Summary
Ektopisk uttryck är en teknik för att belysa mikroRNA roll i hjärnans utveckling. Men upp specifika områden med hjälp av in ovo elektroporation är utmanande. Här visar vi ett effektivt sätt att selektivt electroporate ventrala och dorsala mitthjärnan regioner.
Abstract
Icke-kodande RNA finns ytterligare aktörer reglera genuttrycket. Riktade in ovo elektroporering av specifika områden ger ett unikt verktyg för rumsliga och tidsmässiga kontroll av ektopisk mikroRNA uttryck. Men ventrala hjärnstrukturer som ventrala mitthjärnan är ganska svårt att nå för eventuella manipulationer. Här visar vi ett effektivt sätt att elektroporera miRNA i ventrala mitthjärnan med användning av tunna platinaelektroder. Denna metod erbjuder ett tillförlitligt sätt att transfektera specifika områden i mellanhjärnan och ett användbart verktyg för in vivo-studier.
Introduction
Erkännandet av små icke-kodande RNA som extra spelare för genuttryck lanserat en ny komplexitet till genomisk programmering / genreglering. Olika arter av icke-kodande RNA har funktionell betydelse i neurala celler, inklusive små icke-kodande RNA 1-4. MikroRNA (MIR eller miRNA) t.ex. visar tydliga och skiftande uttryck profiler i utvecklings hjärnor 5. Riktade in ovo elektroporering av kycklingembryon ger en unik möjlighet till tid och rum kontroll av genuttryck och tystar under utveckling.
Denna video visar de olika stegen för att utföra ektopisk uttryck av miRs i specifika områden i chick mitthjärnan med hjälp av in ovo elektroporering 6-10. För att säkerställa en långvarig effekt av dessa små icke-kodande RNA-molekyler i celler, DNA-sekvensen av miRs klonas in i mono-eller bi-cistronic vektorer. För in ovo elektroporation, miR innehåller vector insprutas i mitthjärnan neurala röret genom att exponera embryon efter att ha gjort ett litet fönster i äggskalet. För att transfektera specifika områden i mitthjärnan litet plus (anod) och minus (katod) platinaelektroder är placerade vid specifika positioner. För ventrala mitthjärnan transfektion, är anoden placerad under det vänstra ventrala mitthjärnan och katoden ovanför den högra halvan av mitthjärnan innan en ström. Öppningen i äggskal är stängd med tejp och embryon inkuberas under så lång tid som erfordras för varje analys. Metoden beskrevs ursprungligen av al. Muramatsu et 6 och förbättras genom Momose et al. 8 för visst område transfektion.
Schematisk översikt.
- Embryot i ägget exponeras genom att skära ett litet fönster i the äggskal.
- Den upplösta vektorn (vektorerna) injiceras i mitthjärnan med användning av en mikro kapillär.
- Två elektroder - placerade parallellt eller under och ovanför embryot - genererar en pulserande elektriskt fält.
- Det elektriska fältet skapar tidsmässigt porer i cellmembranet, som underlättar inträde i cellen av det negativt laddade DNA (eller RNA) attraheras till anoden 11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Krav på I ovo elektroporering
- Förbereda vektorkonstruktet: miR sense och antisense primers utformades efter instruktioner från Ambion, glödgad och ligerades i Apal / EcoRI diger pSilencer U6.1 vektor. Efter lyckad omvandling en av de resulterande klonerna odlades och pSilencer plasmid isolerades genom alkalisk lys metod med en Quiagen midi förberedelse kit.
- Elektroder: Elektroder kan köpas eller lätt byggas 13. Vi använder self-made elektroder av platinatråd (Φ = 0,2, 0,25 eller 0,5 mm i diameter) eller i vissa fall en ännu mindre volframtrådelektrod (Φ = 0,1 mm) 8 beroende på vilket område vi vill electroporate. För att undvika anvulkning av vävnad, använder vi som regel ju närmare till vävnaden tunnare elektroderna. För bred elektroporation av mitthjärnan, använder vi 0,5 mm platinatrådar lödda till en mässing / rostfritt stål tubuläraxel och fäst vid en elektrodhållare med ett avstånd av 3-5 mm (figur 1). Att elektroporera specifika områden, använder vi 0,25 mm platina tråd anoder och 0,2 mm platinatråd eller 0,1 mm volfram för katoden med ett ungefärligt avstånd på 1 mm eller mindre.
- Lösningar: Har följande lösningar till hands:
- Autoklavbehandlades kyckling Ringer, pH 7,5 (9,0 g NaCl, 0,42 g KCl, 0,24 g CaCl2, lös upp i 1 L destillerat vatten).
- PBS (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 0,24 g KH 2 PO4, 1,44 g Na 2 HPO 4, lös upp i 1 liter destillerat H2O).
- Fast Green: stamlösning 10 mg / ml destillerat H2O
- Långsamt torkande bläck (mindre shellack och därmed mindre förgiftning för embryot). Anm: En blå dichroic filter bifogas en fiberoptisk lampa som beskrivs i Canto-Soler och Adler 14 förbättrar kontrasten och kan eliminera behovet av att injicera bläcket.
Figur 1. Skiss av elektroderna och elektrodhållare. (A, B, C) platinatråd löddes till en sida av en rostfri rörformig axel. Ett hål borrades i den andra sidan av den rörformiga axeln sålunda att stift kan passa in (A) Röda och blå färgade trådarna var ansluten till stift. I den motsatta änden av tråden var monterad på banankontakter som fungerar med de elektriska uttagen på elektroporator. (A, C) Den platinatråd böjdes i en ängel av 90 °. Ett lager av nagellack isolerade skaftet ovanför kurvan.
2. Förberedelserna Direkt tidigare i ovo elektroporering
- Förbered följande material:
- Späd bläck med kyckling Ringer 01:06, lägga Antibiotika Antimykotisk lösning (100x från Gibco) 1:100.
- Förbered vektor lösning: 1-2 ug / ul per specifik DNA i H2O kompletterad med Fast Green (1:20).
- Sterilisera pincetter, saxar, volfram nål och elektroder med 70% etanol.
- Dra mikropipetter för nukleinsyra injektion från borosilikatglas kapillärer (längd till ytterdiameter: 100 mm x 0,9 mm). Vi använder en enkel avdragare PUL-1 (WPI, Berlin) med de inställningar som visas i tabell 1.
- Ställ in parametrarna för elektroporator som visas i tabell 2.
| Parametrar | Värden |
| Hetta | 350 |
| Dra | 100 |
| Velocity 50 | |
| Fördröjning | 200 |
Tabell 1. Inställningar för PUL-1
| Parametrar | Värden |
| Frekvens | 50 Hz |
| Fördröjning | 20-50 ms * |
| Bredd | 20 msec |
| Spänning | 8-25 V * |
| Puls | 3-5 gånger |
| * Beroende på elektroddiameter och avstånd. Vänligenta hänsyn till när man byter en av parametrarna. | |
Tabell 2. Inställningar för Pulse Stimulator
- Förbered kycklingembryon för elektroporation:
- Inkubera befruktade hönsägg på sin långsida vid 37 ° C med 65% luftfuktighet i 39 timmar för att få embryon mellan Hamburger & Hamilton (HH) steg 15 9-11. Embryot lägger sig på den översta delen av ägget, så du bör markera den med en penna linje.
- Desinficera äggen med 70% etanol.
- Hål i ägget vid sin bredare sidan, där luftspalten ska vara.
- Ta 1-2 ml äggvita. Detta kommer att ta bort embryot från äggskal.
- Cello-tape äggskal för att undvika skalsplitter faller på embryot. Använd en sax för att klippa ett litet fönster in i äggskal runt blyertslinjen.
- Injicera en bit av bläcknedanför området opaca att visualisera embryot.
- Gör ett snitt i vitellinmembranet med en vass volfram nål för att uppnå en bättre tillgänglighet av embryot för nukleinsyra injektion och elektroporation.
3. Elektroporation och Inkubation
- Tillsätt ett par droppar varmt Ringers lösning på embryona. Detta kommer att sänka embryona, förhindrar överhettning genom stickning av elektroderna till vävnaden och ger ett medium för den ström mellan två elektroder.
- Injicera vektorlösningen in i lumen av det neurala röret vid mitthjärnan nivå. Om DNA-expressionsvektor innehåller någon reportergen (t.ex. EGFP), tillsätt en något lägre koncentrerad reportergen vektor (1 ug / ul miR uttrycker vektorn till 0,9 ug / ul reportergen vector) till DNA-lösningen. Detta kommer att säkerställa att du känner igen transfekterade celler senare 8. Vi använder den så kallade pCAX vektor, en vänlig gåva from C. Krull 13.
- För en bred transfektion av mitthjärnan, placera elektroderna till vänster och höger av embryot i höjd med mitthjärnan. Avståndet mellan elektroderna bör vara cirka 3-5 mm. De övriga inställningarna är 15V, 20 ms pulser och 50 ms fördröjning för HH 10. Ändring av läget för de två elektroderna något längs Dorso-ventrala (DV) axeln i mitthjärnan säkerställer en mer bred transfektion av celler DV axeln transfektion.
- För ventrala transfektion, tillsätt lite Ringer att lyfta huvudet från äggulan membranet och placera anoden under ventrala mitthjärnan. Om huvudet inte stiger pressa elektroden under membranet som separerar gulan och embryo för att undvika anvulkning av neuralröret. Katoden bör placeras ovanför mitthjärnan dorso-lateralt motsatt anoden. Rör inte neuralrörsdefekter. Vi transfektera den vänstra ventrala delen av mellanhjärnan för att undvika problem med hjärtutveckling. Avståndet mellan elektrodernaär ca 1-0,5 mm, resten av inställningarna är 10V, 20 ms bredd och 50 ms fördröjning.
- Applicera en annan droppe av saltlösning på toppen av embryona för att kyla ner och ta bort luftbubblor.
- Täta ägg med tape och inkubera under åtminstone 4 h; den minsta tid som krävs för vektoruttryck.
4. Fixering av kycklingembryon
- Ta bort embryon från sina ägg.
- Rena embryon under ett stereomikroskop och bedöma omfattningen av transfektion med en fluorescerande stereomikroskop.
- Fäst embryon över natten i 4% PFA vid 4 ° C. Fortsätt med snittning och / eller färgning (in situ hybridisering, immunohistokemi) för att analysera förändringar i den transfekterade området.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Omfattningen av mitthjärnan område transfekterad med miR är synlig genom uttryck av GFP från en reportervektor injicerades tillsammans med miR uttryckande vektorn (Figur 2). Användning av platinaelektroder med en diameter av 0,5 mm och placeras parallellt med AP-axeln i mitthjärnan leder normalt till transfektion av ett brett område längs den DV-och AP-axeln, inklusive bakhjärnan, mitthjärnan och ibland diencefalon (Fig. 2A och B). Storleken hos elektroderna resulterar i ett stort elektriskt fält appliceras på hjärnregion och därmed ett brett transfekterad området.
Det är svårt att exakt rikta ett område som till exempel den ventrala mitthjärnan. Att minska avståndet mellan 0,5 mm elektroderna för att uppnå ett mindre elektriskt fält är ofta toxisk för embryot och leder till artefakter. Vi använde elektroder med mindre diameter (0,2 mm, 0,25 mm platina eller 0,1 mm vässade volfram tråd), som erbjuder mer lokal transfection liknande som av den ventrala hjärnan, som är svåra att nå (fig 2C-I). Mindre elektroder minska det elektriska fältet appliceras och möjliggöra att sätta elektrod mycket närmare till vävnaden. Figur 2F visar ett exempel, där hela den ventrala mitthjärnan hade transfekterats. I figurerna 2G och 2H de transfekterade ventrala områden är mindre, men en del av hindbrain (2F) eller diencefalon (2H) också transfekteras. I figur 2G, var anoden placeras under mitten och hindbrain för transfektion både ventrala områden. Figur 2H visar ett exempel på en anod inte väl isolerade med nagellack längs axeln. Således inte bara den ventrala området runt MHB uttrycker miR / GFP utan även där axeln hos anoden hade placerats dorsal anterior mes-och di-hjärna,. Den specifika ventrala miR / GFP fördelningen i figurerna 2C-I är ett resultat från den lokalaelektriska fält vi tillämpar med de mindre elektroder. Sammantaget, med mindre elektroder och elektriska fält vi kan uttrycka DNA / RNA i mer begränsade områden som ventrala mitthjärnan.
Eftersom vår microRNAen Expressionsvektom innehåller ingen reportergen, vi blandar i en GFP-uttrycksvektorn i ett förhållande av 1 ug / ul till 0,9 pg / pl, respektive. Den nästan lika förhållandet säkerställer att mikroRNA och GFP transfekterade område nästan helt överlapp (se Momose et al. 8 och egen erfarenhet). För att kunna bedöma omfattningen av den transfekterade området blir viktigt när endast ett litet område som innehåller specifika celltyper transfekteras eller de transfekterade cellerna används för QRT-PCR. En mycket mindre koncentration av reportergenen kan leda till celler som uttrycker GFP under detekteringsnivån. Styrkan av uttryck av någon transfekterad vektor beror inte bara på koncentrationen av den använda vektorn, utan också på promotorn. Våra vektorer är U6-promotor körningen (som uttrycker miRNA) och ß-aktin promotor driven (som uttrycker fluorescerande proteiner) och är både ubiquitously och konstitutivt aktiv i kycklingembryo.
De flesta av våra embryon elektro till vänster utom figur 2C (spegelbild). För tidsförlopp experiment, är elektroporation av den högra sidan av embryot rekommenderas eftersom de flesta embryon vända huvudet åt höger och ligger på sin vänstra sida.
Figur 2. Representativa resultat. Embryon elektro mellan HH10 och HH11 och fastställas till de etapper som anges i bilderna. (AC) visar electroporations i rygg mitthjärnan, och (DI) i ventrala mitthjärnan. Pilarna i (D, E) anger ventralt belägna, GFP positiva celler. För mer information se text. Mes- Hjärnan / mitthjärnan, Di - diencephalon, Tel - telencefalon, Rhom - rhombencephalon / bakhjäman.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna video visar en effektiv metod för transfektion plasmid i neuroepiteliala cellerna i specifika områden i chick mitthjärnan. Rektangulära elektriska pulser med låg spänning kan introducera DNA in i celler av chick neuralröret in ovo 6,16. Dock är noggrannheten hos DNA-målinriktning ofta försvåras av det stora elektriska fältet, som stiger upp genom de relativt stora elektroder (Φ = 0,5 mm). Vi försökte tackla det problemet genom att använda elektroder mindre diameter följa riktlinjerna i Momose et al. 8. För ventrala mitthjärnan transfektion, vi placerar katoden under membranet av området pellucida eller om en ålder av embryot gör det direkt under den ventrala mitthjärnan. Det sista scenariot behöver lite övning eftersom mitthjärnan / neuralrörsdefekter vävnad inte får vidröras och skadas av anoden. Lägga Ringer kan ofta hjälpa till att lyfta huvudet av embryot något från membranet som täcker området pellucida.
Trots att överväga är gen koncentrationer i cellen. Olika gen doser kan ha olika effekter på celler och vävnad. Det kan finnas en tröskeleffekt inblandade (se Agoston et al. 17, till exempel) eller olika, sorterade effekter. Vi testar normalt diffehyres koncentrationer av miR uttrycker (0,5-2 mikrogram / l) vektor och analysera förändringar i morfologi eller protein / gen-uttryck. Effekter kan testas in vivo med användning av immunohistokemi, vektorsensorn 18 eller RNA-in situ-hybridisering.
Denna teknik erbjuder också att testa styrka och placering av någon verksamhet i en specifik miR in vivo med hjälp av till exempel en dubbel fluorescens reporter / sensorvektor som beskrivs i De Pietri Tonelli et al. 18. De använder en vektor som innehåller en GFP-reporter och en RFP miR-sensor. RFP följs av en kostnadsfri miR sekvens. Medan GFP-uttryck identifierar framgångsrikt transfekterade celler röd fluorescens (RFP) anger frånvaron av den undersökta miR, och försvinnandet av röd fluorescens avslöjar närvaron av miR. Denna teknik kan också användas för att testa specificiteten hos miR mål in vivo, genom användning av 3'UTR av målsekvensen i nedströms av RFP.Sammantaget denna teknik är mycket lämplig för utvecklingsstudier på genuttryck och funktion i olika vävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Vi erkänner K. Mikic, som bidrog till den inledande fasen av den här filmen och M. Nicolescu för miR bilden. C. Huber fick stöd av ett stipendium av IZKF av Universtitätsklinikum Tübingen, A. Alwin Prem Anand av Fortune program Universtitätsklinikum Tübingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Borosillicate glass capillaries | Hartenstein | Model: 0.9 mm | |
| Microcapillary puller | WPI, Berlin | Model: Pul1-E | |
| Electroporator | Intracel | Model: TSSIC | |
| Stereomicroscope - fluorescence | LEICA | Model: MZFLIII | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Model: Stemi | |
| Camera and software | Zeiss | Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8 |
References
- Kutter, C., Svoboda, P. miRNA, siRNA, piRNA: Knowns of the unknown. RNA Biol. 5, 181-188 (2008).
- Szell, M., Bata-Csorgo, Z., Kemeny, L. The enigmatic world of mRNA-like ncRNAs: their role in human evolution and in human diseases. Semin. Cancer Biol. 18, 141-148 (2008).
- Li, X., Jin, P. Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity. Nature reviews. Neuroscience. 11, 329-338 (2010).
- Riedmann, L. T., Schwentner, R. miRNA, siRNA, piRNA and argonautes: news in small matters. RNA Biol. 7, 133-139 (2010).
- Coolen, M., Bally-Cuif, L. MicroRNAs in brain development and physiology. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 461-470 (2009).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
- Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Nakamura, H., Watanabe, Y. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Dev. Growth Differ. 42, 199-201 (2000).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nat. Protoc. 3, 419-426 (2008).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Gene Hofschneider, P. H. transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO journal. 1, 841-845 (1982).
- Potter, H., Weir, L., Leder, P. Enhancer-dependent expression of human kappa immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 7161-7165 (1984).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn. 229, 433-439 (2004).
- Canto-Soler, M. V., Adler, R. Optic cup and lens development requires Pax6 expression in the early optic vesicle during a narrow time window. Developmental biology. , 294-2119 (2006).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev Dyn. 195, 231-272 (1992).
- Muramatsu, T., Nakamura, A., Park, H. M. In vivo electroporation: a powerful and convenient means of nonviral gene transfer to tissues of living animals (Review). Int J Mol Med. 1, 55-62 (1998).
- Agoston, Z., Li, N., Haslinger, A., Wizenmann, A., Schulte, D. Genetic and physical interaction of Meis2, Pax3 and Pax7 during dorsal midbrain development. BMC Dev Biol. 12, 10 (2012).
- De Pietri Tonelli, D., et al. Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid. Biotechniques. 41, 727-732 (2006).
