Summary
Eine neue Technik, um eine reproduzierbare erstellen
Abstract
Verwendung von genetisch veränderten Mäusen verbessert unser Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen neurologischer Störungen wie einer Verletzung des Rückenmarks (SCI). Freehand manuelle Steuerung verwendet werden, um eine Platzwunde Modell SCI produzieren schafft inkonsistent Verletzungen oft mit einem Schwarm oder Prellung Komponente und damit eine neuartige Technik wurde entwickelt, verbunden. Unser Modell der zervikalen Platzwunde SCI hat inhärenten Schwierigkeiten mit dem Freihand-Methode durch den Einbau 1) Halswirbelkörper Stabilisierung von Wirbelkörpern Facette Fixierung, 2) verbesserte Rückenmark Belichtung gelöst, und 3) die Schaffung eines reproduzierbaren Platzwunde des Rückenmarks mit einer oszillierenden Klinge mit eine Genauigkeit von ± 0,01 mm in der Tiefe ohne zugehörige Prellung. Im Vergleich zu den Standard-Methoden der Schaffung eines SCI Platzwunde wie Freihand-Einsatz eines Skalpells oder einer Schere, hat unsere Methode eine konsistente Läsion produziert. Diese Methode ist für die Untersuchung von axonalen Regeneration corticosp nützlichKomb rubrospinalen und dorsal aufsteigenden Bahnen.
Introduction
Die Verfügbarkeit von genetisch veränderten Mäusen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Auswirkungen von spezifischen Genen, die eine Rolle spielen, in die Mechanismen der SCI identifizieren. Laceration SCI ist ein wichtiges Modell verwendet werden, um therapeutische Mittel oder Moleküle, die eine wirksame Behandlung nach dieser Verletzung 8. Mai bieten untersuchen. Fixation der Dornfortsätze bei der Erstellung der Platzwunde Verletzungen bei Mäusen ist ungenau wegen der Schwierigkeit die dünn und zerbrechlich Dornfortsätze mit der Aufrechterhaltung Wirbelsäulenfixierungssystem 5,11 beteiligt. Variabilität in der Tiefe der Zerstörung von nur 0,2 mm (10% des Durchmessers der Maus Rückenmark) verursacht Fehlinterpretation von Daten. Die Art und das Ausmaß des Rückenmarks Platzwunde Läsion muss genau definiert werden 10. Um dieser Herausforderung zu begegnen, haben wir eine neue Technik, bestehend aus Wirbelkörper Stabilisierung entwickelt und hergestellt Klingen an der Louisville Verletzungssystem Vorrichtung (LISA), um eine Platzwunde SCI 7,14. Diese Verletzung wurde unter Verwendung einer scharfen Klinge, die oszillierende Gewebedeformation während der Zerstörung Prozess vermieden erstellt. Die Tiefe der Platzwunde war präzise mit einer Genauigkeit von 0,01 mm mit Mikro-Treiber, die die Platzwunde Tiefe zu steuern. Trennscheiben sind auf die spezifischen Formen und Breiten nach Maß zu schaffen, die gewünschte Kontur 9 Platzwunde. Wir zeigen, 1) die Methode der Halswirbelsäule Exposition, 2) die Technik der Wirbelkörper Stabilisierung mit einem Fixateur bilateralen Facette, und 3) die Schaffung eines zervikalen Platzwunde Verletzungen mit einem vibrierenden Klinge.
Protocol
1. Tier Vorbereitung und Anwendung des Spine Stabilizer
Die Maus Halswirbelsäule konkaven ventral als aus der Seitenansicht zu sehen. Die Dornfortsätze von C3 bis T1 sind klein und spröde und sind daher nicht für den vertebralen Stabilisierung geeignet, wie sie üblicherweise 3,4 beschrieben. Wir empfehlen, dass Wirbelsäule Stabilisierung durch lateralen Facette Fixierung durchgeführt werden. Fixier-Vorrichtung besteht aus einem U-förmigen Metall-Kanal, um die Maus und zwei verstellbare Edelstahl Arme, die jeder Facette seitlich klemmen unterstützen. Dies bietet eine hervorragende Fixierung der Soll-Wirbel. Nach spinalen Befestigung wird die Wirbelsäule leicht angehoben, um die Halswirbelsäule Krümmung abflacht bessere Belichtung des Rückenmarks bereitzustellen.
- Sterilisieren Sie die folgenden chirurgischen Instrumenten: 2-3 Pinzetten, 2 Paar Mikroschere, einer 30 G Nadel, Faden und Nadel-Halter, Haut Clips und Clip-Applikator. Desinfizieren Sie die Wirbelsäule Stabilisator. Anesthetize Sie die Maus über eine intraperitoneale Cocktail von Ketamin / Xylazin (100 mg / 10 mg / kg). Rasur der Haare von der Maus den Hals.
- Nach Reinigung der Haut mit einem PVP-Jod-Lösung und 70% Alkohol, bewegen Sie die Maus auf den OP-Tisch mit einem Heizkissen erwärmt. Titelbild des Tieres Augen mit Augensalbe, um Hornhaut Austrocknen zu verhindern.
- Nach Einleitung der Narkose (dann erreicht, wenn die Maus nicht zu einem Schwanz Prise reagieren), einen hinteren zervikalen Mittellinie Hautschnitt aus dem Hinterkopf zum subkutanen Fett-Pad der unteren Halswirbelsäule. Unter Vergrößerung, führen Sie einen Einschnitt an der Mittellinie zwischen den Trapezius an C2 und spalten die semispinalis capitis Muskeln. Bezeichnung des submuscular Fettpolster erleichtert Präparation in der richtigen Schicht.
- Verlängern Sie die Mittellinie Muskel Dissektion kaudal der T2 Dornfortsatz, die als zuverlässige Wahrzeichen dient. Schneiden Sie die Muskeln an der T2 Wirbel und entfernen Sie die knorpeligen Teil der T2Dornfortsatz.
- Sezieren die paraspinalen Muskeln aus der C2 durch die T2 Plättchen mit einem Paar von Mikro-Schere. Muscle Dissektion beginnt angrenzend an den Dornfortsätzen und sich bilateral die Facettengelenke. Trennen der Muskeln unmittelbar angrenzend an den Dornfortsätzen und Schichten (in der Periostschicht), um die Blutung zu minimieren. Nachdem die seitlichen Facetten ausgesetzt sind, platzieren Sie den Mauszeiger auf dem U-förmigen Kanal des LISA Bühne.
- Bringen Sie die Edelstahl Armen unter den exponierten Flächen bilateral. Sobald die Arme an ihrem Platz sind, ziehen Sie die Flügelschrauben der Stahl Arme, um die Wirbelsäule zu fixieren. Dies hält feste Fixierung des Ziels Wirbel und bietet gute Belichtung. Die Arme können eingestellt werden, um genaue horizontale Ausrichtung der Wirbelsäule bereitzustellen.
- Inzision des Lig. flavum zwischen C5 und C6 zu entlarven zugrunde liegenden Dura. Zwischen dem interlaminarer Raum, verwenden Sie eine 30 G Nadel eine kleine Durotomie durch die Mikroschere platziert werden erstellenverlängern die Durotomie. Das Rückenmark ist jetzt bereit, um die kontrollierte Platzwunde Läsion zu unterziehen.
2. Cervical Spinal Cord Laceration Mit dem LISA Gerät
- Die Breite des zervikalen Rückenmarks Erweiterung variiert auf verschiedenen Ebenen. Machen Sie eine Rückenflosse Hemisektion Läsion an C5-6 mit einem 2,3 mm flachen Klinge und die Amplitude der Schwingung auf die gesamte Breite des Rückenmarks zu decken. Die Klingen sind aus Fine Science Tools Inc. (Foster City, CA) erhalten und modifiziert für Rückenmark Platzwunde. Pflegen der Amplitude der Schwingung der Klinge bei ≥ 0,5 mm, wie geringere Amplitude Ebenen wird die Leichtigkeit der Schnur Zerstörung verringern.
- Positionieren Sie die Wirbelsäule Stabilisator und Maus auf dem LISA Bühne. Die Klinge ist mit dem LISA mit seiner Position durch Mikro-Treiber in der Lage drei Bereiche der Bewegung gesteuert angebracht. Komponenten der LISA und deren Funktionen sind in Abbildung 1 beschrieben.
- Macht die Klinge schwingenden einschalten. Unter magnification, bewegen Sie die Maus so, dass der freiliegende Rückenmark befindet sich direkt unter der vibrierenden Klinge positioniert.
- Elevate die Bühne Unterstützung der Maus in Richtung der schwingenden Klinge. Die "0"-Position wird aufgezeichnet, wenn die Klinge berührt kaum den Dorsalvene des Rückenmarks. Messen Sie die Tiefe des Rückenmarks Platzwunde relativ zur Position "0".
- Elevate die Bühne Position durch Mikro-Fahrer die Kontrolle: eine 360 ° Drehung des Mikro-Treiber Regler hebt die Bühne von 0,25 mm. Somit wird eine 0,75 mm dorsal Hemisektion Läsion durch Drehen der Mikro-Treiber Knopf 3 mal erstellt. Die Genauigkeit der Läsion beträgt ± 0,01 mm. Wie das Blatt beginnt sich das Rückenmark zerfleischen, schmieren die OP-Feld mit Kochsalzlösung Bewässerung. Die Schnitttiefe des Rückenmarks durch die vertikale Mikro-Treiber gesteuert und unabhängig von optischen Führung.
- Sobald die vorgegebene Tiefe erreicht ist, schalten Sie den Vibrationsalarm ausschalten. Idealerweise wird die oszillierende Klinge in der l positioniertesion Lücke ohne Nachweis von Gewebe Verformung. Senken Sie die Etappe von der Schneide und entfernen Sie das Blut und Kochsalzlösung aus dem OP-Feld mit Baumwolle Q-Tipps. Hämostase tritt spontan in <1 min.
- Lassen Sie die Maustaste von der Wirbelsäule Stabilisator. Ungefähre die paraspinalen Muskeln mit 6-0 Seidenfaden und schließen die Haut gewickelt mit Edelstahl-Michel Clips.
3. Animal Care
- Subkutan injizieren insgesamt 1-2 ml Kochsalzlösung auf eine ausreichende Flüssigkeitszufuhr zu halten und die Maus in die Erholung Käfig auf einem Heizkissen während das Bewusstsein wiedererlangt.
- Geben Sie Wasser und weiche Nahrung ad lib und verwalten Analgetika für 48 Stunden postoperativ. Es besteht keine Notwendigkeit für Blase Versorgung nach dorsal Hemisektion des Rückenmarks.
Representative Results
Immobilisierung der Ziel-Wirbel ist von großer Bedeutung bei der Erzeugung präziser Läsionen des Rückenmark der Maus. Unsere Wirbelsäule Stabilisierung Gerät überwindet die anatomische Fragen der kurzen Dornfortsätze und ventralen Lordose der Maus Halswirbelsäule. Die Halswirbel sind gut belichtet mit unserem Halswirbelsäule Stabilisator (Abbildung 2). Unsere Maus Wirbelsäule stabilisierenden Gerät ist eine zuverlässige Technik, um die Wirbelsäule für zervikalen Rückenmarks Verfahren vorzubereiten. Die Tiefe der Läsion mit Hilfe der LISA ist auf 0,01 mm 6,13. Die genaue Platzwunde verursacht keine Prellung an der Läsion / Gewebe-Grenzfläche (Abbildung 3). Die Genauigkeit der dorsalen hemisection Läsionen in C57BL / 6 Mäusen in einer Studie über Axonregeneration in dem ein 0,9 mm tiefen Riss nur über den zentralen Kanal in jeder Probe durch pathologische Abschnitte des Rückenmarks 1 bestätigt verlängert gezeigt. Locomotion all dieser Tiere erholened nach diesem Rückenmark Platzwunde Verletzungen.
Abbildung 1. (A) Die Maus in der Wirbelsäule Stabilisator an der LISA Bühne platziert. Die vibrierende Klinge in Richtung des Rückenmarks zu zerrissen werden gerichtet. Micro-driver-Steuerelemente werden unter der Bühne und sind entworfen, um die Maus in die entsprechende Website zu positionieren. Die vertikale Mikro-Treiber steuert die Läsion Tiefe und die Neigung Regler steuert die horizontale Ebene des Rückenmarks zu Angulation des Platzwunde zu verhindern. Der Ein-Aus-Schalter steuert die Vibration des Motors, und ein weiterer Regler steuert seine Amplitude. (B) A 0,75 mm dorsal Hemisektion Platzwunde Läsion unterhalb intakt laminaren Bögen geschnitten.
Abbildung 2. (A) Die Maus Wirbelsäule Stabilisator, bestehend aus einem U-förmigen Kanal und zwei Arme und Steckverbinder. Die Maus wird in der C-Trog für Hals-SCI verwendet und in der T Trog für Thorax-SCI platziert. (B) Die Halswirbelsäule, indem sie die Arme unter den seitlichen Facetten und dann Verriegelung der Flügelschrauben fixiert ist. Die Dura zwischen den Lamellen von C5-6, C6-7, und C7-T1 ohne Entfernung von Knochen ausgesetzt.
3. Vier dorsalen Rückenmark Verletzungen in einer Tiefe von 0,5, 0,8, 1,1 und 1,4 mm in der sagittalen Ansicht (Kresyl-Violett und Eosin-Färbung) beobachtet, welches die hohe Genauigkeit mit dieser Technik.
Discussion
Vertebralen Stabilisierung vor Zerstörung Verletzungen des Rückenmarks durch Fixierung der Dornfortsätze erhalten. Sowohl die Halswirbelsäule Lordosierung und Befestigung von Klammern an den brüchigen kurzen Gebärmutterhals Dornfortsätze von C3 bis T1 in der Maus zu verhindern effektive Wirbelsäulenstabilisationssystem. Darüber hinaus von einer Rasierklinge oder Mikroschere unter manueller Steuerung verursacht erhebliche Gewebedeformation die Variabilität erzeugt in der Tiefe der Läsion 6 verwendet verwenden. Dies kann zu einer Fehlinterpretation von Daten besonders wenn axonale Regeneration der besonderen Fachrichtungen untersucht wird führen. Zum Beispiel kann verschont dorsal corticospinal Axone als regenerierte Axone fehlinterpretiert werden, wenn der Rücken corticospinal Trakt nicht vollständig zum Zeitpunkt der Läsion durchtrennt. Diese Herausforderungen kann durch Verwendung eines Wirbelsäulenstabilisationssystem Vorrichtung mit Fixierung an der Facetten in einer einzigen Höhe und präzise Läsion des Rückenmarks überwunden werden. Zusätzlich mit ahoch Frequenz oszillierenden Klinge erzeugt ein scharfes Platzwunde ohne Quetschen oder contusing die benachbarte Rückenmark. Dieses Verfahren wurde verwendet, um Verletzungen des Rückenmarks Zerstörung in Ratten 9,12,14 erzeugen, mit folgenden Modifikationen thorakalen Rückenmark Verletzungen bei Mäusen 6 zu erzeugen. In der vorliegenden Mitteilung beschreiben wir die Methode zur Erstellung von zuverlässigen zervikalen Läsionen Platzwunde in der Maus.
Soweit der ap-Durchmesser des Rückenmarks ist <2 mm in der Maus, sind präzise Tiefen der Zerstörung Läsion wichtig bei der Schaffung einer zuverlässigen experimentellen Modell. Minimal Variabilität in der Läsionstiefe erheblich verändern Ergebnisse von Experimenten, die Beurteilung Axonregeneration sowie Volumen-und Verhaltensstudien. Die Genauigkeit der Läsionstiefe mit dieser Methode beträgt ± 0,01 mm, weil wir hochpräzise Mikro-Treiber verwendet werden, um die Position der Klinge zu steuern. Diese Methode hat den Widerspruch in reduziertrente in anderen Modellen der Schaffung einer Platzwunde SCI. Diese Methode ist besonders nützlich bei der Untersuchung axonalen Regeneration des Rückenmarks lange Wege in der dorsalen Hälfte des Rückenmarks, wie die corticospinal Trakt, der rubrospinalen Darm-Trakt und der Rückenflosse aufsteigenden Darm-Trakt. Mit dieser Methode können diese Nervenbahnen vollständig und zuverlässig durchtrennt. In dieser Hinsicht werden die Fehler der Interpretation der Daten minimiert, wodurch die Zuverlässigkeit der Berichterstattung über experimentelle Untersuchungen auf SCI.
Zusammenfassend haben wir eine neue Technik, um eine reproduzierbare in vivo-Modell des zervikalen Rückenmarks Platzwunde Verletzungen in der Maus erstellen beschrieben. Diese Technik basiert auf der Wirbelsäule Stabilisierung durch Fixierung der zervikalen Facetten und Zerstörung des Rückenmarks mit einem oszillierenden Klinge basiert. Mit dieser Methode in einer dorsalen thorakalen Rückenmarkes Platzwunde Modell bei Mäusen 6 zeigten wir eine enge Korrelation zwischen der Tiefe Platzwunde, Histologie undVerhalten Erholung. Eine solche Technik wurde auch festgestellt, dass von mehreren anderen Laboratorien 2,12 zuverlässig.
Disclosures
- Mehrere Autoren (YPZ, XMX, CBS) haben ein finanzielles Interesse an der Louisville Impaktor System, Inc.
- Die Autoren, Yi Ping Zhang, Lisa BE Shields und Christopher B. Shields, sind Mitarbeiter von Norton Healthcare, Louisville, KY. Andere Autoren sind von der Indiana University, Indianapolis, IN beschäftigt.
- Die Autoren haben keine Mittel aus einem Unternehmen, das Reagenzien und Instrumente in diesem Artikel verwendet zu produzieren.
Acknowledgments
Die Entwicklung dieses Geräts wurde von der LISA Co., Louisville, Kentucky unterstützt. Wir erkennen auch die laufende Unterstützung von Norton Healthcare, Louisville, KY zu CBS, und NIH NS050243, NS052290 und NS059622 zu XMX.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice vertebral stabilizer | Louisville Impactor System | Stabilize and expose the cervical vertebra | |
| LISA vibraknife | Louisville Impactor System | Produce the laceration injury of the cervical spinal cord | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15013-12 | Skin and trapezius muscle incision |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15023-10 | Separate muscles from the laminae |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15002-08 | Incision of dura |
| Graefe forceps | Fine Science Tools (USA) | 11154-10 | Retract skin |
| Dumont #7 forceps | Fine Science Tools (USA) | 11274-20 | Muscle retraction (tip modified)(Fig. A) |
| Dumont SS forceps | Fine Science Tools (USA) | 11203-25 | Fixation of vertebra (tip modified )(Fig.B) |
| 30G needle | Becton Dickenson | 305106 | Create a dural opening |
| 6-0 suture | Ethicon | 8806H | Close muscle and fascial layers |
| wound clip | Fine Science Tools (USA) | 12031-07 | Skin closure |
| Tribrom–thanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | 90710-10G | Anesthetic agent |
Louisville Impactor System, Inc, 210 E. Gray St., Suite 1102, Louisville, KY 40202, (502) 629-5510, E-mail: cbshields1@gmail.com Fine Science Tools (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139, (800) 521-2109, E-mail: info@finescience.com Becton Dickenson, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA 07417, (201) 847-6800 Ethicon, Route 22 West, Somerville, NJ 08876 1-877-ETHICON Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA, 63178 (314) 771-5765, E-mail: cssorders@sial.com |
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| Figure A is the modified Dumont #7 forceps; B is the modified Dumont SS forceps. | |||
References
- Blackmore, M., Letourneau, P. C. Changes within maturing neurons limit axonal regeneration in the developing spinal cord. J. Neurobiol. 66 (4), 348 (2006).
- Blackmore, M. G., et al. Kruppel-like Factor 7 engineered for transcriptional activation promotes axon regeneration in the adult corticospinal tract. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109 (19), 7517 (2012).
- Carbajal, K. S., et al. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Duhamel, G. Mouse lumbar and cervical spinal cord blood flow measurements by arterial spin labeling: sensitivity optimization and first application. Magn. Reson. Med. 62 (2), 430 (2009).
- Hermanns, S., Reiprich, P., Muller, H. W. A reliable method to reduce collagen scar formation in the lesioned rat spinal cord. J. Neurosci. Methods. 110 (1-2), 141 (2001).
- Hill, R. L. Anatomic and functional outcomes following a precise, graded, dorsal laceration spinal cord injury in C57BL/6 mice. J. Neurotrauma. 26 (1), 1 (2009).
- Iannotti, C. Dural repair reduces connective tissue scar invasion and cystic cavity formation after acute spinal cord laceration injury in adult rats. J. Neurotrauma. 23 (6), 853 (2006).
- Inman, D., Guth, L., Steward, O. Genetic influences on secondary degeneration and wound healing following spinal cord injury in various strains of mice. J. Comp Neurol. 451 (3), 225 (2002).
- Onifer, S. M., et al. Adult rat forelimb dysfunction after dorsal cervical spinal cord injury. Exp. Neurol. 192 (1), 25 (2005).
- Ramer, M. S., Harper, G. P., Bradbury, E. J. Progress in spinal cord research - a refined strategy for the International Spinal Research Trust. Spinal Cord. 38 (8), 449 (2000).
- Seitz, A., Aglow, E., Heber-Katz, E. Recovery from spinal cord injury: a new transection model in the C57Bl/6 mouse. J. Neurosci. Res. 67 (3), 337 (2002).
- Sivasankaran, R., et al. PKC mediates inhibitory effects of myelin and chondroitin sulfate proteoglycans on axonal regeneration. Nat. Neurosci. 7 (3), 261 (2004).
- Yu, P., et al. Inhibitor of DNA binding 2 promotes sensory axonal growth after SCI. Exp. Neurol. 231 (1), 38 (2011).
- Zhang, Y. P. Dural closure, cord approximation, and clot removal: enhancement of tissue sparing in a novel laceration spinal cord injury model. J. Neurosurg. 100, 343 (2004).
