Den reversibla tillägg av palmitat till proteiner är en viktig reglerare av intracellulärt protein människohandel. Detta är av särskilt intresse i neuroner där många synaptiska proteiner palmitoylerad. Vi använder en enkel biokemisk metod för att detektera palmitoylerade proteiner i odlade neuroner, som kan anpassas för flera celltyper och vävnader.
Palmitoylering är en posttranslationell modifiering lipid inbegriper fastsättning av en mättad 16-kol fettsyra, palmitat, till cysteinrester av substratproteiner genom en labil tioesterbindning [granskas 1]. Palmitoylering av ett substrat protein ökar hydrofobicitet, och typiskt underlättar dess handel mot cellmembran. Nyligen genomförda studier har visat palmitoylering är en av de vanligaste lipid ändringar i nervceller 1, 2, vilket tyder på att palmitat omsättningen är en viktig mekanism genom vilken dessa celler reglerar inriktning och handel med proteiner. Identifieringen och detektion av palmitoylerade substrat kan därför bättre vår förståelse av protein handel med nervceller.
Detektion av protein palmitoylering tidigare har tekniskt hindrat på grund av avsaknaden av en konsensussekvens bland substratproteiner och beroendet av metabola labeling av palmitoyl-proteiner med 3 H-palmitat, en tidskrävande biokemisk analys med låg känslighet. Utveckling av acyl-Biotin Exchange (ABE) analys möjliggör snabbare och hög känslighet detektering av palmitoylerade proteiner 2-4, och är optimalt för att mäta dynamiska omsättning palmitat på neuronala proteiner. ABE-analysen består av tre biokemiska steg (Figur 1): 1) irreversibel blockad av omodifierade grupper cysteintiolgrupper med N-ethylmaliemide (NEM), 2) specifika klyvningen och avslöjande av palmitoylerad cystein är tiolgrupp av hydroxylamin (HAM), och 3) selektiv märkning av palmitoylerad cystein med en tiol-reaktiv biotinyleringsreagens, biotin-BMCC. Rening av tiol-biotinylerade proteiner efter de ABE steg har varit olika, beroende på det övergripande målet för försöket.
Här beskriver vi en metod för att rena en palmitoylerad protein av intresse i primär hippocampal neuroner från en initial immunoutfällning (IP) steg med användning av en antikropp riktad mot proteinet, följt av ABE analysen och western blotting för att direkt mäta palmitoylering nivåer av detta protein, som kallas IP-ABE analys. Low-density kulturer av embryonala råtta hippocampus nervceller har i stor utsträckning använts för att studera lokalisering, funktion och smuggling av neuronala proteiner, vilket gör dem idealiska för att studera neuronal protein palmitoylering med IP-ABE analys. IP-ABE analys kräver huvudsakligen vanlig IP och Western Blotting reagens, och begränsas endast av tillgängligheten av antikroppar mot målsubstratet. Denna analys kan enkelt anpassas för rening och detektion av transfekterade palmitoylerade proteiner i heterologa cellkulturer, primära neuronala kulturer härledda från olika hjärnvävnader av både mus och råtta, och även primär hjärnvävnad själv.
IP-ABE analys presenteras här är en enkel och mycket känslig metod för detektering palmitoylerade proteiner i odlade primära hippocampala neuroner, med mestadels biokemiska standardtekniker. Detta gör analysen lätt kan anpassas för laboratorier som redan är utrustade med Western Blotting material. IP-ABE analys kombinerar en vanlig immunoutfällning protokoll för att isolera och immobilisera sin målprotein, följt av tidigare beskrivna ABE kemi 2-4 för att snabbt upptäcka halter av palmitat på ett substrat protein. ABE tekniken har ett brett användningsområde för att pröva palmitoylerade proteiner i olika vävnader och cellinjer, inklusive storskalig palmitoyl-proteomic screening av globala palmitoylering profiler, och snabb detektion av palmitoylering nivåer av ett enda målprotein.
Tidigare beskrivningar av ABE kemi har använt olika metoder för cell-lys och rengöringsmedel utvinning av neuronal proteins 2, 9, fri tiol-blockad 10, 11, biotinylering, och rening av målproteinet 4, beroende på tillämpningen av experimentet. Tillsatsen av palmitat till neuronala proteiner resulterar i deras inriktning mot cellmembran, och detektion av palmitoylerad fraktionen av ett målprotein kommer att kräva dess extraktion från dessa membran. Tidigare beskrivna ABE metoder har utnyttjat en mängd av jonisk 9 och icke-joniska detergenter 8 för att extrahera önskade målproteiner, och användningen av en särskild tvättmedel beror på målproteinet och dess kända membran handel. Här, använder vi den icke-denaturerande och icke-jonisk detergent IGEPAL CA-630 för att extrahera palmitoylerade proteiner som vi har validerats för utvinning och detektering av palmitoylerad neuronala proteinet δ-catenin (figur 2). Strukturen för IGEPAL CA-630 innefattar en skrymmande och styvt, icke-polära huvudgruppen som intestöra nativt protein konformation eller interaktioner, men som gör att dess samband med de hydrofoba regioner membran-associerade proteiner, varigenom ger blandbarhet till dem och tillåter deras utvinning. Många neuronala proteiner lokaliserade till synaptiska membranet eller postsynaptisk densitet av synapser bör extraheras med IGEPAL CA-630, men vissa kan inte fullständigt solubilisera, och kan kräva användning av en annan icke-denaturerande detergenten som Triton X-100, som har tidigare utnyttjats för ABE kemi 2, 8.
Flera beskrivningar av ABE kemi har också utnyttjat en annan tiolreaktiv biotinyleringsreagens från molekylen vi beskriver här kallas Biotin-HPDP (Thermo Scientific), vilket också kräver en annorlunda sätt av proteinrening 4. Biotin-HPDP är en annan tiol-reaktiva, maliemide-konjugerad biotinmolekyl som innehåller en disulfidbindning i den maliemide kopplingsarmen, strukturellt differentiating det från biotin-BMCC, som inte innehåller denna disulfidbindning. Efter tiol-biotinylering av ett protein fria eller palmitoylerad cystein genom biotin-HPDP, kan den resulterande disulfidbindningen mellan målproteinet och biotingruppen klyvas genom reducerande reagens för att frigöra biotingruppen och regenerera proteinet i sin omodifierade form, vilket gör biotinylering av Biotin-HPDP övergående och reversibla. Därför, användning av denna biotinyleringsreagens kräver rening av ett målprotein genom immobiliserat avidin reagens, såsom streptavidinbelagda kulor. Emellertid, tiol-biotinylering av ett målprotein genom biotin-BMCC, eftersom vi beskriver här, är stabil och relativt permanent och kräver rening av målproteinet med en antikropp riktad mot målet, och immobiliseras på Sepharose-pärlor. Båda ABE tekniker har tidigare utnyttjats för storskaliga skärmar och detektering av palmitoylering av enstaka proteiner 2, 8-10, 12, ochIP-ABE analys beskriver vi här är optimal för snabb detektion av palmitoylering av enskilda neuronala målproteiner.
En överväldigande majoritet av cellulär palmitoylering innebär reversibla tillsättning av palmitat till tiolgruppen i cysteiner (benämnd S-palmitoylering, som vi generalisera som "palmitoylering" i detta protokoll), är dock en mycket begränsad grupp av proteiner utsätts för irreversibel palmitoylering på glycin och cysteinrester genom bildningen av stabila amidbindningar, benämnd N-palmitoylering 13. En begränsning för ABE kemi är dess oförmåga att detektera N-palmitoylering grund av stabiliteten av amidbindningen, och så screening av ett nytt målprotein för palmitoylering ska bekräftas med 3H-palmitat metabolisk märkning 1.
Som tidigare nämnts kan IP-ABE analys enkelt anpassas för att undersöka palmitoylering i proteinextrakt från flera källor, inklusive transfected heterologa cellinjer, primära vävnad och primära neuronala kulturer från flera områden i hjärnan. IP-ABE analys har använts för att undersöka palmitoylering tillräckliga muterade cystein-till-serin proteiner för att identifiera platsen för en palmitoylerad cystein längs ett målprotein 8, för att pröva dynamisk palmitat omsättning på synaptiska proteiner i odlade nervceller i basala förhållanden 10, och förändringar i palmitoylering nivåer av neuronala proteiner efter induktion av nervaktivitet 9. Känsligheten och anpassningsförmåga IP-ABE analys gör den idealisk för att undersöka palmitoylering profiler neuronala proteiner och optimala för att upptäcka dynamiska förändringar i palmitoylering.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats med bidrag från kanadensiska Institutes of Health Research MOP-81.158.
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
PMSF | Fluka | 93482 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Roche Complete Mini | 11 836 153 001 | |
NEM | Sigma | E3876 | |
HAM solution | Sigma | 46780-4 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Ensure compatibility with chosen detergent |
Protein G/A-coated sepharose beads | GE Healthcare | 17-6002-35 | |
Biotin-BMCC | Thermo Scientific | 21900 | |
Streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21126 | Reconstitute at 1 mg/ml in water |
Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 21059 |