Summary
الوشم الجلد هو وسيلة فعالة وآمنة لقاح الحمض النووي تسليم intradermally. هنا، يتم تسليم EGFP DNA البلازميد الترميز عن طريق الوشم على الجلد على فأرة الحاسوب المختبر، ويتم تفتيش ثم التعبير عن EGFP في خلايا الجلد عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر.
Abstract
الحمض النووي القائم على التطعيم هو موضوع اهتمام متزايد، وخاصة DNA البلازميد (PDNA) ترميز المستضدات المناعية الهامة. بعد إدارة PDNA هندسيا للقاحات، هو كتب وترجم إلى البروتينات التي يمكن أن مستمنع الحصول على ردود من الجهاز المناعي. وقد تم التحقيق في العديد من الطرق لإيصال اللقاحات DNA، ولكن كل طريق تسليم مزاياه الخاصة والمزالق. الوشم الجلد هو أسلوب الرواية التي هي آمنة، فعالة من حيث التكلفة، ومريحة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للثقوب من جراء إبرة بمثابة مساعد قوية. هنا، ونحن أ) إثبات الدفع من داخل الأدمة ترميز الحمض النووي البلازميد تعزيز الفلورسنت الأخضر البروتين (PCX-EGFP) في نموذج الفأر باستخدام جهاز الوشم وب) تأكيد التعبير الفعال للEGFP في خلايا الجلد باستخدام المجهر متحد البؤر.
Protocol
1. بلازميد الحمض النووي تنقية
- تحويل البلازميد DNA حقيقية النواة ترميز EGFP (PCX-EGFP) في الخلايا القولونية DH5α المختصة. ويمكن أيضا للناقلات الفارغة PCX استخدامها كعنصر تحكم سلبية.
- الثقافة وحصاد الخلايا القولونية DH5α وتنقية PDNA وفقا لكتيب EndoFree QIAGEN تنقية البلازميد.
- مرشح PDNA حل من خلال 0،22 ميكرون تصفية العقيمة PVDF، وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
2. الوشم نظام إعداد
- توصيل الوحدة المحمولة ودواسة التحكم إلى وحدة التزويد بالطاقة في إرشادات الشركة المصنعة.
- تعيين تيرة التذبذب الإبرة إلى ما يقرب من 100 هرتز. للجهاز الوشم اخترنا (نظام الشبح الوشم الروتاري)، يجب تعيين الطلب على إمدادات الطاقة إلى 4 فولت. الرجوع إلى دليل المستخدم أو الدعم الفني لأنظمة الوشم الأخرى.
- تعقيم الإبرة عراي قبل الاستخدام. نوصي باستخدام أحد مجموعة إبرة لكل حيوان. يمكن إعادة استخدامها الإبر بعد تطهيرها بالماء والصابون وتعقيمها.
- تثبيت مجموعة إبرة في يده وحدة وإرفاق فضفاضة قبضة بلاستيكية.
- ضبط عمق الإبرة إلى الإعداد المناسب عن طريق نقل قبضة بلاستيكية أعلى أو لأسفل. كنا على عمق الإبرة حوالي 0.5 مم لدينا تجربة الماوس.
- تشديد قبضة بلاستيكية عندما يتم تعيين بشكل صحيح عمق الإبرة، ونظام الوشم هو جاهز للاستخدام.
3. حلاقة الحيوان
- اختيار موقع لعلاج الوشم. يجب أن يكون الموقع في منطقة شركة نسبيا، شقة، وحمي من الجلد، على سبيل المثال، إلى جانب hindleg الحيوان.
- تخدير ماوس BALB / ج مع خليط من الكيتامين (90 ملغ / كلغ) وزيلازين (5 ملغ / كلغ) وفقا لوزن جسم الحيوان. لحيوانات أخرى، الرجوع إلى المبادئ التوجيهية التخدير من مؤسستكم.
- تحقق منردود الفعل من قبل الحيوان معسر قدم لها للتأكد من الحيوان للتخدير بشكل صحيح.
- استخدام الانتهازي الكهربائية لخفض الشعر في hindlegs الحيوان ببطء وحذر. إزالة الشعر من موقع المخطط والوشم والمنطقة المحيطة بها.
- إزالة الشعر أقصر المتبقية مع الحلاقة سلامة التخلص منها. يجب الحرص على عدم قطع الجلد الحيوان. ملاحظة التي يمكن أن تستخدم كريم مزيل الشعر كطريقة بديلة إزالة الشعر، ولكن، ونحن نفضل كريم الحلاقة على مزيل الشعر.
- إزالة الشعر طائشة قطع من الجلد مع الهواء المضغوط إذا لزم الأمر.
4. تسليم DNA البلازميد بواسطة الوشم
- إذا كان قد تم إنشاء بروتوكول التحصين سابقا، ينبغي أن تحسب الجرعة وحجم حل DNA ليتم تطبيقها وفقا لذلك. نوصي باستخدام وحجم صغير ممكن عمليا لجعل عملية الوشم أكثر قابلية للإدارة. في هذه المظاهرة EGFP، استخدمنا 7،5 ميكرولتر من محلول الحمض النووي في يخدعوحدانية من 0.25 ملغ / مل، والتي تم تطبيقها على منطقة الوشم من حوالي 1 سم 2. التحصين للتجارب، قد يكون مطلوبا تركيزات أعلى PDNA للحث على الاستجابات المناعية قوية 1،2.
- تطبيق حل DNA من قبل pipetting مباشرة على موقع الوشم. بدلا من ذلك، تحميل حل DNA في قبضة بلاستيكية بواسطة pipetting، لذلك تم تعليق السائل بين الإبرة وغيض من قبضة بلاستيكية. الرجوع إلى الفيديو لمظاهرة. وقد لاحظنا يوجد فرق ملحوظ بين الطريقتين. ومع ذلك، قد حل في تحميل قبضة بلاستيكية يكون من المفيد على السطوح العمودية الجلد، على سبيل المثال.
- بدء التذبذب الإبرة ووضع مجموعة الإبرة مع الضغط الخفيف على جلد الحيوان في موقع الوشم. ثم نقل إبرة تتأرجح بلطف وببطء بطريقة خطية لإيصال الحمض النووي البلازميد فوق منطقة الوشم بالكامل. الحفاظ على زاوية 90 درجة بين الإبرة والجلد لتجنبجروح على الجلد.
- مراقبة الجلد. الكشط والتهاب طبيعية. إذا كان النزيف يحدث، ووقف عملية الوشم وتقلل من عمق الإبرة.
- تواصل حركة إبرة لحوالي 1 دقيقة، ثم إيقاف عملية الوشم.
- استخدام مسحة قطنية نظيفة لتطبيق طبقة رقيقة من مسكن موضعي على موقع الوشم. يمكن المسكنات الموضعية مثل كريم سلفاديازين الفضة (SSD كريم) أو مرهم Neosporin تساعد على التخفيف من الألم أو الضيق من الحيوانات، وبالتالي ينصح تطبيقها قبل التخدير يلبس. مراقبة الحيوانات في اليوم التالي بحثا عن علامات على الألم أو الضيق (تغيير من الخمول والمشية). تطبيق كريم مسكن إذا علامات لا تزال قائمة.
5. تأكيد التعبير مستضد
- 48 ساعة بعد العلاج الوشم (لاحظ أن يبني PDNA مختلفة قد تتطلب أوقات مختلفة التعبير)، والموت الرحيم الماوس من الخدر 2 CO. لأخرىالحيوانات، تشير إلى المبادئ التوجيهية القتل الرحيم من مؤسسة الخاصة بك.
- تشريح الجلد في موقع الوشم، وإصلاح الأنسجة في بارافورمالدهيد 4٪ بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
- شطف الأنسجة مع الايثانول 70٪، وتحويلها إلى PBS 1X للتصوير.
- دراسة الأنسجة كله باستخدام مجهر مبائر للتحقق من الإشارات EGFP. بدلا من ذلك، تكون جزءا لا يتجزأ من نسيج الجلد في شمع البارافين ودرست في أقسام تحت المجهر الفلورسنت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويمكن ملاحظة التعبير عن EGFP مع ذروة الإثارة في 488 نانومتر والتي تبلغ 509 ذروة الانبعاثات نانومتر في خلايا الجلد الماوس. من جرعة ميكروغرام من الحمض النووي 1،875، تحتوي على ما يقرب من 3 × 10 17 نسخ من البلازميد، لاحظنا عادة إشارات EGFP 10-20 سم في 1 2 وشم المنطقة. هذا العدد المنخفض نسبيا من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل يتفق مع نتائج دراسة سابقة لمدة 3. التعبير EGFP (الشكل 1) على الأدلة التي تم تسليمها EGFP البلازميد إلى خلايا الجلد الحيوان باستخدام تقنية DNA الوشم.
التعبير EGFP الرقم 1. في خلايا الجلد 48 ساعة بعد العلاج الوشم على hindleg على فأرة الحاسوب BALB / ج عرضها مع المجهر متحد البؤر. أ) إسقاط الإشارات EGFP من الطائرات تنسيق متعددة. B) EGFP التعبير في الغناءجنيه الخلية.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها
1. لم يتم الكشف عن مستضد التعبير (على سبيل المثال لا EGFP إشارات التحكم إيجابية).
- زيادة تركيز الحمض النووي البلازميد حل بنسبة 2 - لأضعاف-5. نوصي تركيز بدءا من 0.2 ملغ / مل. تركيزات تصل إلى 5 ملغ / مل تم الإبلاغ عن الوشم التجارب DNA 3.
- تجنب أضرار جسيمة على الجلد، ويتم قطع الجلد بسهولة الماوس في موقع الوشم من شفرات الحلاقة والإبر.
- تأكد من أن بناء الحمض النووي هو مناسبة لتجربتك.
- أداء الكهربائي للهلام للتأكد من أن غالبية DNA البلازميد هو في شكل دائري أو supercoiled مغلقة.
2. نزيف حاد أو تلف الجلد يحدث في موقع الوشم.
- تقليل عمق الإبرة.
- الحفاظ على زاوية 90 درجة بين مجموعة الإبرة والجلد.
- انخفاض القوة خلال تطبيقالوشم العلاج.
- تقليل سرعة التحرك الوشم.
3. إشارة الخلفية مرتفع جدا عند التصوير EGFP.
- استخدام العلامة التجارية الجديدة الحلاقة سلامة القابل للتصرف لإزالة الشعر قدر الإمكان قبل الوشم. في بعض الأحيان من الضروري أن يحلق مرة أخرى قبل تشريح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويعتبر التطعيم DNA أكثر أمانا من استراتيجيات التطعيم التقليدية لأنها لا تتطلب التلاعب، أو فضح لقاحات ومسببات الأمراض الموهنة الحية أو 4. ومع ذلك، ونتيجة للتطعيم DNA يعتمد اعتمادا كبيرا على طريق التسليم. الجلد هو وفرة في الخلايا مستضد تقديم مثل خلايا لانغرهانس والخلايا الجذعية 1، وبالتالي في موقع مثالي للتحصين من حيث المناعية وسهولة الوصول 5،6. ونتيجة لذلك، داخل الأدمة استراتيجية التطعيم هي واحدة من الخيارات الأكثر شعبية بالنسبة للقاحات الحمض النووي. كما هو مبين في هذا الفيديو، DNA الوشم هو وسيلة بسيطة ولكنها واعدة لإدارة لقاح الحمض النووي intradermally. ومن المثير للاهتمام، يمكن أن الاستجابات الالتهابية الناجمة عن عملية الوشم أيضا بمثابة مساعد 1،2 الطبيعية وقوية. وقد ذكر أن الوشم قد يثير DNA يصل إلى زيادة 100-T أضعاف في خلايا الردود في القرود، بالمقارنة مع خلايا T-الردود في IMM الحيواناتunized عبر الطريق العضلي 7،8. بالمقارنة مع غيرها من طرق التسليم عن طريق الجلد، مثل بندقية الجينات والحمض النووي يحمل العديد من المزايا الوشم. أولا، DNA الوشم لا تتطلب معدات باهظة الثمن والناقلين، أي جزيئات الذهب. وهذا سيكون ميزة كبيرة من حيث توزيع اللقاح، وخاصة بالنسبة للبلدان النامية. ثانيا، من المعروف أن ارتفاع ضغط الهواء يمكن أن يسبب الضرر PDNA بسبب قوة القص، والتي يمكن أن تقلل من مستوى التعبير مستضد. وقد أظهرت دراسة أن الأضرار الوشم DNA أقل من 3٪ من إجمالي 9 PDNA. وأخيرا، يمكن DNA الوشم تغطية مساحة واسعة من الجلد، والتي يمكن أن تثير احتمال أقوى استجابة مناعية. ويمكن أيضا أن تستخدم أجهزة الوشم لتقديم الببتيد / البروتين اللقاحات، ولقد ثبت للحث على الاستجابات المناعية الخلطية والخلية على حد سواء بوساطة-10. ونحن الآن استخدام الجلد الوشم بشكل روتيني في التجارب على الحيوانات لدينا في الحمض النووي يتبع رئيس البروتين دفعة التطعيم بروتوكول (DNA يعبي 3من قبل اثنين من البروتين يعزز على مدى فترة من 16 أسبوعا)، ولقد يسببها الفئران بنجاح في الاستجابات المناعية ضد فيروس نقص المناعة القوية 1-gp120.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر جميع أعضاء مختبر هونغ يان والدكتور دنغ في مكتب المجهري، العلوم الأساسية التعاونية، NYUMC على مساعدتهم وتقديم الدعم التقني. وأيد هذا العمل من خلال منحة التجريبية من مركز جامعة نيويورك للبحوث الإيدز (CFAR، NIH منحة AI027742).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCX-EGFP plasmid DNA | Clontech | ||
| STEALTH Rotary Tattoo System | Worldwide Tattoo Supply | STEALTH-L | |
| Tattoo needles | Worldwide Tattoo Supply | 1207RSB | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| 0.22 μm PVDF sterile filter | Millipore | SLGV013SL | |
| electrical hair trimmer | Commercially available | ||
| disposable safety razors | Commercially available | ||
| Silver Sulfadiazine Cream | Watson | NDC 0591-0810-55 | |
| Ketamine HCL | NDC 0856-2012-01 | ||
| Zylazine Sterile Solution | NADA 139-236 |
References
- Bins, A. D. A rapid and potent DNA vaccination strategy defined by in vivo monitoring of antigen expression. Nat Med. 11, 899-904 (2005).
- Pokorna, D., Rubio, I., Muller, M. DNA-vaccination via tattooing induces stronger humoral and cellular immune responses than intramuscular delivery supported by molecular adjuvants. Genet. Vaccines Ther. 6, 4 (2008).
- van den Berg, J. H. Optimization of intradermal vaccination by DNA tattooing in human skin. Hum. Gene Ther. 20, 181-189 (2009).
- Liu, M. A. DNA vaccines: a review. J. Intern. Med. 253, 402-410 (2003).
- Koide, Y., Nagata, T., Yoshida, A., Uchijima, M. DNA vaccines. Jpn. J. Pharmacol. 83, 167-174 (2000).
- Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
- Verstrepen, B. E. Improved HIV-1 specific T-cell responses by short-interval DNA tattooing as compared to intramuscular immunization in non-human primates. Vaccine. 26, 3346-3351 (2008).
- Potthoff, A. Immunogenicity and efficacy of intradermal tattoo immunization with adenoviral vector vaccines. Vaccine. 27, 2768-2774 (2009).
- Quaak, S. G. DNA tattoo vaccination: effect on plasmid purity and transfection efficiency of different topoisoforms. J. Control Release. 139, 153-159 (2009).
- Pokorna, D. Vaccination with human papillomavirus type 16-derived peptides using a tattoo device. Vaccine. 27, 3519-3529 (2009).
