Summary
Ektopische Expression ist eine Technik, um die microRNAs Rolle in der Entwicklung des Gehirns aufzuklären. , Für bestimmte Bereiche mit in ovo Elektroporation ist jedoch eine Herausforderung. Hier zeigen wir einen effizienten Weg, um selektiv elektroporieren ventrale und dorsale Mittelhirn Regionen.
Abstract
Nicht-kodierende RNAs sind weitere Spieler in der Regulation der Genexpression. In ovo Elektroporation von bestimmten Bereichen Gezielte bietet ein einzigartiges Werkzeug für die räumliche und zeitliche Kontrolle der Eileiter microRNA Expression. Allerdings sind ventralen Hirnstrukturen wie ventralen Mittelhirn ziemlich schwierig, für alle Manipulationen zu erreichen. Hier zeigen wir, eine effiziente Möglichkeit zum ventralen Mittelhirn miRNA in elektroporieren mit dünnen Platinelektroden. Dieses Verfahren bietet einen zuverlässigen Weg, um bestimmte Bereiche des Mittelhirns und nützliches Werkzeug für In-vivo-Studien zu transfizieren.
Introduction
Die Anerkennung der kleine nicht-kodierende RNAs als zusätzliche Spieler für die Genexpression eine neue Komplexität, um genomische Programmierung / Genregulation. Verschiedene Arten von nicht-kodierenden RNAs funktionelle Bedeutung in neuronalen Zellen, einschließlich der kleinen nicht-kodierenden RNAs 1-4. MicroRNAs (miR-oder miRNA) zeigen beispielsweise verschiedene und wechselnde Expressionsprofile in die Entwicklung des Gehirns 5. In ovo Elektroporation von Hühnerembryonen Gezielte bietet eine einzigartige Gelegenheit für zeitliche und räumliche Steuerung der Genexpression und der Silencing während der Entwicklung.
Dieses Video zeigt die verschiedenen Schritte der Durchführung ektopische Expression von miRs in bestimmten Bereichen des Mittelhirns mit Küken in ovo Elektroporation 10.06. Um eine dauerhafte Wirkung dieser kleinen nicht-kodierenden RNAs in den Zellen zu gewährleisten, wurden die DNA-Sequenz miRs in mono-oder bi-cistronischen Vektoren kloniert. Für die in-ovo Elektroporation, miR enthält vector in das Mittelhirn Neuralrohr, indem die Embryos nach einem kleinen Fenster in der Eierschale injiziert. Bestimmte Bereiche des Mittelhirns kleine Plus (Anode) und minus (Kathode) zu transfizieren Platinelektroden werden an bestimmten Positionen angeordnet. Zur ventralen Mittelhirn Transfektion wird die Anode unter dem ventralen Mittelhirn linken und der Kathode über der rechten Hälfte des Mittelhirns vor dem Anlegen eines Stroms angeordnet. Die Öffnung in der Eierschale ist mit Klebeband geschlossen und Embryonen werden, solange für jede Analyse erforderlich inkubiert. Dieses Verfahren wurde ursprünglich von Muramatsu et al. 6 beschrieben und Momose et al. 8 zum spezifischen Bereich der Transfektion verbessert.
Schematische Übersicht.
- Der Embryo im Ei wird durch Schneiden ein kleines Fenster in th ausgesetzte Eierschale.
- Das gelöste Vektor (en) in das Mittelhirn unter Verwendung einer Mikrokapillare injiziert.
- Zwei Elektroden - parallel oder unter und über dem Embryo gelegt - erzeugen einen gepulsten elektrischen Feld.
- Das elektrische Feld zeitlich erzeugt Poren in der Zellmembran, die den Eintritt in die Zelle durch die negativ geladene DNA (oder RNA) zu erleichtern zogen Anode 11,12.
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Protocol
1. Voraussetzungen für die In-ovo Elektroporation
- Vorbereiten des Vektorkonstrukt: miR Sense und Antisense-Primer wurden nach den Anweisungen des Ambion entworfen, geglüht und in ligiert ApaI / EcoRI verdaut pSilencer U6.1 Vektor. Nach einer erfolgreichen Transformation der erhaltenen Klone wurde angebaut und pSilencer Plasmid wurde durch alkalische Lyse isoliert mit einem Quiagen Midi Vorbereitung Kit.
- Elektroden: Die Elektroden können gekauft werden oder einfach gebaut 13 werden. Wir verwenden selbstgemachte Elektroden aus Platindraht (Φ = 0,2, 0,25 oder 0,5 mm Durchmesser) oder in einigen Fällen eine noch kleinere Wolframdrahtelektrode (Φ = 0,1 mm) 8 je nachdem, welchen Bereich wir elektroporieren möchten. Ein Versengen des Gewebes zu vermeiden, in der Regel verwendet man je näher an das Gewebe je dünner die Elektroden. Für breite Elektroporation von Mittelhirn, verwenden wir 0,5 mm Platindrähte mit einem Messing / Edelstahl-Rohr gelötetWelle und einen Elektrodenhalter mit einem Abstand von 3-5 mm (Fig. 1) befestigt. Bestimmte Bereiche Elektroporation, verwenden wir 0,25 mm Platindraht Anoden und 0,2 mm Platindraht oder 0,1 mm Wolfram für die Kathode mit einem ungefähren Abstand von 1 mm oder weniger.
- Lösungen: Sind die folgenden Lösungen bereit:
- Autoklavierte Huhn Ringer, pH 7,5 (9,0 g NaCl, 0,42 g KCl, 0,24 g CaCl2, lösen sich in 1 L destilliertem Wasser).
- PBS (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 0,24 g KH 2 PO 4, 1,44 g Na 2 HPO 4, lösen sich in 1 Liter destilliertem H 2 O).
- Fast Green: Stammlösung 10 mg / ml destilliertem H 2 O
- Langsam trocknende Tinte (weniger Schellack und damit weniger Vergiftung für den Embryo). Hinweis: Eine blaue dichroitische Filter auf ein Glasfaserlampe befestigt, wie in Canto-Soler und Adler 14 beschrieben wird der Kontrast und die Notwendigkeit beseitigen, um Tinte zu injizieren.
Fig. 1 ist. Schematische Darstellung der Elektroden und Elektrodenhalter. (A, B, C) Platindraht wurde auf eine Seite eines Edelstahlrohrwelle verlötet. Ein Loch wurde in die andere Seite der Rohrwelle gebohrt so dass Pin Stecker können fit in. (A) Rot und Blau farbigen Drähte wurden an die Pin-Stecker verbunden. Am anderen Ende wurde der Draht zu Bananenstecker, die mit den Steckdosen der Elektroporator arbeiten ausgestattet. (A, C) Der Platindraht wurde in einen Engel von 90 ° gebogen. Eine Schicht Nagellack isoliert die Welle über der Kurve.
2. Vorbereitungen unmittelbar vor In-ovo Elektroporation
- Bereiten Sie das folgende Material:
- Verdünnte Tinte mit Huhn Ringer 01.06, fügen Antibiotika-Antimykotika-Lösung (100x von GIBCo) 1:100.
- Bereiten Vektorlösung: 1-2 ug / ul pro spezifische DNA in H 2 O mit Fast Green (1:20) ergänzt.
- Sterilisieren Zangen, Scheren, Nadelwolframelektroden und mit 70% Ethanol.
- Ziehen Mikropipetten für die Nukleinsäure-Injektion aus Borosilikatglas Kapillaren (Länge zu Außendurchmesser: 100 mm x 0,9 mm). Wir verwenden eine einfache Abzieher PUL-1 (WPI, Berlin) mit den in Tabelle 1 gezeigten Einstellungen.
- Die Parameter des Elektroporators wie in Tabelle 2 gezeigt.
| Parameter | Werte |
| Wärme | 350 |
| Ziehen | 100 |
| Geschwindigkeit 50 | |
| Verzögerung | 200 |
Tabelle 1. Einstellungen für die PUL-1
| Parameter | Werte |
| Frequenz | 50 Hz |
| Verzögerung | 20-50 ms * |
| Breite | 20 msec |
| Spannung | 8-25 V * |
| Puls | 3-5 mal |
| * Je nach Elektrodendurchmesser und Entfernung. Bittemit berücksichtigen bei der Änderung einer der Parameter. | |
Tabelle 2. Einstellungen für den Impuls Stimulator
- Bereiten Hühnerembryonen für die Elektroporation:
- Befruchteten Hühnereiern auf ihre längere Seite Inkubation bei 37 ° C mit 65% Luftfeuchtigkeit für 39 Stunden, Embryonen zwischen Hamburger & Hamilton (HH) erwerben Stufen 15 9-11. Der Embryo setzt sich am obersten Teil des Eies, so sollten Sie es mit einem Bleistiftstrich markieren.
- Desinfizieren Sie die Eier mit 70% Ethanol.
- Durchbohren das Ei an der breiteren Seite, wo die Luft Hohlraum sein sollte.
- Entfernen Sie 1-2 ml Eiweiß. Dadurch wird der Embryo aus der Eierschale lösen.
- Cello-Band der Eierschale zu Granatsplitter fallen auf den Embryo zu vermeiden. Verwenden Sie eine Schere, um ein kleines Fenster in der Eierschale auf der Bleistiftlinie geschnitten.
- Spritzen Sie ein bisschen Tinteunter dem Bereich opaca, um den Embryo zu visualisieren.
- Machen Sie einen Schnitt in die Dotterhaut mit einem geschärften Wolfram-Nadel, um eine bessere Zugänglichkeit des Embryos für die Nukleinsäure-Injektion und Elektroporation zu erreichen.
3. Elektroporation und Inkubation
- Fügen Sie ein paar Tropfen warmen Ringer-Lösung auf die Embryonen. Dadurch werden die Embryonen zu senken, eine Überhitzung zu vermeiden, Verkleben der Elektroden an das Gewebe und ein Medium für den Strom zwischen den beiden Elektroden.
- Spritzen Sie die Vektorlösung in das Lumen des Neuralrohrs in Mittelhirn-Ebene. Wenn Ihr DNA-Expressionsvektor keine Reporter-Gen (zB EGFP) enthält, fügen Sie ein etwas niedriger konzentrierten Reportergenvektor (1 ug / ul miR-Expressionsvektor zu 0,9 ug / ul Reportergenvektor) zu der DNA-Lösung. Dadurch wird sichergestellt, dass Sie transfizierten Zellen später 8 zu erkennen. Wir nutzen die so genannte pCAX Vektor, eine Art Geschenk herm C 13 Krull.
- Für ein breites Transfektion des Mittelhirns, legen Sie die links Elektroden und des Embryos auf der Höhe des Mittelhirns. Der Abstand zwischen den Elektroden sollte etwa 3-5 mm betragen. Die anderen Einstellungen sind 15V, 20 ms und 50 ms Impulse Verzögerung für HH 10. Ändern der Position der beiden Elektroden leicht entlang der dorso-ventralen (DV) Achse des Mittelhirns sichert eine eine breite Transfektion von Zellen der DV Achse Transfektion.
- Für ventralen Transfektion, fügen Sie einige Ringer, um den Kopf aus der Dottermembran zu erhöhen und legen Sie die Anode unter ventralen Mittelhirn. Wenn der Kopf nicht steigen drücken Sie die Elektrode unter der Membran, die Dotter und Embryo trennt, um der sengenden Neuralrohr zu vermeiden. Die Kathode sollte über dem Mittelhirn dorso-lateral gegenüber der Anode angeordnet werden. Berühren Sie nicht das Neuralrohr. Wir Transfektion der linken ventralen Hälfte des Mittelhirns, Schwierigkeiten mit der Herzentwicklung zu vermeiden. Der Abstand zwischen den Elektrodenetwa 1-0,5 mm, der Rest der Einstellungen 10 V, 20 msec und 50 msec Breite Verzögerung.
- Bewerben einen Tropfen Kochsalzlösung auf der Embryonen, um es abzukühlen und entfernen Luftblasen.
- Verschließen Sie die Eier mit dem Band und Inkubation für mindestens 4 Stunden, die Mindestzeit für Vektorausdruck erforderlich.
4. Fixierung von Hühnerembryonen
- Entfernen Sie die Embryonen aus ihren Eiern.
- Saubere Embryonen unter einem Stereomikroskop und inwieweit der Transfektion mit einem Fluoreszenzstereomikroskop.
- Fix die Embryonen über Nacht in 4% PFA bei 4 ° C Weiter mit Schneiden und / oder Färbung (in-situ-Hybridisierung, Immunhistochemie), um Änderungen in der transfizierten Bereich zu analysieren.
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Representative Results
Der Umfang des Mittelhirns Bereich mit miR transfiziert ist durch die Expression von GFP aus einem Reportervektor zusammen mit der miR-Expressionsvektor (Abbildung 2) eingespritzt wird sichtbar. Verwendung von Platinelektroden mit einem Durchmesser von 0,5 mm und parallel zur Transfektion eines breiten Bereich entlang der DV-und AP-Achse, einschließlich Hinterhirn, Mittelhirn und Zwischenhirn manchmal (2A und B) angeordnet, um die AP-Achse des Mittelhirns führt normalerweise. Die Größe der Elektroden führt zu einer großen elektrischen Felds an das Gehirnregion und damit einen weiten Bereich angewendet transfiziert.
Es ist schwierig, eine Fläche, wie zum Beispiel dem ventralen Mittelhirn genau zielen. Verringern des Abstands zwischen den Elektroden 0,5 mm, eine kleinere elektrische Feld zu erreichen, ist oft toxisch für den Embryo und führt zu Artefakten. Wir verwendeten Elektroden mit kleineren Durchmessern (0,2 mm, 0,25 mm oder 0,1 mm Platin geschärft Wolframdraht), die mehr lokalisierte tra anbietennsfection wie die der ventralen Gehirn, die schwierig (2C-I) zu erreichen ist. Kleinere Elektroden zu verringern, das elektrische Feld angelegt und ermöglichen es, die Elektroden näher am Gewebeeinsatz. Fig. 2F zeigt ein Beispiel, wo die gesamte ventrale Mittelhirn transfiziert worden war. In Zahlen 2G und 2H die transfizierten ventralen Bereiche sind kleiner, aber ein Teil des Hinterhirn (2F) oder Zwischenhirn (2H) sind ebenfalls transfiziert. In Fig. 2G wurde die Anode in der Mitte des Hinterhirn und angeordnet, um sowohl ventral Bereichen transfizieren. Fig. 2H zeigt ein Beispiel einer Anoden nicht gut mit Lack entlang der Welle isoliert. Somit kann nicht nur die ventralen Bereich um die MHB drückt miR / GFP als auch die Rücken vorderen MES-und Di-Hirn, wo die Welle der Anode platziert worden war. Die spezifische ventralen miR / GFP Verteilung in den 2C-I ist ein Ergebnis aus dem lokalenelektrisches Feld wir mit den kleineren Elektroden. Zusammengenommen mit kleineren Elektroden und elektrische Felder können wir DNA / RNA in mehr eingeschränkten Bereichen wie ventralen Mittelhirn auszudrücken.
Da unsere microRNA-Expressionsvektor keine Reporter-Gen enthält, mischen wir in einem GFP-exprimierenden Vektor in einem Verhältnis von 1 ug / ul 0,9 ug / ul auf. Die nahezu gleichen Verhältnis sorgt dafür, dass die microRNA und GFP transfiziert Bereich fast vollständig überlappen (siehe Momose et al. 8 und eigene Erfahrung). Um das Ausmaß der transfizierten Bereich beurteilen wird wichtig, wenn nur eine kleine Fläche spezifischen Zelltypen enthält, transfiziert oder die transfizierten Zellen für qRT-PCR verwendet. Ein viel weniger Konzentration des Reportergens kann, um Zellen, die GFP unter die Nachweisgrenze zu führen. Die Stärke der Expression eines beliebigen transfizierten Vektors hängt nicht nur von der Konzentration des verwendeten Vektors, sondern auch auf den Promotor. Unsere Vektoren sind U6-Promotor-Fahren (ausdrücken miRNA) und ß-Actin-Promotor angetrieben (fluoreszierende Proteine exprimieren) und sind beide ubiquitär und in der Hühnerembryo konstitutiv aktiv.
Die meisten unserer Embryonen werden auf der linken Seite außer 2C (Spiegelbild) elektroporiert. Für Zeitraffer-Experimenten wird die Elektroporation von der rechten Seite des Embryos zu empfehlen, da die meisten Embryonen drehen den Kopf nach rechts und liegen auf ihrer linken Seite.
2. Repräsentative Ergebnisse. Die Embryonen wurden zwischen HH10 und HH11 Elektroporation und an den in den Bildern angegeben Stufen festgelegt. (AC) zeigen Elektroporationen der dorsalen Mittelhirn, und (DI) des ventralen Mittelhirn. Die Pfeile in (D, E) zeigen ventral, GFP-positiven Zellen. Für weitere Einzelheiten siehe Text. Mes- Hirn / Mittelhirn, Di - Zwischenhirn, Tel. - Telen, Rohm - Rautenhirn / Hinterhirn.
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Discussion
Dieses Video zeigt eine effektive Methode, um das Plasmid in die Neuroepithelzellen von bestimmten Bereichen des Mittelhirns Küken transfizieren. Rechteckige elektrische Impulse von Niederspannungs können DNA in Zellen der Küken Neuralrohr in ovo 6,16 einzuführen. Jedoch ist die Genauigkeit der DNA-Targeting oft durch die breiten elektrischen Feldes, das durch den relativ großen Elektroden (Φ = 0,5 mm) steigt behindert. Wir haben versucht, dieses Problem durch Verwendung von Elektroden im Durchmesser kleiner ist nach den Richtlinien der Momose et al. 8 anzugehen. Zur ventralen Mittelhirn Transfektion legen wir die Kathode unter der Membran des Bereichs pellucida oder wenn das Alter des Embryos ermöglicht es direkt unter dem ventralen Mittelhirn. Das letzte Szenario braucht ein bisschen Übung, da Mittelhirn / Neuralrohr Gewebe sollten nicht berührt und von der Anode beschädigt werden. Hinzufügen Ringer kann oft helfen, um den Kopf des Embryos leicht von der Membran, die das Gebiet pellucida zu heben.
Obwohl nach Are Gen-Konzentrationen in der Zelle zu betrachten. Verschiedene Gen-Dosen könnte unterschiedliche Wirkungen auf Zellen und Gewebe. Es könnte ein Schwelleneffekt beteiligt (siehe Agoston et al. 17, zum Beispiel) oder verschiedene, abgestufte Effekte. Wir testen in der Regel verschieMiete Konzentrationen des miR exprimieren (0,5-2 ug / ul)-Vektor und Veränderungen in der Morphologie oder Protein / Gen-Expression zu analysieren. Effekte können in vivo unter Verwendung von Immunhistochemie prüfenden Sensorvektoren 18 oder RNA in situ Hybridisierung.
Diese Technik bietet auch, um Kraft und Position jeder Aktivität eines bestimmten miR in vivo unter Verwendung beispielsweise eine duale Fluoreszenz-Reporter / Sensor-Vektor, wie in 18 De Pietri Tonelli et al. Beschrieben testen. Sie verwenden einen Vektor, der eine GFP-Reporter und ein RFP miR Sensor enthält. Das RFP ist durch eine kostenlose miR-Sequenz folgt. Während die GFP-Expression erfolgreich transfizierten Zellen identifiziert, rote Fluoreszenz (RFP) die Abwesenheit des miR sucht, und das Verschwinden der roten Fluoreszenz verrät die Anwesenheit der miR. Diese Technik kann auch verwendet werden, um die Spezifität der Ziel miR in vivo zu testen, unter Verwendung von 3'-UTR der Zielsequenz stromabwärts des RFP.Zusammengenommen ist diese Technik für Entwicklungsstudien auf die Genexpression und-Funktion in den verschiedenen Geweben sehr geeignet.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir erkennen K. Mikic, der auf die Anfangsphase des Films und M. Nicolescu für die miR-Bild beigetragen. C. Huber wurde von einer Gemeinschaft des IZKF der Universtitätsklinikum Tübingen, A. Alwin Prem Anand von der Fortune-Programm der Universtitätsklinikum Tübingen unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Borosillicate glass capillaries | Hartenstein | Model: 0.9 mm | |
| Microcapillary puller | WPI, Berlin | Model: Pul1-E | |
| Electroporator | Intracel | Model: TSSIC | |
| Stereomicroscope - fluorescence | LEICA | Model: MZFLIII | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Model: Stemi | |
| Camera and software | Zeiss | Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8 |
References
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