Summary
En ny teknik til at skabe en reproducerbar
Abstract
Anvendelse af genetisk modificerede mus øger vores forståelse af molekylære mekanismer, der ligger adskillige neurologiske lidelser, såsom en rygmarvsskade (SCI). Freehand manuel kontrol anvendes til at producere en laceration model af SCI skaber inkonsistente skader ofte er forbundet med en crush eller kontusion komponent, og derfor blev en ny teknik udviklet. Vores model for cervikal laceration SCI har løst vanskelighederne med frihånd metode ved at indarbejde 1) livmoderhalskræft vertebral stabilisering af rygsøjlen facet fiksering, 2) forbedret rygmarv eksponering og 3) etablering af en reproducerbar laceration af rygmarven ved hjælp af en oscillerende klinge med en nøjagtighed på ± 0,01 mm i dybden uden associeret kontusion. Forhold til den standard metoder til at skabe en lokalitet laceration såsom frihånd anvendelse af en skalpel eller saks, har vores metode frembragt et læsion. Denne metode er nyttig til undersøgelser af axonal regenerering af corticospNDELIGE, rubrospinal og ryg stigende skrifter.
Introduction
Tilgængeligheden af genetisk modificerede mus er et kraftfuldt værktøj til at identificere virkningerne af specifikke gener, der spiller en rolle i de mekanismer af SCI. Laceration SCI er en vigtig model, der anvendes til at undersøge terapeutiske midler eller molekyler, der kan give en effektiv behandling efter denne skade 8.. Fiksering af torntappene i oprettelsen af laceration skade i mus er upræcis på grund af vanskeligheden ved at fatte de tynde og skrøbelige torntappe involveret med at opretholde spinal fiksering 5,11. Variation i dybden af sønderrivning af kun 0,2 mm (10% af diameteren af muse rygmarv) forårsager misvisende fortolkning af data. Arten og omfanget af rygmarven laceration læsion skal defineres præcist 10. For at løse denne udfordring, har vi udviklet en ny teknik, der består af vertebral stabilisering og brugte fabrikerede vinger fastgjort til Louisville Injury System Apparat (LISA) at producere en laceration SCI 7,14. Denne skade blev oprettet ved hjælp af en skarp oscillerende kniv, der undgik væv deformation under laceration processen. Dybden af laceration var præcis til en nøjagtighed på 0,01 mm ved hjælp af mikro-drivere, der styrer laceration dybde. Skæreknive er skræddersyet til bestemte former og bredder for at skabe den ønskede laceration kontur 9.. Vi viser 1) metoden til halshvirvelsøjlen eksponering, 2) teknik vertebrale stabilisering ved hjælp af en bilateral facet fiksering enhed, og 3) oprettelse af en cervikal laceration skade ved hjælp af en vibrerende klinge.
Protocol
1.. Animal Udarbejdelse og anvendelse af Spine Stabilizer
Musen halshvirvelsøjlen er konkav ventralt set fra lateral. Torntappene fra C3 til T1 er små og smuldres og er derfor ikke egnede til vertebrale stabilisering som ofte beskrives 3,4. Vi anbefaler, at rygsøjlen stabilisering udføres af lateral facet fiksering. Fastgørelsesindretningen består af en U-formet metal kanal til at støtte mus og to justerbare arme af rustfrit stål, der klemme til hver facet sideværts. Dette giver fremragende immobilisering af target ryghvirvel. Efter spinal fiksering, er rygraden lidt forhøjet at flade halshvirvelsøjlen krumning for at give en bedre eksponering af rygmarven.
- Sterilisere følgende kirurgiske instrumenter: 2-3 par af tang, 2 par microscissors, en 30 G nål sutur og nål indehaveren, hud klip og klip applikator. Desinficer rygsøjlen stabilisator. Anesthetize musen med en intraperitoneal cocktail af Ketamin / Xylazin (100 mg / 10 mg / kg). Barbere håret fra musens hals.
- Efter rensning af huden med en povidon-jodopløsning og 70% alkohol, flyt musen på operationsbordet varmet med en varmepude. Dæk dyrets øjne med oftalmologiske salve for at forhindre hornhinden tørring.
- Efter induktion af anæstesi (nås, når musen ikke reagerer på en hale knivspids), lave en posterior livmoderhalskræft midterlinje hudincision fra nakkeknude til spæk-pad af den nedre halshvirvelsøjlen. Under forstørrelse, udføre en midtliniesnit mellem trapezius musklerne C2 og opdele semispinalis capitis muskler. Identifikation af submuscular fedtpude letter dissektion i det korrekte lag.
- Forlæng midterlinjen muskel dissektion caudally til T2 spinosus proces, der tjener som en pålidelig vartegn. Skær musklerne knyttet til T2 ryghvirvel og fjern bruskspidserne del af T2spinosus proces.
- Dissekerer paraspinal musklerne fra C2 gennem T2 laminae hjælp af et par mikro-saks. Muskel dissektion begynder tilstødende torntappene og strækker bilateralt til facetled. Adskille musklerne umiddelbart omkring torntappene og laminae (i periosteal lag) for at minimere blødning. Efter de laterale facetter er udsat, skal du placere musen på den U-formede kanal LISA scenen.
- Fastgør rustfrie arme under de udsatte facetter bilateralt. Når armene er på plads, stram fingerskruer af stål arme til at immobilisere rygsøjlen. Dette fastholder fast fiksering af målet ryghvirvel og giver fremragende eksponering. Armene kan indstilles til at give nøjagtig vandret orientering af rygsøjlen.
- Incise ligamentum flavum mellem C5 og C6 at eksponere underliggende dura. Mellem interlaminar rummet, brug en 30 G nål til at skabe en lille durotomy hvorigennem microscissors placeret tilforlænge durotomy. Rygmarven er nu parat til at gennemgå den kontrollerede laceration læsion.
2.. Cervikal Spinal Cord rifter Brug af LISA Device
- Bredden af den cervikale rygmarv udvidelsen varierer på forskellige niveauer. Lav en dorsal hemisection læsion på C5-6 ved hjælp af en 2,3 mm flad og indstil amplitude til at dække hele bredden af rygmarven. Blades opnås fra Fine Science Tools Inc. (Foster City, CA) og modificeret til rygmarven laceration. Opretholde amplituden af bladet svingningerne på ≥ 0,5 mm, da lavere amplitude niveauer vil mindske den lette ledningen laceration.
- Placer rygsøjlen stabilisator og musen på LISA scenen. Vingen er knyttet til LISA med sin stilling styret af mikro-drivere kan tre intervaller af bevægelse. Komponenter af Lisa og deres funktioner er beskrevet i figur 1..
- Power bladet-vibrerende kontakt på. Under storslåedegement, flyt musen, så den udsatte rygmarven er placeret direkte under den vibrerende klinge.
- Ophøje scenen støtter musen mod oscillerende kniv. "0" position registreres, når bladet knapt rører dorsale vene i rygmarven. Måle dybden af rygmarven laceration forhold til "0" positionen.
- Elevate scenen position ved mikro-driver styring: 360 ° drejning af mikro-driveren knop hæver scenen med 0,25 mm. Således er en 0,75 mm dorsal hemisection læsion skabt ved at dreje mikro-driveren knop 3 gange. Nøjagtigheden af læsionen er ± 0,01 mm. Som bladet begynder at lacerate rygmarven, smøre det kirurgiske område med saltvand kunstvanding. Skæredybde rygmarven styres af lodrette mikro-driver og er uafhængig af visuel vejledning.
- Når forudbestemt dybde er nået, drejes vibrerende slukke. Ideelt set oscillerende kniv anbragt i lesion hul uden tegn på væv deformation. Sænk etape fra klingen og fjern blod og saltvand fra det kirurgiske felt ved hjælp bomuld Q-tips. Hæmostase opstår spontant hos <1 min.
- Slip musen fra ryggen stabilisator. Tilnærme paraspinal muskler ved hjælp af 6-0 silkesutur og lukke huden sår ved hjælp af rustfrit stål Michel klip.
3.. Animal Care
- Subkutant injicere alt 1-2 ml saltvand til at opretholde tilstrækkelig hydrering og placere musen i aflåst bur på en varmepude, mens genvinde bevidstheden.
- Giv vand og bløde mad ad libitum og administrere analgetika i 48 timer postoperativt. Der er ikke behov for blære pleje efter dorsal hemisection af rygmarven.
Representative Results
Immobilisering af målet ryghvirvel er af stor betydning i at generere nøjagtige læsioner i mus rygmarven. Vores rygrad stabilisering enhed overvinder de anatomiske spørgsmål af korte torntappe og ventrale lordosis af musen halshvirvelsøjlen. Halshvirvlerne er godt eksponeret ved hjælp af vores halshvirvelsøjlen stabilisator (figur 2). Vores mus rygsøjlen stabiliserende enhed er en pålidelig teknik til at forberede rygsøjlen for celleforandringer i livmoderhalsen rygmarv procedurer. Dybden af læsionen ved hjælp af LISA er nøjagtig til 0,01 mm 6,13. Den præcise laceration forårsager ingen kontusion ved læsion / vævsgrænsefladen (figur 3). Præcisionen af de dorsale hemisection læsioner blev påvist i C57BL / 6 mus i en undersøgelse om axon regenerering i hvilken en 0,9 mm dyb laceration forlænget lige over den centrale kanal i hver prøve bekræftet ved patologiske sektioner af rygmarven 1.. Locomotion af alle disse dyr kommer siged efter denne rygmarv laceration skade.
Fig. 1. (A) mus i rygsøjlen stabilisator placeret på LISA scenen. Den vibrerende klinge er rettet mod rygmarven at blive flænget. Micro-driver, er placeret under scenen og er designet til at placere musen i den relevante site. Den lodrette mikro-driveren styrer læsion dybde og vippe knop styrer vandrette plan af rygmarven for at forhindre vinkling af rifter. Den on-off switch styrer vibrationer motor, og en anden knop justerer sin amplitude. (B) A 0.75 mm dorsal hemisection laceration læsion skæres under intakte laminare hvælvinger.
Figur 2. (A) Musen rygsøjlen stabilisator bestående af en U-formet kanal og to arme og stik. Musen placeres i C trug anvendes til cervikal SCI og i T trug til thorax SCI. (B) halshvirvelsøjlen er fikseret ved at placere armene under de laterale facetter og derefter låse fingerskruerne. Dura er eksponeret mellem lagene af C5-6-, C6-7, og C7-T1 uden nogen fjernelse af knogle.
Figur 3.. Fire dorsale rygmarv flænger på dybder på 0,5, 0,8, 1,1 og 1,4 mm observeret i sagittalbillede (cresyl-violet og eosinfarve) skildrer den høje grad af præcision ved hjælp af denne teknik.
Discussion
Vertebrale stabilisering før laceration skader på rygmarven er opnået ved fiksering af torntappe. Både halshvirvelsøjlen lordotic kurve og fastgørelse af klemmer til de skøre korte livmoderhalskræft torntappe fra C3 til og med T1 i musen forhindre en effektiv rygsøjlen stabilisering. Desuden brug af et barberblad eller microscissors anvendes under manuel kontrol forårsager betydelig væv deformation, der skaber variation i dybden af læsionen 6.. Dette kan føre til misfortolkning af data, især når axonal regenerering af specifikke veje er undersøgt. For eksempel kan skånet dorsale corticospinal axoner blive misforstået som regenererede axoner hvis dorsale corticospinal tarmkanalen ikke var helt transected på tidspunktet for lesioning. Disse udfordringer kan overvindes ved hjælp af en rygrad stabilisering enhed med fiksering til facetter på et enkelt niveau og præcis lesioning af rygmarven. Derudover bruger ahIGH frekvens oscillerende klinge producerer en skarp laceration uden knusning eller contusing den tilstødende rygmarven. Denne metode er blevet anvendt til fremstilling rygmarv laceration skader i rotter 9,12,14, med efterfølgende ændringer at producere thorax rygmarv flænger i mus 6.. I denne meddelelse, beskriver vi den metode til at skabe pålidelige cervikale laceration læsioner i mus.
For så vidt som den anteroposteriore diameter af rygmarven er <2 mm i mus, præcise dybder sønderrivning læsion er afgørende for at skabe en pålidelig eksperimentel model. Minimal variation i læsionen dybde væsentlig grad ændre resultaterne af forsøg, der vurderer Axon regenerering samt volumetriske og adfærdsmæssige studier. Nøjagtigheden af læsionen dybde ved hjælp af denne metode er ± 0,01 mm, fordi vi brugte høj præcision mikro-drivere til at styre placeringen af kniven. Denne metode har reduceret inkonsistens iHerent i andre modeller for at skabe et laceration SCI. Denne metode er især nyttig i at studere axonal regenerering af den lange rygmarv veje beliggende i den dorsale halvdel af rygmarven, såsom corticospinal fordøjelseskanalen, rubrospinal tarmkanalen, og den dorsale opstigende tarmkanalen. Med denne metode kan disse fiber skrifter være helt og pålideligt transected. I denne henseende er fejl datafortolkning minimeret, og derved forbedre pålideligheden af rapportering af eksperimentelle undersøgelser SCI.
Sammenfattende har vi beskrevet en ny teknik til at skabe en reproducerbar in vivo-model af cervikal rygmarv laceration skade i mus. Denne teknik er baseret på rygsøjlen stabilisering ved fiksering af de cervikale facetter og laceration af rygmarven ved hjælp af en oscillerende kniv. Ved hjælp af denne metode i en dorsal thorax rygmarv laceration model i mus 6, vi demonstreret en stram sammenhæng mellem laceration dybde, histologi ogadfærd opsving. En sådan teknik har også vist sig at være pålidelige af flere andre laboratorier 2,12.
Disclosures
- Adskillige forfattere (YPZ, XMX, CBS) har en økonomisk interesse i Louisville Slaglegeme System, Inc.
- Forfatterne, Yi Ping Zhang, Lisa BE Shields og Christopher B. Shields, er medarbejdere i Norton Healthcare, Louisville, KY. Andre forfattere er ansat af Indiana University, Indianapolis, IN.
- Forfatterne har ikke modtaget midler fra enhver virksomhed, der producerer reagenser eller instrumenter anvendt i denne artikel.
Acknowledgments
Udviklingen af denne enhed blev støttet af LISA Co, Louisville, Kentucky. Vi anerkender også den løbende støtte fra Norton Healthcare, Louisville, KY til CBS, og NIH NS050243, NS052290 og NS059622 til XMX.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice vertebral stabilizer | Louisville Impactor System | Stabilize and expose the cervical vertebra | |
| LISA vibraknife | Louisville Impactor System | Produce the laceration injury of the cervical spinal cord | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15013-12 | Skin and trapezius muscle incision |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15023-10 | Separate muscles from the laminae |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15002-08 | Incision of dura |
| Graefe forceps | Fine Science Tools (USA) | 11154-10 | Retract skin |
| Dumont #7 forceps | Fine Science Tools (USA) | 11274-20 | Muscle retraction (tip modified)(Fig. A) |
| Dumont SS forceps | Fine Science Tools (USA) | 11203-25 | Fixation of vertebra (tip modified )(Fig.B) |
| 30G needle | Becton Dickenson | 305106 | Create a dural opening |
| 6-0 suture | Ethicon | 8806H | Close muscle and fascial layers |
| wound clip | Fine Science Tools (USA) | 12031-07 | Skin closure |
| Tribrom–thanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | 90710-10G | Anesthetic agent |
Louisville Impactor System, Inc, 210 E. Gray St., Suite 1102, Louisville, KY 40202, (502) 629-5510, E-mail: cbshields1@gmail.com Fine Science Tools (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139, (800) 521-2109, E-mail: info@finescience.com Becton Dickenson, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA 07417, (201) 847-6800 Ethicon, Route 22 West, Somerville, NJ 08876 1-877-ETHICON Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA, 63178 (314) 771-5765, E-mail: cssorders@sial.com |
|||
| Figure A is the modified Dumont #7 forceps; B is the modified Dumont SS forceps. | |||
References
- Blackmore, M., Letourneau, P. C. Changes within maturing neurons limit axonal regeneration in the developing spinal cord. J. Neurobiol. 66 (4), 348 (2006).
- Blackmore, M. G., et al. Kruppel-like Factor 7 engineered for transcriptional activation promotes axon regeneration in the adult corticospinal tract. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109 (19), 7517 (2012).
- Carbajal, K. S., et al. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Duhamel, G. Mouse lumbar and cervical spinal cord blood flow measurements by arterial spin labeling: sensitivity optimization and first application. Magn. Reson. Med. 62 (2), 430 (2009).
- Hermanns, S., Reiprich, P., Muller, H. W. A reliable method to reduce collagen scar formation in the lesioned rat spinal cord. J. Neurosci. Methods. 110 (1-2), 141 (2001).
- Hill, R. L. Anatomic and functional outcomes following a precise, graded, dorsal laceration spinal cord injury in C57BL/6 mice. J. Neurotrauma. 26 (1), 1 (2009).
- Iannotti, C. Dural repair reduces connective tissue scar invasion and cystic cavity formation after acute spinal cord laceration injury in adult rats. J. Neurotrauma. 23 (6), 853 (2006).
- Inman, D., Guth, L., Steward, O. Genetic influences on secondary degeneration and wound healing following spinal cord injury in various strains of mice. J. Comp Neurol. 451 (3), 225 (2002).
- Onifer, S. M., et al. Adult rat forelimb dysfunction after dorsal cervical spinal cord injury. Exp. Neurol. 192 (1), 25 (2005).
- Ramer, M. S., Harper, G. P., Bradbury, E. J. Progress in spinal cord research - a refined strategy for the International Spinal Research Trust. Spinal Cord. 38 (8), 449 (2000).
- Seitz, A., Aglow, E., Heber-Katz, E. Recovery from spinal cord injury: a new transection model in the C57Bl/6 mouse. J. Neurosci. Res. 67 (3), 337 (2002).
- Sivasankaran, R., et al. PKC mediates inhibitory effects of myelin and chondroitin sulfate proteoglycans on axonal regeneration. Nat. Neurosci. 7 (3), 261 (2004).
- Yu, P., et al. Inhibitor of DNA binding 2 promotes sensory axonal growth after SCI. Exp. Neurol. 231 (1), 38 (2011).
- Zhang, Y. P. Dural closure, cord approximation, and clot removal: enhancement of tissue sparing in a novel laceration spinal cord injury model. J. Neurosurg. 100, 343 (2004).
