단백질 palmitate의 치료뿐만 아니라이 세포 내 단백질 인신 매매의 중요한 조절기입니다. 이것은 많은 시냅스 단백질이 palmitoylated 아르 뉴런에 특별한 관심입니다. 우리는 여러 세포 유형과 조직에 적용 할 수 있습니다 교양 뉴런에 palmitoylated 단백질을 감지하는 간단한 생화학 방법을 사용합니다.
Palmitoylation는 불안정한 thioester 결합을 통해 기판 단백질의 시스테인 잔류 물에 16 탄소 포화 지방산, palmitate의 첨부 파일을 포함하는 사후 병진 지질 수정입니다 [1 검토]. 기판 단백질의 Palmitoylation은 소수성을 증가 시키며, 일반적으로 세포의 세포막 대한의 거래를 용이하게한다. 최근 연구는 palmitate의 매출이 세포가 단백질의 타겟팅과 거래를 규제하는이 중요한 메커니즘입니다 제안, 뉴런 1, 2에서 가장 일반적인 지질 수정 중 하나 palmitoylation을 보여 주었다. palmitoylated 기판의 식별 및 탐지 따라서 뉴런의 단백질 인신 매매에 대한 우리의 이해를 발전 할 수 있습니다.
과거에 단백질 palmitoylation의 검출은 기술적으로 인해 기판 단백질 간의 합의 순서의 부족에 방해하고, 신진 대사 labeli에 대한 의존도되었습니다3 H-palmitate, 낮은 감도와 시간이 많이 소요되는 생화학 분석과의 NG palmitoyl – 단백질. 아실-비오틴 거래소 (아베) 분석의 개발은 palmitoylated 단백질을 2-4 빠르고 고감도 검출이 가능하고, neuronal 단백질에 palmitate의 동적 매출을 측정하기위한 최적입니다. 아베 분석은 세 생화학 단계 (그림 1)로 구성되어 있습니다 : 1) 수정되지 않은 시스테인 thiol 그룹의 돌이킬 수없는 봉쇄 N-ethylmaliemide (NEM), 2) 특정 절단 및 히드 록실 아민 (햄)로부터 palmitoylated 시스테인의 thiol 그룹의 unmasking을 사용하고, thiol 반응 biotinylation 시약을 사용하여 palmitoylated 시스테인 3) 선택적 라벨, 비오틴 – BMCC. 아베 단계를 수행 thiol-biotinylated 단백질의 정제는 실험의 전반적인 목표에 따라 다릅니다 있습니다.
여기, 우리는 기본 hippocamp의 관심 palmitoylated 단백질을 정화하는 방법을 설명초기 immunoprecipitation (IP) 아베 분석 및 서부 직접 IP-아베 분석을이라고한다되는 단백질의 palmitoylation 수준을 측정 할 수 blotting 다음 단백질, 대한 감독 항체를 사용하여 단계로 야외 뉴런. 배아 쥐 hippocampal 뉴런의 낮은 밀도 문화가 널리 IP-아베 분석을 사용하여 neuronal 단백질 palmitoylation를 공부에이를 이상적으로 적합하고, 현지화, 기능, 그리고 neuronal 단백질의 인신 매매를 연구하는 데 사용되었습니다. IP-아베 분석은 주로 표준 IP와 서양 blotting 시약을 필요로하며, 대상 기판에 대한 항체의 가용성에 의해 제한됩니다. 이 분석을 쉽게 heterologous 셀 문화, 마우스 및 쥐 모두의 다양한 뇌 조직에서 파생 된 기본 neuronal 문화, 심지어는 주요 뇌 조직 자체 transfected palmitoylated 단백질의 정화 및 검출을위한 적응 할 수 있습니다.
여기에 제시된 IP-아베 분석은 대부분 표준 생화학 기술을 사용하여, 교양 차 hippocampal 뉴런의 palmitoylated 단백질을 검출하기위한 간단하고 매우 민감한 방법입니다. 이 이미 서쪽 blotting 자료를 갖춘 실험실의 분석이 쉽게 적응합니다. IP-아베 분석이 빠른 속도로 기판 단백질에 palmitate의 수준을 감지 할 수 이전에 설명 된 아베 화학 2-4에 이어 사람의 대상 단백질을 분리하고 고정 할 수있는 표준 immunoprecipitation 프로토콜을 결합합니다. 아베 기술은 대규모 palmitoyl – proteomic 글로벌 palmitoylation 프로필 심사하고, 하나의 대상 단백질의 palmitoylation 수준의 급속한 탐지 등의 다양한 조직 및 세포 라인에 palmitoylated 단백질을 검사 용 응용 프로그램의 다양한 있습니다.
아베 화학 이전 설명은 다른 방법 셀 용해와 neuronal 제자의 세제 추출을 활용 한eins, 2, 9, 무료 thiol-길목 10, 11, biotinylation 및 대상 단백질 4 정화는 실험의 응용 프로그램에 따라 다릅니다. 대상 단백질의 palmitoylated 분수의 자신의 세포 멤브레인 대한 타겟팅 및 감지에 neuronal 단백질 결과 palmitate의 추가는 이러한 멤브레인로부터 추출해야합니다. 이전에 설명 된 아베 방법은 원하는 대상 단백질을 추출 할 이온 9 비 이온 세제 8 다양한 활용 한 결과, 특정 세제의 사용은 대상 단백질과 알려진 막 거래에 따라 달라집니다. 여기, 우리는 활용 비 denaturing 및 비 이온 세제 IGEPAL CA-630 우리가 palmitoylated neuronal 단백질 δ-catenin (그림 2)의 추출 및 검출을위한 검증 한 palmitoylated 단백질을 추출 할 수 있습니다.에게 IGEPAL CA-630의 구조는하지 않습니다 부피가 큰과 강성 비 극 헤드 그룹을 포함기본 단백질 형태 나 상호 작용을 방해하지만,이를 통해 그들에게 혼 화성을 부여하고 추출을 허용, 막 관련 단백질의 소수성 영역과의 연결을 허용하는. 시냅스의 신경 막 또는 포스트 시냅스 밀도로 지역화 많은 neuronal 단백질이 IGEPAL CA-630을 사용하여 추출해야하지만 일부는 완전히 solubilize하지 않을 수 있으며,이 트라이 튼 X-100과 같은 다른 비 denaturing 세제의 사용을 요구할 수 있습니다 이전에 아베 화학 2, 8 사용되어.
아베 화학 몇 가지 설명은 또한 단백질 정제 4 다른 수단을 필요로 비오틴 – HPDP (열 과학)라는 우리가 여기서 설명하는 분자,에서 다른 thiol 반응 biotinylation 시약을 활용하고 있습니다. 비오틴 – HPDP는 구조적으로 D, maliemide 링커 암의 이황화 결합을 포함하는 다른 thiol 반응, maliemide – 복합 비오틴 분자입니다이 이황화 결합을 포함하지 않습니다 비오틴 – BMCC,에서 ifferentiating. 비오틴 – HPDP하여 단백질의 무료 또는 palmitoylated 시스테인의 thiol-biotinylation 후, 대상 단백질과 비오틴 그룹 사이의 결과 이황화 결합은 biotinylation를 만드는 비오틴 그룹을 해제하고 수정되지 않은 형태의 단백질을 생성하기 위해 시약을 줄여 흘리고 할 수 있습니다 비오틴 – HPDP 과도하고 치료하여. 이 biotinylation 시약 이러한 streptavidin-코팅 구슬로 고정 아비딘의 시약에 의한 대상 단백질의 정화가 필요에 따라서 사용합니다. 그러나, 비오틴 – BMCC하여 대상 단백질의 thiol-biotinylation, 우리가 설명으로 안정적이고 상대적으로 영구적이며, 항체 대상에 대한 감독과 세 파로스 구슬에 고정하여 대상 단백질의 정화가 필요합니다. 모두 아베 기술은 이전에 대규모 스크린, 단일 단백질 2, 8-10, 12 palmitoylation의 검출에 활용하고, 한우리가 여기서 설명하는 IP-아베 분석은 하나의 neuronal 대상 단백질의 palmitoylation의 급속한 탐지를위한 최적입니다.
세포 palmitoylation의 압도적 인 다수가 cysteines의 thiol 그룹 (우리는이 프로토콜에 'palmitoylation'로 일반화 S-palmitoylation,이라고한다)에 palmitate의 치료 또한을 포함, 단백질의 그러나 매우 제한된 그룹은 글리신에 돌이킬 수없는 palmitoylation를 받게 아르 하고 안정적인 아미드 결합의 형성을 통해 시스테인 잔류 물은 N-palmitoylation 13 칭했다. 아베 화학 중 하나 한계는 아미드 결합의 안정성 N-palmitoylation의 기인을 감지하기위한 수 없다는 것입니다, 그래서 palmitoylation에 대한 새로운 대상 단백질의 심사는 3H-palmitate 신진 대사 라벨 1을 사용 확인해야합니다.
이전에 언급 한 바와 같이, IP-아베 분석을 쉽게 트란 등의 여러 소스에서 단백질 추출물에 palmitoylation을 조사에 적용 할 수heterologous 세포 라인, 기본 조직, 여러 뇌 영역에서 기본 neuronal 문화를 sfected. IP-아베 분석은 기초 조건 10 세 미만 교양 뉴런의 시냅스 단백질의 동적 palmitate 회전율을 검토를 들면, 대상 단백질 여덟 따라 palmitoylated 시스테인의 위치를 식별 할 수있는 변이 시스테인 – 투 – 세린 단백질의 palmitoylation의 자족을 조사에 활용 된 그리고 neuronal 단백질의 palmitoylation 수준의 변화는 neuronal 활동 9 유도에 따라. IP-아베 분석의 감도 및 적응성은 neuronal 단백질의 palmitoylation 프로파일을 검토하고, palmitoylation의 역동적 인 변화를 검출하기위한 최적의하기에 이상적으로 적합합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 건강 연구 청소 – 81,158 캐나다 연구소에서 보조금에 의해 지원되었다.
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
PMSF | Fluka | 93482 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Roche Complete Mini | 11 836 153 001 | |
NEM | Sigma | E3876 | |
HAM solution | Sigma | 46780-4 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Ensure compatibility with chosen detergent |
Protein G/A-coated sepharose beads | GE Healthcare | 17-6002-35 | |
Biotin-BMCC | Thermo Scientific | 21900 | |
Streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21126 | Reconstitute at 1 mg/ml in water |
Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 21059 |