棕榈酸与蛋白质的可逆加成是一个重要的调节细胞内蛋白质的活动。许多突触蛋白被棕榈酰化的神经元中,这是一个特别令人感兴趣。我们利用一个简单的检测棕榈酰化蛋白在培养的神经元,这可适于多种细胞类型和组织的生化方法。
棕榈酰化是转译后的脂质变形例涉及的附件通过不稳定的硫酯键的底物蛋白质的半胱氨酸残基的16 -碳饱和脂肪酸,棕榈酸,[1]评论中。棕榈酰化的基板蛋白增加其疏水性,通常有利于其贩运朝向细胞膜。最近的研究表明棕榈是最常见的脂质修改,神经元1,2,,棕榈营业额是一个重要的机制,这些细胞的蛋白质调控的针对性和贩运。因此,更好地识别和检测的棕榈酰化基体的我们的理解贩卖的蛋白质在神经元。
蛋白质棕榈酰化在过去已检测技术上的阻碍,由于缺乏底物蛋白序列之间的共识,并依赖代谢labeling的棕榈酰蛋白与3 H-棕榈酸酯,一个耗时的生化检测灵敏度低。酰基-生物素交易所(ABE)检测使开发更快速和高灵敏度检测的棕榈酰化蛋白质2-4,是最优的,用于测量对神经元的蛋白质,棕榈酸的动态营业额。的ABE测定是由三种生化状态的步骤( 图1):1)不可逆封锁未修改的半胱氨酸的硫醇基团的使用N-ethylmaliemide(NEM),2)的特异性裂解和去掩蔽的棕榈酰化的半胱氨酸的硫醇基羟胺(HAM),和3)选择性标记的棕榈酰化的半胱氨酸,使用巯基反应的生物素化试剂,生物素-BMCC。 ABE步骤巯基的生物素化蛋白的纯化不同,这取决于实验的总体目标。
在这里,我们描述了一种方法,棕榈酰化蛋白的纯化主要海马由初始免疫沉淀法(IP)的步骤中使用的蛋白质,随后由ABE法和免疫印迹,以直接测量棕榈酰化,蛋白质的水平,这被称为IP-ABE检测抗体,该抗体针对的人神经元。低密度培养的胚胎大鼠海马神经元已被广泛用于研究的神经元蛋白的定位,功能和贩运,因此非常适合使用IP-ABE分析,为研究神经元蛋白棕榈酰化。的IP-ABE检测主要是要求标准的IP和蛋白质印迹试剂,并且仅受限于目标衬底的可用性抗。此法可以很容易地适用于在异源细胞培养,主要来自不同的小鼠和大鼠脑组织神经细胞,甚至是主要的脑组织本身的转棕榈酰化蛋白的纯化和检测。
IP-ABE分析这里介绍的是一个简单的和高度敏感的检测棕榈酰化蛋白在原代培养海马神经元的方法,主要使用标准生物化学技术。这使得检测实验室已经配备了免疫印迹材料很容易适应。的IP-ABE测定结合了标准的免疫沉淀的协议来隔离和固定的靶蛋白,随后由先前描述的ABE化学2-4棕榈酸对底物蛋白的快速检测水平。 ABE技术具有广泛的应用范围,用于检查棕榈酰化蛋白在各种组织和细胞系,包括大型的棕榈酰-蛋白质组学筛选全球棕榈酰化公司,和棕榈酰化水平的一个单一的靶蛋白的快速检测。
此前的描述ABE化学利用不同的方法,细胞裂解液和洗涤剂提取的神经PROTEINS 2,9,游离硫醇封锁10,11,生物素化,并纯化目标蛋白4,根据应用程序的实验。添加棕榈酸神经元蛋白向细胞膜,在其定位和检测靶蛋白的的棕榈酰化馏分的结果,将需要从这些膜其提取。此前描述的ABE方法已采用了多种离子9和非离子型去污剂8,以提取所需的目标蛋白,和一个特定的洗涤剂的使用依赖于目标蛋白和它的公知的膜贩运。在这里,我们利用非变性和非离子型洗涤剂的IGEPAL CA-630提取棕榈酰化蛋白质,我们已经证实的棕榈酰化神经元蛋白δ-连环蛋白( 图2)进行提取和检测。 IGEPAL CA-630的结构包括一个笨重和刚性的非极性头部基团不扰乱天然蛋白质的构象或相互作用,但它允许其与膜相关蛋白的疏水区域,从而赋予混溶性并允许其提取。应提取的许多神经元蛋白定位于突触的突触膜或突触后密度,使用IGEPAL CA-630,但是一些可能不完全溶解,并可能需要使用不同的非变性洗涤剂的Triton X-100等,它具有以前用于ABE化学2,8。
ABE化学几个描述信息也利用不同的巯基反应的生物素化试剂分子从我们在这里描述的,称为生物素-HPDP(Thermo Scientific的),这也需要一种不同的蛋白质的纯化手段4。生物素-HPDP是另一个硫醇反应,maliemide的共轭的生物素分子,包含一个二硫键的maliemide连接臂,结构ðifferentiating它从生物素-BMCC,其中不包含此二硫键。巯基-生物素化蛋白质的免费或棕榈酰化半胱氨酸生物素-HPDP之后,在得到的二硫化键的目标蛋白和的生物素基团之间可以通过减少试剂到释放的生物素基团和再生的未改性的形式的蛋白质裂解,使生物素化通过生物素-HPDP短暂的,可逆的。因此,通过使用该生物素化试剂需要纯化靶蛋白的固定化的抗生物素蛋白的试剂,如链霉亲和素包被的磁珠。然而,硫醇 – 生物素化靶蛋白的生物素-BMCC,在这里,我们描述的,是稳定的和相对较永久,需要净化的靶蛋白的抗体,该抗体针对的目标,并固定在琼脂糖珠。两个ABE技术此前已用于大型屏幕,和棕榈单一蛋白质2,8-10,12的检测,和IP-ABE的分析,我们在这里描述的是最快速检测单个神经元的靶蛋白的棕榈。
绝大多数的细胞棕榈涉及可逆的棕榈半胱氨酸的巯基(称为S-棕榈,我们概括为“棕榈”,在此协议),但是非常有限的一组蛋白质是不可逆的棕榈甘氨酸和半胱氨酸残基通过形成稳定的酰胺键,称为N-棕榈酰化13。 ABE化学的一个限制是它无法检测N-棕榈酰化,由于酰胺键的稳定性,应确认等棕榈酰化的一种新的目标蛋白的筛选使用3H-棕榈酸代谢标记1。
正如前面所提到的,可以很容易地适应的IP-ABE检测检查棕榈酰化在来自多个源的蛋白提取物中,包括转录sfected异源细胞系中,基层组织,主要从多个脑区的神经细胞。 IP-ABE法已被用于研究突变的半胱氨酸-丝氨酸蛋白的棕榈酰化半胱氨酸找准位置沿靶蛋白8的棕榈充足,基础条件下培养的神经元突触蛋白的研究动态棕榈营业额10,和变化后的神经元蛋白的棕榈酰化水平在诱导的神经元的电活动9。的IP-ABE检测的敏感性和适应性使其非常适合于研究棕榈配置文件的神经元蛋白,最适用于检测动态变化棕榈。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由加拿大卫生研究院的研究MOP-81158的补助金。
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
PMSF | Fluka | 93482 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Roche Complete Mini | 11 836 153 001 | |
NEM | Sigma | E3876 | |
HAM solution | Sigma | 46780-4 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Ensure compatibility with chosen detergent |
Protein G/A-coated sepharose beads | GE Healthcare | 17-6002-35 | |
Biotin-BMCC | Thermo Scientific | 21900 | |
Streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21126 | Reconstitute at 1 mg/ml in water |
Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 21059 |