Summary
Uma nova técnica para criar um reprodutível
Abstract
Uso de camundongos geneticamente modificados aumenta nossa compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes a vários distúrbios neurológicos, como uma lesão da medula espinhal (SCI). Controlo manual à mão livre utilizado para produzir um modelo de laceração da SCI cria muitas vezes inconsistentes lesões associadas com um componente de esmagamento ou contusão e, por conseguinte, uma nova técnica foi desenvolvida. Nosso modelo de laceração cervical SCI resolveu dificuldades inerentes com o método à mão livre, incorporando 1) estabilização vertebral cervical por meio da fixação faceta vertebral, 2) maior exposição da medula espinhal, e 3) criação de uma laceração reprodutível da medula espinhal usando uma lâmina oscilante com uma precisão de ± 0,01 mm de profundidade sem contusão associada. Em comparação com os métodos convencionais de criação de uma laceração SCI como o uso à mão livre de um bisturi ou tesoura, o nosso método produziu uma lesão consistente. Este método é útil para estudos sobre a regeneração axonal de corticospinal, rubrospinal e dorsal tratos ascendentes.
Introduction
A disponibilidade de ratinhos geneticamente modificados é uma ferramenta poderosa para identificar os efeitos dos genes específicos que desempenham um papel nos mecanismos de SCI. Laceração SCI é um importante modelo usado para examinar agentes terapêuticos ou moléculas que podem proporcionar um tratamento eficaz seguindo esta lesão 8. Fixação dos processos espinhosos durante a criação da lesão laceração em ratos é imprecisa, devido à dificuldade em apreender os finos e frágeis processos espinhosos envolvidos com a manutenção da fixação da coluna vertebral 5,11. A variabilidade na profundidade da laceração de apenas 0,2 mm (10% do diâmetro da medula espinal do rato) faz com que a interpretação dos dados enganosos. A natureza ea extensão da lesão espinhal laceração cabo deve ser definido com precisão 10. Para responder a este desafio, desenvolvemos uma nova técnica de estabilização consistindo vertebral e utilizadas lâminas fabricadas ligados ao ferimento Louisville Aparelho Sistema (LISA) para produzir uma laceração SCI 7,14. Esta lesão foi criado usando uma lâmina afiada oscilante que evitou a deformação dos tecidos durante o processo de laceração. A profundidade da laceração foi precisa com uma precisão de 0,01 milímetros, utilizando micro-drivers que controlam a profundidade laceração. As lâminas de corte são feitos sob medida para as formas e espessuras específicas para criar o contorno desejado laceração 9. Demonstramos 1) o método de exposição da coluna cervical, 2) a técnica de estabilização vertebral por meio de um dispositivo de fixação faceta bilateral, e 3) a criação de uma lesão laceração cervical usando uma lâmina vibrante.
Protocol
1. Preparação Animal e Aplicação do Stabilizer Spine
A coluna cervical do rato é côncava ventralmente como pode ser visto a partir da visão lateral. Os processos espinhosos de C3 a T1 são pequenos e friável e, por conseguinte, não são adequados para a estabilização vertebral, tal como descrito geralmente 3,4. Recomendamos que a estabilização da coluna ser realizada pela fixação faceta lateral. O dispositivo de fixação é composto de um canal de metal em forma de U para apoiar o mouse e dois braços de aço inoxidável ajustáveis que prenda a cada faceta lateralmente. Isto proporciona um excelente imobilização da vértebra alvo. Após a fixação da coluna vertebral, a coluna vertebral é ligeiramente elevada para achatar a curvatura da coluna vertebral cervical, para proporcionar uma melhor exposição da medula espinhal.
- Esterilizar os seguintes instrumentos cirúrgicos: 2-3 pares de fórceps, 2 pares de microtesoura, um porta-30 G agulha de sutura e de agulhas, grampos de pele e clipe aplicador. Desinfetar o estabilizador da coluna. Anesthetize o rato usando um cocktail intraperitoneal de cetamina / xilazina (100 mg / 10 mg / kg). Raspar o cabelo do pescoço do mouse.
- Após a limpeza da pele com uma solução de iodo-povidona e álcool a 70%, mova o mouse sobre a mesa de operação aquecido com uma almofada de aquecimento. Cubra os olhos do animal com pomada oftálmica para evitar a secagem da córnea.
- Após a indução da anestesia (alcançado quando o mouse não responde a uma pitada de cauda), fazer uma incisão de pele na linha média cervical posterior do occipital à gordura subcutânea-pad da coluna cervical inferior. Sob ampliação, realizar uma incisão na linha entre os músculos trapézio em C2 e dividir os músculos capitis Semispinalis. Identificação da almofada de gordura submuscular facilita dissecção na camada correcta.
- Estender a dissecção muscular mediana caudal ao processo espinhoso T2, que serve como um ponto de referência fiável. Cortar os músculos ligados à vértebra T2 e remover a parte cartilaginosa da T2processo espinhoso.
- Dissecar músculos paravertebrais de C2 a T2 por meio da lâmina utilizando um par de micro-tesouras. Dissecção muscular começa ao lado dos processos espinhosos e se estende bilateralmente para as articulações. Separa-se os músculos imediatamente adjacentes aos processos espinhosos e as lâminas (na camada de periósteo) para minimizar o sangramento. Após as facetas laterais estão expostos, coloque o mouse sobre o canal em forma de U do palco LISA.
- Prenda os braços de aço inoxidável sob as facetas expostas bilateralmente. Uma vez que os braços estão no lugar, aperte os parafusos dos braços de aço para imobilizar a coluna vertebral. Isso mantém firme fixação da vértebra alvo e fornece excelente exposição solar. Os braços podem ser ajustados para proporcionar exacta orientação horizontal da coluna.
- Incisão no ligamento amarelo entre C5 e C6 para expor subjacente dura. Entre o espaço interlaminar utilizar uma agulha de 30 G para criar um pequeno durotomy através da qual são colocadas ao microtesouraalargar o durotomy. A medula espinhal está agora preparado para sofrer a lesão laceração controlada.
2. Cervical Laceration Medular Utilizar o dispositivo LISA
- A largura do alargamento da medula espinhal cervical varia em diferentes níveis. Adicione uma lesão de hemi secção dorsal em C5-6, utilizando uma lâmina plana 2,3 milímetros e definir a amplitude de vibração para cobrir toda a largura da medula espinhal. As lâminas são obtidas a partir de belas Ciência Tools Inc. (Foster City, CA) e modificada por laceração espinal medula. Manter a amplitude da oscilação da lâmina em ≥ menos 0,5 mm, como baixos níveis de amplitude diminuirá a facilidade de laceração cabo.
- Posicione o estabilizador da coluna e do rato no palco LISA. A lâmina está ligada à LISA com a sua posição controlada por micro-controladores capazes de três intervalos de movimento. Componentes da LISA e suas funções são descritas na Figura 1.
- Tensão do interruptor de lâmina oscilante em. Sob magnifcação, mova o mouse para que a medula espinal exposta é posicionado diretamente sob a lâmina vibrar.
- Elevar a fase de suporte do rato para a lâmina oscilante. A posição "0" é gravado, quando a lâmina mal toca na veia dorsal da medula espinhal. Meça a profundidade da laceração da medula espinal em relação à posição "0".
- Elevar a posição palco por controle micro-motorista: um giro de 360 ° do botão de micro-controlador eleva o estágio em 0,25 mm. Assim, uma lesão mm hemisection dorsal 0,75 é criado girando o botão de micro-controlador de 3 vezes. A precisão da lesão é de ± 0,01 mm. À medida que a lâmina começa a rasgar a medula espinal, lubrificar o campo cirúrgico com irrigação salina. A profundidade de corte da medula espinal é controlada pelo micro-controlador vertical e é independente da orientação visual.
- Uma vez que a profundidade pré-determinada foi alcançada, ligue o interruptor de vibração off. Idealmente, a lâmina oscilante está posicionada no lgap esion sem evidência de deformação do tecido. Abaixe o palco da lâmina de corte e remover o sangue e soro fisiológico do campo cirúrgico com uso de algodão Q-dicas. Hemostasia ocorre espontaneamente em <1 min.
- Solte o mouse do estabilizador da coluna vertebral. Aproximados dos músculos paravertebrais, utilizando fio de seda 6-0 e fechar a pele ferida com grampos de aço inoxidável Michel.
3. Animal Care
- Via subcutânea injetar um total de 1-2 ml de soro fisiológico para manter a hidratação adequada e coloque o rato na gaiola de recuperação em uma almofada de aquecimento, enquanto recuperar a consciência.
- Fornecer água e comida ad lib suave e administrar analgésicos por 48 horas de pós-operatório. Não há necessidade de cuidados da bexiga após hemisecção dorsal da medula espinhal.
Representative Results
Imobilização da vértebra alvo é de grande importância para gerar lesões precisas da medula espinal do rato. Nosso dispositivo de estabilização da coluna supera as questões anatômicas de processos espinhosos curtos e ventral da lordose da coluna cervical mouse. As vértebras cervicais são bem expostos usando a coluna cervical, estabilizador (Figura 2). Nossa coluna do mouse dispositivo de estabilização é uma técnica confiável para preparar a coluna para os procedimentos da medula espinhal cervical. A profundidade da lesão utilizando a LISA é precisa 0,01 milímetros 6,13. A laceração preciso causa nenhuma contusão na interface lesão / tecido (Figura 3). A precisão da lesão de hemi secção dorsal foi demonstrada em ratinhos C57BL / 6, em um estudo sobre a regeneração axonal, em que um 0,9 milímetros laceração profunda estendida fora do canal central de cada espécime confirmado por secções patológicas da medula espinhal 1. Locomoção de todos esses animais se recuperamed seguindo esta lesão da medula espinhal laceração.
Figura 1. (A) O rato no estabilizador coluna colocada sobre o palco LISA. A lâmina vibratória é direcionado para a medula espinhal para ser dilacerado. Controles de Micro-controlador estão localizados sob o palco e são projetados para posicionar o mouse no local apropriado. O micro-controlador verticais controla a profundidade da lesão, e o botão de controla a inclinação do plano horizontal da coluna vertebral para prevenir a angulação da laceração. O interruptor on-off controla o motor de vibração, e um outro botão ajusta a sua amplitude. (B) A mm dorsal lesão laceração 0,75 hemisection cortar sob arcos laminar intactas.
Figura 2. (A) O estabilizador espinha rato consistindo de um canal em forma de U e dois braços e conectores. O rato é colocado na calha de C utilizado para SCI cervical e na calha T para torácica SCI. (B) A coluna cervical é fixado colocando os braços sob as facetas laterais e, em seguida, os parafusos de bloqueio. A dura-máter é exposta entre as lâminas de C5-6, 7-C6 e C7-T1, sem qualquer remoção de osso.
Figura 3. Quatro lacerações dorsal da medula espinal em profundidades de 0,5, 0,8, 1,1, e 1,4 milímetros observados no plano sagital (cresil-violeta e eosina), que descreve o elevado grau de precisão, utilizando esta técnica.
Discussion
Estabilização vertebral antes da dilaceração lesões na medula espinhal foi obtido por meio da fixação dos processos espinhosos. Tanto a curva lordótica da coluna cervical e fixação dos grampos para os friáveis processos espinhosos cervicais curtas de C3 até T1 no rato evitar estabilização da coluna eficaz. Além disso, o uso de uma lâmina de barbear ou microtesoura utilizado sob controle manual do tecido provoca deformação significativa que cria variabilidade na profundidade da lesão 6. Isso pode levar a uma má interpretação de dados especialmente quando a regeneração axonal de sectores específicos é estudado. Por exemplo, poupados dorsal axónios corticoespinais podem ser mal interpretadas como axónios regenerados se o trato corticoespinhal dorsal não foi completamente cortado transversalmente, no momento da lesão de. Estes problemas podem ser ultrapassados por meio de um dispositivo de estabilização da coluna com fixação para as facetas de um único nível de precisão e a lesão da medula espinal. Além disso, utilizando ahigh freqüência lâmina oscilante produz uma laceração aguda sem esmagar ou contundente da medula espinhal adjacente. Este método tem sido usado para produzir lesões laceração na medula espinhal em ratos 9,12,14, com modificações posteriores para produzir lacerações torácica da medula espinhal em ratos 6. Na presente comunicação, descreve-se o método de criação de lesões cervicais laceração de confiança no mouse.
Na medida em que o diâmetro ântero-posterior da medula espinhal é <2 mm no mouse, profundidades precisas da lesão laceração são vitais para a criação de um modelo experimental confiável. Variabilidade mínima na profundidade da lesão vai alterar significativamente os resultados de experiências que avaliaram a regeneração do axónio, bem como estudos volumétricos e comportamentais. A precisão da profundidade da lesão utilizando este método é de ± 0,01 milímetro porque utilizado elevada precisão de micro-controladores para controlar a posição da lâmina de corte. Este método tem reduzido a inconsistência naherent em outros modelos da criação de uma laceração SCI. Este método é particularmente útil para estudar a regeneração axonal da medula espinhal longo das vias localizadas na metade dorsal da medula espinal, tais como o trato corticoespinhal, o tracto rubroespinal e o tracto ascendente dorsal. Com este método, os feixes de fibras pode ser completamente cortado transversalmente e de forma fiável. A este respeito, os erros de interpretação dos dados são minimizados, melhorando assim a confiabilidade dos relatórios de estudos experimentais sobre SCI.
Em resumo, nós descrevemos uma nova técnica para criar um reprodutível em modelo in vivo de lesão da medula espinhal cervical laceração no mouse. Esta técnica baseia-se na estabilização da coluna pela fixação das facetas do colo do útero e laceração da medula espinhal usando uma lâmina oscilante. Usando esse método em um modelo dorsal torácica da coluna vertebral laceração cabo em ratos 6, demonstramos uma correlação estreita entre a profundidade laceração, histologia erecuperação comportamento. Esta técnica também foi encontrada para ser fiável por vários outros laboratórios 2,12.
Disclosures
- Vários autores (YPZ, XMX, CBS) têm um interesse financeiro na Louisville impacte System, Inc.
- Os autores, Yi Zhang Ping, Lisa BE Shields e Christopher B. Shields, são funcionários da Norton Healthcare, Louisville, KY. Outros autores são empregados pela Indiana University, Indianapolis, IN.
- Os autores não recebem financiamento de qualquer empresa que produz reagentes e instrumentos utilizados neste artigo.
Acknowledgments
O desenvolvimento deste dispositivo foi apoiado pelo LISA Co., Louisville, Kentucky. Reconhecemos também o apoio contínuo de Norton Healthcare, Louisville, KY a CBS, e NIH NS050243, NS052290 e NS059622 para XMX.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice vertebral stabilizer | Louisville Impactor System | Stabilize and expose the cervical vertebra | |
| LISA vibraknife | Louisville Impactor System | Produce the laceration injury of the cervical spinal cord | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15013-12 | Skin and trapezius muscle incision |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15023-10 | Separate muscles from the laminae |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15002-08 | Incision of dura |
| Graefe forceps | Fine Science Tools (USA) | 11154-10 | Retract skin |
| Dumont #7 forceps | Fine Science Tools (USA) | 11274-20 | Muscle retraction (tip modified)(Fig. A) |
| Dumont SS forceps | Fine Science Tools (USA) | 11203-25 | Fixation of vertebra (tip modified )(Fig.B) |
| 30G needle | Becton Dickenson | 305106 | Create a dural opening |
| 6-0 suture | Ethicon | 8806H | Close muscle and fascial layers |
| wound clip | Fine Science Tools (USA) | 12031-07 | Skin closure |
| Tribrom–thanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | 90710-10G | Anesthetic agent |
Louisville Impactor System, Inc, 210 E. Gray St., Suite 1102, Louisville, KY 40202, (502) 629-5510, E-mail: cbshields1@gmail.com Fine Science Tools (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139, (800) 521-2109, E-mail: info@finescience.com Becton Dickenson, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA 07417, (201) 847-6800 Ethicon, Route 22 West, Somerville, NJ 08876 1-877-ETHICON Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA, 63178 (314) 771-5765, E-mail: cssorders@sial.com |
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| Figure A is the modified Dumont #7 forceps; B is the modified Dumont SS forceps. | |||
References
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