral. Se a cabeça não subir empurre o eletrodo sob a membrana que separa a gema e embrião para evitar escaldante do tubo neural. O cátodo deve ser colocado por cima do mesencéfalo dorso-lateral oposto ao ânodo. Não toque no tubo neural. Nós transfecção a metade ventral esquerdo do mesencéfalo para evitar problemas com o desenvolvimento do coração. A distância entre os eléctrodosé de cerca de 1-0,5 mm, o resto das configurações são 10V, 20 de largura e 50 milissegundos de atraso ms.
5. Aplique uma gota de solução salina em cima dos embriões para esfriá-la e retirar as bolhas de ar.
6. Selar os ovos com a fita e incubar durante pelo menos 4 horas, o tempo mínimo necessário para a expressão do vetor.

4. Fixação de frango Embriões

1. Remover os embriões dos seus ovos.
2. Embriões limpa sob um microscópio estereoscópico e avaliar a extensão da transfecção com um microscópio estéreo fluorescente.
3. Corrigir os embriões durante a noite em PFA 4% a 4 ° C. Prossiga com o corte e / ou coloração (hibridização in situ, imuno-histoquímica) para analisar as mudanças na área transfectadas.

Representative Results

A extensão da área mesencéfalo transfectadas com miR é visível através da expressão de GFP a partir de um vector repórter injectado, juntamente com o vector de expressão de miR (Figura 2). Usando eléctrodos de platina com um diâmetro de 0,5 mm e colocado paralelamente ao eixo de AP de ligações mesencéfalo normalmente para a transfecção de uma área ampla e ao longo do eixo-DV AP, incluindo a parte posterior do cérebro, e por vezes mesencéfalo diencéfalo (Figuras 2A e B). O tamanho dos eléctrodos resulta em um campo eléctrico aplicado à ampla região do cérebro e, assim, uma grande área transfectadas.

É difícil direcionar com precisão uma área como, por exemplo, do mesencéfalo ventral. Reduzindo a distância entre os eléctrodos de 0,5 mm a conseguir um campo eléctrico mais pequeno é muitas vezes tóxicos para o embrião e conduz a produtos manufacturados. Foram utilizados eletrodos com diâmetros menores (0.2 mm, 0,25 milímetro de platina ou 0,1 milímetros de fio de tungstênio afiadas), que oferecem tra mais localizadansfection assim ventral do cérebro, o que é difícil de alcançar (Figuras 2C-I). Eléctrodos menores reduzir o campo eléctrico aplicado e permitem inserir os eléctrodos muito mais estreitas para o tecido. Figura 2F mostra um exemplo, em que a totalidade do mesencéfalo ventral foram transfectadas. Nas Figuras 2G e 2H as áreas ventrais transfectadas são menores, mas a parte do cérebro posterior (2F) ou diencéfalo (2H) também são transf. Na Figura 2G, o ânodo foi colocado sob a parte posterior do cérebro médio e para transfectar as duas zonas ventral. 2H Figura mostra um exemplo de um ânodo de não bem isolado com verniz ao longo do eixo. Assim, não só a região ventral em torno do MHB expressa miR / GFP, mas também o mes-e di-dorsal anterior do encéfalo, onde a haste do ânodo tinha sido colocado. A distribuição miR / GFP ventral específica nas Figuras 2C-I é um resultado do local,campo elétrico que aplicamos com os eletrodos menores. Tomados em conjunto, com eletrodos menores e campos elétricos que podem expressar DNA / RNA em áreas mais restritas, como mesencéfalo ventral.

Uma vez que a expressão de microRNA vector contém nenhum gene repórter, podemos misturar num vector de expressão de GFP em uma razão de 1 mg / mL a 0,9 mg / mL, respectivamente. A proporção quase igual garante que área transfectadas o microRNA e GFP quase completamente sobreposição (ver Momose et al. ⁸ e experiência própria). Para ser capaz de avaliar a extensão da área transfectadas torna-se importante quando apenas uma pequena área, contendo os tipos de células específicas são transfectadas ou as células transfectadas são utilizados para qRT-PCR. Uma concentração muito menor do gene repórter pode levar a células que expressam GFP sob o nível de detecção. A força de expressão de qualquer vector transfectado não depende apenas da concentração do vector utilizado, mas também sobre o promotor. Nossos vetores são U6-promotor driven (expressando miRNA) e promotor ß-actina impulsionado (expressando proteínas fluorescentes) e ambos são onipresente e constitutivamente ativo no embrião de galinha.

A maioria dos nossos embriões são electroporados na parte lateral esquerda, excepto para a Figura 2C (imagem de espelho). Para experiências de lapso de tempo, eletroporação do lado direito do embrião é recomendável, pois a maioria dos embriões virar a cabeça para a direita e mentira em seu lado esquerdo.

Figura 2. Os resultados representativos. Os embriões foram electroporados entre HH10 e HH11 e fixo nas fases indicadas nas fotos. (AC) mostra electroporations de mesencéfalo dorsal e (DI) de mesencéfalo ventral. As setas em (D, E) indicam ventrally localizados, células GFP positivas. Para mais detalhes veja o texto. Mes- Mesencéfalo / mesencéfalo, Di - diencéfalo, Tel - telencéfalo, Rhom - Rombencéfalo / hindbrain.

Discussion

Este vídeo demonstra um método eficaz para transfectar plasmídeo nas células neuroepiteliais de áreas específicas do cérebro médio do pintainho. Pulsos elétricos retangulares de baixa tensão pode introduzir DNA em células do tubo neural garota em ovo ^6,16. No entanto, a precisão da segmentação DNA é muitas vezes dificultada pela grande campo elétrico, que sobe através das relativamente grandes eletrodos (Φ = 0,5 mm). Nós tentamos resolver esse problema usando eletrodos menores em diâmetro seguindo as diretrizes do Momose et al. ^8. Para a transfecção do mesencéfalo ventral, colocamos o cátodo sob a membrana da zona pelúcida, ou, se a idade do embrião permite que directamente abaixo do mesencéfalo ventral. O último cenário precisa de um pouco de prática, pois o tecido tubo mesencéfalo / neural não deve ser tocado e danificado pelo ânodo. Adicionando campainha muitas vezes podem ajudar a levantar a cabeça do embrião um pouco fora da membrana que cobre a área pelúcida.

Apesar de considerar as concentrações do gene estão na célula. Doses de genes diferentes podem ter efeitos diferentes em células e tecidos. Pode haver um efeito limiar envolvida (ver Agoston et al. ^17, por exemplo), ou diferentes, efeitos graduais. Nós normalmente testar difeAluguel concentrações do miR expressando (0,5-2 mg / mL) de vetores e analisar as mudanças na morfologia ou proteína / gene-expressão. Os efeitos podem ser testadas in vivo utilizando imuno-histoquímica, o sensor ¹⁸ ou vectores de RNA de hibridação in situ.

Esta técnica também oferece a testar a força e a localização de uma actividade de miR específica in vivo utilizando, por exemplo, uma dupla fluorescência repórter / sensor de vector tal como descrito em De Pietri Tonelli et al. ^18. Eles usam um vector que contém um repórter GFP, e um sensor de miR RFP. A RFP é seguido por uma seqüência de miR cortesia. Embora a expressão da GFP identifica as células transfectadas com sucesso, a fluorescência vermelha (RFP) indica a ausência do miR investigada, e o desaparecimento da fluorescência vermelha revela a presença do miR. Esta técnica também pode ser usada para testar a especificidade do alvo miR in vivo, usando 3'UTR da sequência alvo a jusante de SDP.Tomados em conjunto esta técnica é altamente adequada para estudos de desenvolvimento sobre a expressão gênica e função em diferentes tecidos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Borosillicate glass capillaries	Hartenstein		Model: 0.9 mm
Microcapillary puller	WPI, Berlin		Model: Pul1-E
Electroporator	Intracel		Model: TSSIC
Stereomicroscope - fluorescence	LEICA		Model: MZFLIII
Stereomicroscope	Zeiss		Model: Stemi
Camera and software	Zeiss		Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8