Summary
이소성 표현은 두뇌 발달의 마이크로 RNA의 역할을 명료하게 한 기술이다. 그러나, 비켜 일렉트로에 사용하여 특정 영역을 대상으로하는 것은 도전이다. 여기, 우리는 효율적으로 선택적으로 electroporate 복부와 등쪽 중뇌 영역에 표시됩니다.
Abstract
비 코딩 RNA를 유전자 발현을 조절하는데 추가 플레이어. 특정 지역의 OVO 일렉트로의 대상은 자궁외 마이크로 RNA 발현의 공간 및 시간 제어를위한 독특한 도구를 제공합니다. 그러나, 복부 중뇌와 같은 복부 뇌 구조는 모든 조작에 도달 오히려 어렵습니다. 여기, 우리는 얇은 백금 전극을 사용하여 복부 중뇌에 miRNA의를 electroporate하는 효율적인 방법을 보여줍니다. 이 방법은 중뇌 및 생체 연구를위한 유용한 도구의 특정 영역을 감염 될 수있는 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다.
Introduction
유전자 발현에 대한 추가 플레이어와 같은 작은 비 코딩 RNA를 인식 게놈 프로그래밍 / 유전자 조절에 새로운 복잡성을 시작했다. 비 코딩 RNA를 다른 종은 작은 비 코딩 RNA를 1-4 포함하는 신경 세포의 기능적인 중요성이있다. 예를 들어, 마이크로 RNA (miRNA의 미르 나)는 두뇌 개발 5 별개의 변화 발현 프로파일을 보여줍니다. 개발하는 동안 유전자 발현과 침묵의 시간 및 공간 제어를위한 유일한 기회는 병아리 태아의 비켜 일렉트로에 제공 대상.
이 동영상은 일렉트로 6-10 OVO에서 사용하는 병아리 중뇌의 특정 영역에 미르의 이소성 표현을 수행하는 여러 단계를 보여줍니다. 세포에있는이 작은 비 코딩 RNA를의 긴 지속 효과를 보장하기 위해, 미르의 DNA 시퀀스는 모노 - 또는 바이 cistronic 벡터에 클로닝 하였다. 비켜 일렉트로의 경우, 미르는 V를 포함엑터는 달걀 껍질에 작은 창을 한 후 배아를 노출하여 중뇌의 신경 튜브에 주입된다. 중뇌 작은 플러스 (양극)과 음극 (캐소드)의 특정 영역을 형질 백금 전극을 특정 위치에 배치됩니다. 복측 중뇌 형질 들어, 애노드는 좌 복부 중뇌 및 전류를인가하기 전에 중뇌의 우측 절반 상기 캐소드 밑에 배치된다. 달걀 껍질에 구멍을 테이프로 닫히고 배아는 한 어떤 분석을 위해 필요에 따라 배양된다. 이 방법은 원래 무라 마츠 등. (6)에 의해 설명 된 특정 지역의 형질 전환을위한 모모 세 등. 8로 향상되었다.
도식 개요.
- 계란의 배아는 일에 작은 창을 절단하여 노출전자 껍질.
- 용해 벡터 (들)는 마이크로 모세관을 사용하여 중뇌 주입된다.
- 두 개의 전극 - 병렬 또는 배아에서와 위에 배치는 - 펄스 전기장을 생성합니다.
- 전기장은 일시적으로 양극 (11, 12)에 매력을 부정 청구 DNA (또는 RNA)에 의해 세포에 진입을 용이하게 세포막에 구멍을 만듭니다.
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Protocol
1. 에서 비켜 Electroporation에 대한 요구 사항
- 벡터 구조를 준비 : 미르의 센스와 안티센스 프라이머, Ambion의 지시 후 설계 소둔 및 ApaI로 결찰 / 효소 EcoRI는이 실험에서 pSilencer ™의 U6.1 벡터를 소화. 성공적으로 변환 후 생성 된 클론 중 하나가 성장하고,이 실험에서 pSilencer ™ 플라스미드 Quiagen 미디 준비 키트를 사용하여 알칼리 용해 방법으로 분리 하였다.
- 전극 : 전극을 구입하실 수 있습니다 또는 쉽게 13를 만들 수. 우리는 백금 와이어의 자체 제작 전극 (Φ = 직경 0.2, 0.25, 0.5 mm)를 사용하거나 경우에 따라 더 작은 텅스텐 와이어 전극 (Φ = 0.1 mm) 8 우리가 electroporate하려는 지역에 따라 다릅니다. 조직의 뜨거운을 방지하기 위해, 우리는 조직 전극 얇은에 가까운 값으로 사용하십시오. 중뇌의 넓은 일렉트로 위해, 우리는 황동 / 스테인레스 스틸 관에 납땜 0.5 mm 백금 와이어를 사용샤프트 3-5 ㎜의 거리 (도 1)와 전극 홀더에 고정된다. 특정 영역을 electroporate하기 위해, 우리는 0.25 mm 백금 와이어 양극 및 0.2 mm 백금 와이어 또는 1 mm 이하의 대략적인 거리와 음극 0.1 mm의 텅스텐을 사용합니다.
- 솔루션 : 다음과 같은 솔루션을 준비합니다 :
- 멸균 치킨 벨소리, pH가 7.5 (9.0 g 염화나트륨, 0.42 g의 KCl, 0.24 g의 염화칼슘, 1 L의 증류수에 용해).
- PBS (8g의 NaCl, 0.2 g의 KCl, 0.24 g의 KH 2 PO 4, 1.44 g의 2 나 HPO 4, 1리터 증류수 H 2 O에 용해).
- 빠른 그린 : 원액 10 ㎎ / ㎖ 증류수 H 2 O
- 천천히 건조 잉크 (이하 셸락 및 배아에 대한, 따라서 적은 중독). 주 : 칸토-더 유일한 및 애들러 (14)의 설명에 따라 광섬유 램프에 연결된 청색 이색 성 필터는 콘트라스트를 향상시키고, 잉크를 주입 할 필요성을 제거 할 수있다.
그림 1. 전극과 전극 홀더의 개략도. (A, B, C) 백금 와이어는 스테인레스 스틸 관형 샤프트의 일측에 납땜 하였다. 구멍 따라서 그 핀 플러그 (A) 빨강과 파랑 색의 전선이 핀 플러그에 연결된 안으로 들어갈 수있는 관 샤프트의 다른 측면 드릴되었다. 반대쪽 끝에서 와이어가 electroporator의 전기 소켓 작업 바나나 커넥터에 장착되었다. (A, C) 백금 와이어는 90 °의 천사 굽혀했다. 손톱 광택의 층은 굴곡 위의 샤프트입니다.
2. 직접에서 비켜 Electroporation에 전 준비
- 다음과 같은 자료를 준비
- 닭 벨소리 1시 6분와 잉크를 희석, Gibc에서 항생제 항진균 솔루션 (100 배를 추가) 1:100 오.
- 벡터 솔루션을 준비 : H 2 O의 특정 DNA 1 ~ 2 ㎍ / ㎕의 빠른 그린 (1:20)을 수행 보충.
- 70 % 에탄올로 집게, 가위, 텅스텐 바늘 전극을 소독.
- 붕규산 유리 모세관 (: 100mm X 0.9 mm 외경 길이)에서 핵산 주입 마이크로 피펫을 잡아 당깁니다. 우리는 표 1에 나타낸 설정을 간단한 풀러 PUL-1 (WPI, 베를린)를 사용한다.
- 표 2에 나타낸 바와 같이 electroporator의 매개 변수를 설정.
| 매개 변수 | 값 |
| 열 | (350) |
| 당기세요 | (100) |
| 속도 (50) | |
| 지연 | (200) |
표 1. PUL-1에 대한 설정
| 매개 변수 | 값 |
| 주파수 | 50 Hz에서 |
| 지연 | 20-50 밀리 초 * |
| 폭 | 20 밀리 초 |
| 전압 | 8-25 V의 * |
| 펄스 | 3 - 5 회 |
| * 전극의 직경과의 거리에 따라. 하십시오매개 변수 중 하나를 변경할 때 고려한다 그것을. | |
표 2. 펄스 자극에 대한 설정
- 일렉트로에 대해 병아리 배아를 준비
- 햄버거 & 해밀턴 (HH) 사이의 배아를 얻기 위해 39 시간 동안 65 %의 습도와 37 ° C에서 자신의 긴 측면에 수정 된 닭고기 달걀을 품어 15 ~ 11 스테이지. 배아는 난자의 최상위 부분에 정착, 그래서 당신은 연필 선으로 표시해야합니다.
- 70 % 에탄올로 계란을 소독.
- 공기 구멍이 있어야 할 곳에, 더 넓은 측면에서 계란을 관통.
- 흰자 1 ~ 2 ML를 제거합니다. 이 달걀 껍질에서 배아를 분리합니다.
- 첼로 테이프 배아에 떨어지는 포탄의 파편을 피하기 위해 달걀 껍질. 연필 선 주위에 달걀 껍질에 작은 창을 잘라 가위를 사용합니다.
- 잉크의 비트를 주입배아를 시각화하는 지역 opaca 아래.
- 핵산 주입 및 전기 충격에 대한 배아의 더 나은 접근성을 달성하기 위해 날카롭게 텅스텐 바늘로 난황 막에 상처를 확인합니다.
3. 일렉트로 및 창업 보육
- 배아에 따뜻한 링거 용액 몇 방울을 추가합니다. 이것은, 배아를 낮출 과열을 방지, 조직에 전극과 나와 두 전극 사이의 전류를위한 매체를 제공하는 것이다.
- 중뇌 수준에서 신경 튜브의 루멘에 벡터 솔루션을 주입한다. 당신의 DNA 발현 벡터가 더 리포터 유전자 (예 : EGFP)를 포함하지 않으면 DNA 용액에 약간 낮은 농축 리포터 유전자 벡터 (1 ㎍ / μL 미르 0.9 ㎍ / ㎕의 리포터 유전자 벡터와 벡터를 표현)를 추가한다. 이것은 당신이 형질 세포 나중에 8을 인식 할 수 있도록합니다. 우리는 이리저리 소위 pCAX 벡터, 친절한 선물을 사용M C. 크럴 13.
- 중뇌의 다양한 형질의 경우, 중뇌의 높이에서 왼쪽 전극과 태아의 권리를 놓습니다. 전극 간 거리는 3 ~ 5 ㎜로한다. 다른 설정은 15V, 20 밀리 초 펄스와 HH 10 50 밀리 초 지연이다. 약간의 중뇌 dorso-배쪽 (DV) 축을 따라 두 전극의 위치를 변경하는 것은 셀의보다 넓은 형질 DV 축 형질을 보장한다.
- 복부 형질의 경우, 노른자 막에서 머리를 올리고 복부 중뇌 아래의 양극을 배치하는 몇 가지 벨소리를 추가합니다. 머리는 신경 튜브의 뜨거운을 피하기 위해 노른자와 배아를 분리하는 막 아래에 전극을 밀어 상승하지 않습니다. 음극은 중뇌 dorso-측면으로 반대 양극 위에 배치해야합니다. 신경 튜브를 만지지 마십시오. 우리는 심장 개발에 어려움을 피하기 위해 중뇌 왼편 복부 절반 형질. 전극 사이의 거리는약 1-0.5 mm, 나머지 설정하는 10V, 20 밀리 폭 50 밀리 초 지연입니다.
- 그것을 아래로 냉각 공기 방울을 제거하는 배아의 위에 생리 식염수의 또 다른 드롭을 적용합니다.
- 테이프로 계란을 밀봉하고 적어도 4 시간 동안 배양, 벡터 표현에 필요한 최소한의 시간.
4. 닭 배아의 고정
- 알에서 배아를 제거합니다.
- 실체 현미경 및 형광 실체 현미경으로 형질 감염의 정도를 평가 면도 배아.
- 4 ℃에서 4 % PFA 밤을 통해 배아를 수정 형질 지역의 변화를 분석하기 위해 (현장 하이브리드, 면역 조직 화학 염색에) 구획 및 / 또는 염색을 진행합니다.
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Representative Results
미르로 형질 중뇌 영역의 범위는 미르 발현 벡터 (그림 2)와 함께 주입 기자 벡터에서 GFP의 표현을 통해 볼 수 있습니다. 0.5 mm의 직경을 갖는 백금 전극을 사용하고 중뇌 후뇌, 때때로 간뇌 (도 2A와 B)를 포함하여 DV-및 AP-축을 따라 넓은 영역의 형질 전환에 일반적 중뇌 리드 AP 축에 평행하게 배치. 넓은 전계의 전극 결과의 크기는 뇌 영역 따라서 형질 넓은 영역에 적용.
정확하게, 예를 들어 복부 중뇌와 같은 영역을 대상으로하는 것이 곤란하다. 작은 전기장을 달성하기 위해 0.5 mm의 전극 간 거리를 감소시키는 것은 종종 배아 독성이며 인공물에 이르게한다. 우리는 더 많은 지역화 육 차원 속의를 제공하는 작은 직경 (0.2 ㎜, 0.25 ㎜의 백금 또는 0.1 mm 날카롭게 텅스텐 와이어)로 전극을 사용(그림 2C-I)에 도달하기 어려운 복부 뇌의 같은 nsfection. 더 작은 전극은인가 전계를 감소시키고 조직에 더 가까이 전극을 삽입 할 수 있도록.도 2F는 전체 복부 중뇌가 형질되었던 예를 도시한다. 그림 2G 및 하반기 형질 복부 영역은 작지만 후뇌 (2 층) 또는 간뇌 (2H)의 일부는 형질 전환됩니다. 그림 2G에서, 양극이 복부 영역을 모두 형질 중반와 후뇌 아래에 배치했다. 그림 2H 잘 샤프트를 따라 손톱 광택과 격리되지 양극의 예를 보여줍니다. 따라서, MHB 주위의 복부 지역뿐만 미르 / GFP를 표현뿐만 아니라 지느러미 앞쪽에 MES 및 디 - encephalon, 양극의 축이 놓여 있었던 곳. 그림 2C-I의 특정 복부 미르 / GFP 분포는 지역에서의 결과입니다전기장 우리는 작은 전극으로 적용됩니다. 우리는 복부 중뇌 같은 더 많은 제한 구역에서 DNA / RNA를 표현할 수있는 작은 전극과 전기 분야와 함께 촬영.
우리의 마이크로 RNA 발현 벡터가 더 리포터 유전자를 포함하지 않기 때문에, 우리는 각각 0.9 ㎍ / μL, 1 ㎍ / μL의 비율로 벡터를 표현하는 GFP에 섞는다. 거의 같은 비율은 마이크로 RNA와 GFP 형질 전환 된 면적이 거의 완벽하게 오버랩 (모모 세 등. 8과 자신의 경험을 참조) 것을 보장한다. 특정 세포 유형을 포함하는 단지 작은 영역이 형질 전환되거나 형질 세포가 QRT-PCR에 사용하는 경우 형질 지역의 범위를 판단 할 수 있도록하는 것은 중요합니다. 리포터 유전자의 훨씬 적은 농도는 검출 레벨하에 GFP를 발현하는 세포로 이어질 수있다. 어떤 형질 전환 벡터의 표현의 강도는 사용 된 벡터의 농도뿐만 아니라 발기인에 따라서도 달라집니다. 우리의 벡터 U6-프로모터 DRIV 있습니다EN (miRNA의 표현) 및 SS-액틴 프로모터 (형광 단백질을 발현) 구동 모두 재하와 구조적으로 활성화 된 병아리 배아에 있습니다.
우리 배아의 대부분은도 2C (거울상)을 제외한 좌측에 일렉트로된다. 대부분의 태아가 자신의 왼쪽에 오른쪽과 거짓말을 향해 고개를 돌려 때문에 시간 경과 실험, 배아의 오른쪽의 일렉트로 권장합니다.
그림 2. 대표 결과. 배아는 HH10와 HH11 사이 일렉트로와 그림에 표시된 단계에서 수정되었습니다. 복부 중뇌의 (AC) 쇼 등쪽 중뇌의 electroporations 및 (DI). (D, E)의 화살표는 배쪽으로 위치, GFP 양성 세포를 나타냅니다. 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오. 메스- 중뇌 / 중뇌, 디 - 간뇌, 전화 - telencephalon, Rhom - rhombencephalon / 후뇌.
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Discussion
이 비디오는 병아리 중뇌의 특정 영역의 neuroepithelial 세포에 플라스미드를 형질 할 수있는 효과적인 방법을 보여줍니다. 낮은 전압의 직사각형 전기 펄스는 6,16을 OVO에 병아리 신경 튜브의 세포에 DNA를 도입 할 수 있습니다. 그러나, DNA의 타겟팅 정확성은 종종 비교적 큰 전극 (Φ = 0.5 mm)을 통해 상승 넓은 전기장에 의해 방해된다. 우리는 모모 세 등. 8의 지침에 따라 직경이 작은 전극을 사용하여이 문제를 해결하기 위해 노력했다. 배아의 나이는 직접 복부 중뇌 아래 허용하는 경우 복부 중뇌 형질 전환을 위해, 우리는 지역 pellucida 또는 막에서 음극을 배치합니다. 신경 / 중뇌 관 조직이 양극 감동을 손상하지 말아야하기 때문에 마지막 시나리오는 약간의 연습이 필요합니다. 벨소리를 추가하는 것은 종종 약간 지역 pellucida를 덮고있는 막 떨어져 태아의 머리를 들어 올리는 데 도움이 될 수 있습니다.
세포에있는 유전자의 농도를 고려하더라도. 다른 유전자 복용은 세포와 조직에 서로 다른 영향을 미칠 수 있습니다. 이 (예를 들어, 아고 스톤 외. 17 참조)과 관련된 역치 효과이거나 상이 그레이딩 효과 있었다. 우리는 일반적으로 diffe 테스트미르의 임대 농도 (0.5 ㎍ / μL) 벡터를 표현하고 형태 또는 단백질 / 유전자 발현의 변화를 분석 할 수 있습니다. 효과는 면역 조직 화학 염색을 이용하여 생체 내에서 테스트 할 수 있으며, 센서는 현장 하이브리드의 18 또는 RNA를 벡터.
이 기술은 또한 드 Tonelli에 트리를 외. 18에서 설명한대로, 예를 들어 이중 형광 리포터 / 센서 벡터를 이용하여 생체 내에서 특정 미르의 모든 활동의 강도와 위치를 테스트하기 위해 제공한다. 그들은 GFP - 기자와 RFP 미르 센서를 포함하는 벡터를 사용합니다. RFP는 무료 미르의 순서로 이어진다. GFP 발현이 성공적으로 형질 전환 세포를 식별하는 동안, 적색 형광 (RFP)를 조사 미르의 부재를 나타내고, 적색 형광의 실종은 미르의 존재를 배반한다. 이 기술은 또한 RFP의 하류에서 표적 서열의 3'UTR을 사용하여, 생체 내에서 미르 타겟의 특이성을 시험하기 위하여 사용될 수있다.이 기술이 함께 찍은 서로 다른 조직에서의 유전자 발현과 기능에 대한 개발 연구에 매우 적합합니다.
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Disclosures
우리는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
우리는 미르의 사진이 영화와 M. Nicolescu의 초기 단계에 기여 K. Mikic을 인정합니다. C. 후버는 Universtitätsklinikum 튀빙겐의 행운 프로그램에 의한 Universtitätsklinikum 튀빙겐 IZKF, A. 앨윈 프렘 아난드의 친교에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Borosillicate glass capillaries | Hartenstein | Model: 0.9 mm | |
| Microcapillary puller | WPI, Berlin | Model: Pul1-E | |
| Electroporator | Intracel | Model: TSSIC | |
| Stereomicroscope - fluorescence | LEICA | Model: MZFLIII | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Model: Stemi | |
| Camera and software | Zeiss | Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8 |
References
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